专利名称：抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒及其制备方法，特别是一种抗环瓜氨酸肽抗体定性体外检测试剂盒及制备方法。
背景技术：
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种慢性炎症性、多关节受累的系统性自身免疫性疾病，RA的诊断目前采用1987年美国风湿病协会(ARA)修订的分类标准，其中主要的实验室指标是类风湿因子(RF)。2000年国外首次报道根据聚角蛋白微丝蛋白(Filaggrin)的 cDNA 序列合成了环瓜氨酸肽(Cyclic Citrulinated P印tide，CCP)，以此作为抗原建立酶联免疫吸附试验(ELISA)，并成功地在RA血清中检测出了抗CCP抗体，发现该抗体在RA的诊断中具有较高的敏感性和特异性。中小型医院的类风湿关节炎患者就诊人数量少，检测样品少，检测报告周期长，容易延误患者明确诊断和用药治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒及制备方法，所述的这种一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒及制备方法是采用胶体金渗滤法和层析法原理来检测人血清中的抗环瓜氨酸肽抗体的浓度，解决了现有技术中检测血清中的抗环瓜氨酸肽抗体浓度的时间较长，程序复杂的技术问题。本发明提供了一种抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体体外检测试剂盒，包括检测板、环瓜氨酸肽(CCP)抗原、由重组金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记的胶体金结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。进一步的，所述的检测板由一个塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加环瓜氨酸肽(CCP)抗原。进一步的，所述的检测反应孔为圆形或者其它形状。进一步的，所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的 pH7. 0 7. 5之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1. 0%。进一步的，所述的洗涤液是含有Tween-20的Tris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的 pH7. 0 7. 5之间，Tween-20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0. 05%。进一步的，在每毫升胶体金结合物中，重组金黄色葡萄球菌A蛋白的质量为0. 025 毫克。进一步的，所述的阳性参考品为浓度大于6. ORU/mL的抗CCP抗体。进一步的，所述的阴性参考品为浓度小于6. ORU/mL的抗CCP抗体。本发明还提供了上述的一种抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体体外检测试剂盒的制备方法，包括一个制备检测板的步骤，一个配制环瓜氨酸肽(CCP)抗原溶液的步骤，一个制备胶体金标记的重组金黄色葡萄球菌A蛋白结合物的步骤，一个配制封闭液的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个制备阳性参考品的步骤和一个制备阴性参考品的步骤。本发明的工作原理是本试剂盒采用间接法免疫吸附法原理用以检测人血清中的抗CCP抗体。将CCP抗原包被于硝酸纤维素膜，制成固相抗原，用以捕获人血清中可能存在的抗 CCP抗体。再将SPA标记于胶体金，形成胶体金结合物作为示踪物。如被测人血清中含有抗CCP抗体，则形成固相抗原-抗CCP抗体-胶体金结合物，呈红色斑点反应，其颜色深浅与被测血清中含有的抗CCP抗体的浓度有关，但不呈比例关系。本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体间接捕获法原理及胶体金渗滤或胶体金层析检测技术定性体外检测试剂盒，用以检测人血清中的抗CCP抗体，其中的瓜氨酸肽是有18个多肽组成，无生物毒性。本发明可以用于检测人血清样本中抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体浓度，作为类风湿性关节炎(RA)辅助诊断使用。 采用本发明的试剂盒当天能收到检测报告，检测结果准确而且方便。
图1显示了检测板反应孔中心检测点有红色斑点，为阳性结果。