专利名称：一种筛选治疗神经退行性疾病药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选对治疗神经退行性疾病药物的方法，具体为一种利用原子力显微镜和电化学方法联用，通过分析AFM形貌图和电化学工作曲线图可以很准确、快速、直接、高效地对潜在药物进行筛选和评估的方法。
背景技术：
神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)，又称为神经退化性疾病，是一大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态[1，2]。大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运动，处理感觉信息，并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致[1，2]，随着时间的推移而恶化，以导致功能障碍。神经退行性疾病包括很多，本发明以致病率高的阿尔茨海默症为例进行研究。阿尔茨海默症(Alzheimer，s disease, AD)，亦称老年痴呆，一种发病率几乎与年龄成对数关系的神经退行性疾病，其主要病因可能是病人大脑中淀粉样肽(amyloid β-peptide, Αβ)的分子的自组装失控行为所致[3]。该病症状主要表现为病人记忆下降， 学习，理解和判断等能力不同程度地下降，行为活动发生障碍。目前，虽然有一些药物能够改善阿尔茨海默病的某些症状，例如他克宁，多奈哌齐，石杉碱甲等。但是尚无药物能阻止该病的发生。中国已进入老龄化社会，我国60岁以上人口大约为1. 2亿，占全国总人口的10% 以上。其中80岁以上的人群中大约有20%患有痴呆症。目前，我国阿尔茨海默病患病人数已超过500万，约占全世界患病人数的1/4，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大。到2025年，我国60岁以上人口将占总人口的20%以上。对于人口老龄化越来越严重的中国来说，阿尔茨海默病将成为21世纪威胁我国国民经济和人口健康的最严重疾病之一。因此，寻找快速、高效、稳定的筛选治疗神经退行性疾病药物的方法成为该领域亟待解决的关键性技术问题。现阶段的一些治疗阿尔茨海默病的药物和手段更多的是对已知结果地经验性改进和尝试性推广。没有理论指导的经验性摸索使得这一方面的研究处于一种事倍功半甚至是南辕北辙的尴尬境地。举例来说，瑞典的一些科学家曾经提出通过向人体内注射含有乙型淀粉状蛋白的“活性疫苗”增强免疫系统，或直接注射抗体清除患者脑部堆积的淀粉样斑块和纤维细丝；而是美国的一些科学家则反驳说清除患者脑部堆积的斑块和纤维所产生的中间体(主要是Αβ多肽的寡聚体)比淀粉样斑块和纤维细丝具有更大的细胞毒性to’36]。 由此可见，研究阿尔茨海默病治病机理并有针对性对特定发病过程加以抑制和消解。将对人类最终征服所谓的“老年痴呆症”这一顽症起到至关重要的作用。就阿尔茨海默病而言， Αβ的二聚体的纤维化是一个与Αβ分子寡聚化相互竞争的过程，将二茂铁标记的小分子多肽探针引入近似的目标体系可以针对性地对这类问题给出答案。此外，在其他一些神经退行性疾病，比如帕金森病，道氏病以及疯牛病等均观测到了蛋白质及多肽的非正常聚集。我们推测这些蛋白的纤维化同样是对寡聚化的一种保护性措施。因此我们提出将保护的范围扩大到多数神经退行性疾病范围。
发明内容
本发明提出了通过诱导/抑制蛋白质或者多肽非正常聚集体之间的转化来将某一类可能导致神经退行性疾病的蛋白的细胞毒性降至最低的建议，提供一种高效、稳定、快速的筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，适用于强结合及弱结合体系，可用于对天然产物(如中药)、合成药物及生物工程制药的药物筛选。一种筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，同时利用到原子力显微镜(AFM)与电化学，通过分析AFM形貌图和电化学工作曲线图来对潜在药物进行筛选和评估。原子力显微镜(Atomic force microscope, AFM)是扫描探针显微镜家族的主要成员之一，其横向分辨率为2 3 nm，纵向分辨率为0.5 nm。AFM是通过探针与被测样品之间的微弱相互作用力来获得物质表面形貌的信息。AFM能够在气体、溶液条件下观察生物大分子的结构，获得直观的三维表面信息，并可以达到纳米级分辨率；能够在近生理的环境中对生物样品进行纳米级操纵，对其活性过程进行跟踪观察，因此在生物结构的研究中具有独特的优势。原子力显微镜由于分辨率高，样品制备简便，制样的过程对样品原始形态影响小，能够在生理条件下进行动态研究，成为研究神经退行性疾病发病机制及A β与A β 寡聚体的最有力工具之一。电化学方法由于具有快速，高通量的优势，对于设备和环境的要求较低等优势，因此，近年来电化学分析方法在蛋白与多肽相互作用中得到广泛的应用。电化学方法在研究蛋白与多肽相互作用时，主要是根据蛋白与多肽作用前后氧化还原峰电流的变化，峰电位的移动进行分析研究，对于一些吸收光谱比较弱，或者与蛋白质作用前后光谱变化不明显， 无法用紫外可见、荧光等光谱手段来研究的分子，有可能用直接或者间接电化学方法进行研究，从而获得其他分析方法无法得到的信息。因此，本发明利用这两种方法可以通过对其形貌图变化和电化学工作曲线信号变化来筛选治疗神经退行性疾病的潜在药物。一种筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，其具体步骤如下
1.将A β 42用PBS配成浓度为25uM的溶液放置37°C的恒温水浴中孵化2天，制样用原子力显微镜进行形貌表征，可以得到若干组淀粉样肽(Αβ )的寡聚体和纤维样本体。将0.25 mgA042溶解于220μ L的NaOH (5mM)溶液中，在超声环境中静置1 min， 室温放置lOmin，移至离心管中，在0°C的环境中，进行13000 rpm的高速离心30 min，移取上清液分装至离心管中，放置冰箱零下20°C下储藏备用。储备溶液浓度为250μΜ。使用时加入与NaOH等量等浓度的HCl将其中和成为中性溶液，在用浓度为IOmM 的PBS (ΡΗ=7.4)稀释为浓度为25μΜ的Αβ溶液。放置恒温水浴中孵化2天。用原子力显微镜对其进行表征。2.在1的基础上加载药物，用原子力显微镜对其进行液相原位表征。3.在做1的同时，另作一份1的平行溶液以Fc-KLVFFKKKKKK (浓度为25 μ M)为信标，放入37°C的恒温水浴中孵化，并隔段时间利用电化学方法研究A β的自聚集。4.在3的基础上，加载药物，利用电化学方法研究药物与Aβ自聚体的相互作用。 此时，将环境调节为接近人体生理环境，并在整个过程中进行保持，如将温度控制在人体温度，将PH值调节并保持在7. 4等。本发明提供的AFM与电化学联用筛选治疗神经退行性疾病药物的方法中，使用的 PBS缓冲溶液中，含有一定浓度的氯化钠。本发明提供的AFM与电化学联用筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，整个过程中都模拟的人体近生理条件下的实验结果。如温度为人的体温37°C、整个环境为中性环境 (pH=7. 4)，并含有一定浓度的氯化钠。本发明提供的AFM与电化学联用筛选治疗神经退行性疾病药物的方法中，从未见过利用AFM与电化学方法联用，进行治疗神经退行性疾病药物筛选方面的报道。此种方法可用于对天然产物(如中药)、合成药物及生物工程制药的药物筛选，应用范围比较广。原子力显微镜分辨率高，样品制备简便，制样的过程对样品原始形态影响小，能够在生理条件下进行动态研究，结果形象直观。相比与原位原子力显微镜观测，电化学的方法具有快速，高通量的优势，对于设备和环境的要求较低。有益效果本发明操作简便，所使用的试剂及样品消耗量极少，筛选周期短，在模拟近生理环境下操作，可信度高；另外，两种方法联用，快速、高效、互补，可以相互验证结果的可靠性。
图1为实施例中的某种药物对Αβ球形寡聚体以及原始纤维的消解作用的现场原子力观察图2 Fc-KLVFFK6和Αβ 42的PBS溶液中在不同培养时间下的微分脉冲伏安图； 图3在图2溶液的基础上加入药物之后不同培养时间下的微分脉冲伏安图。
具体实施例方式下面列举具体实施例对本发明进行详细描述。1.将六342用？85配成浓度为25uM的溶液放置37°C的恒温水浴中孵化2天，制样用原子力显微镜进行形貌表征，可以得到如图IOh那样的很多Αβ的寡聚体和纤维。将0.25 mgA042溶解于220 μ L的NaOH (5mM)溶液中，超声1 min，室温放置lOmin， 移至离心管中，在0°C的环境中进行13000 rpm的高速离心，离心时间为30 min，移取上清液分装至离心管中，放置冰箱零下20°C下储藏备用。储备溶液浓度为250μΜ。使用时加入与NaOH等量等浓度的HCl将其中和成为中性溶液，在用浓度为IOmM的PBS (ΡΗ=7. 4)稀释为浓度为25 μ M的A β溶液。放置恒温水浴中孵化2天。2.在1的基础上加载药物，用原子力显微镜对其进行表征可以看到如图1所示的 Αβ寡聚体和纤维细丝，(选择的时间点依次为0h，2h，6h，12h，18h，24 h)。可以看到，随着时间的延长，寡聚体都被逐渐消解掉了。结果证实了此前所选择的药物能够选择性地消除体系中存在的Αβ「Αβ 42球形寡聚体；也验证了所构筑的模型体系的稳定性及闭环锁定原子力扫描初始位置的能力。3.在做1的同时，另作一份1的平行溶液以Fc-KLVFFKKKKKK (浓度为25 μ M)为信标，放入37°C的恒温水浴中孵化，并隔段时间利用电化学方法研究A β的自聚集。如图2所示是在FC-KLVFFK6溶液中加入Αβ 42时，微分脉冲伏安电流随培养时间 (Omin, lOmin, 30min, lh, 1. 5h, 2h, 3h, 4h, 6h, 12h, 16h, 20h, 24h, 28h, 32h, 48h)变化的工作曲线。电化学特征峰的电流随时间呈减小趋势在6 h后达到平衡，这说明溶液中游离的二茂铁小分子探针的浓度由于参与组装而不断下降，直到一段时间之后基本不再变化。4.在3的基础上，加载药物，利用电化学方法研究药物与Aβ自聚体的相互作用。 整个过程是在近生理条件下完成的。图3则是在以上Αβ +FC-KLVFFK6体系达到平衡之后再加入药物的DPV峰电流随时间变化结果，可以看到当药物进入体系以后，随着时间的延长，代表二茂铁的特征峰电流在不断增加。药物分子的特征峰大小变化不明显，但是其峰的中心位置在右移。这一结果证实了药物的加入使得聚集体中的二茂铁探针分子被释放进入溶液体系中。说明了加载的药物能够使A β聚集体消解，很好地验证的原子力显微镜的结果。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
权利要求
1. 一种筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，其特征在于，利用到原子力显微镜 (AFM)与电化学，通过分析AFM形貌图和电化学工作曲线图来对潜在药物进行筛选和评估； 其具体步骤如下①.将Aβ 42用PBS配成浓度为25uM的溶液放置37°C的恒温水浴中孵化2天，制样； 将0.25 11^4 342溶解于22(^1^的妝0!1(51111)溶液中，在超声环境中静置1 min，室温放置lOmin，移至离心管中，在0°C的环境中，进行13000 rpm的高速离心30 min，移取上清液分装至离心管中，放置冰箱零下20°C下储藏备用，储备溶液浓度为250 μ M ；使用时加入与NaOH等量等浓度的HCl将其中和成为中性溶液，在用浓度为IOmM的PBS (ΡΗ=7. 4)稀释为浓度为25 μ M的A β溶液，放置恒温水浴中孵化2天，用原子力显微镜对其进行表征；②.在①的基础上加载药物，用原子力显微镜对其进行液相原位表征；③.在做①的同时，另作一份①中的平行溶液以Fc-KLVFFKKKKKK(浓度为25 μ Μ)为信标，放入37°C的恒温水浴中孵化，并隔段时间利用电化学方法观察研究A β的自聚集；④.在③的基础上，加载药物，利用电化学方法研究药物与Aβ自聚体的相互作用，此时，将环境调节为接近人体生理环境，并在整个过程中进行保持。
全文摘要
一种筛选治疗神经退行性疾病药物的方法，提供一种利用原子力显微镜(AFM)与电化学联用筛选治疗神经退行性疾病药物的新途径，利用原子力显微镜和电化学方法联用，通过对其形貌图变化和电化学工作曲线信号变化来筛选治疗神经退行性疾病的潜在药物。本发明操作简便，试剂及样品消耗量极少，筛选周期短，可以模拟近生理环境下操作，两种方法相互验证结果真实可靠。适用于强结合及弱结合体系，可用于对天然产物(如中药)、合成药物及生物工程制药的药物筛选。
文档编号G01N23/22GK102279201SQ20111010394
公开日2011年12月14日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者刘佳佳, 孙志方, 张瑞洁, 张翼, 彭勇, 戴旋, 苏芳芳 申请人:中南大学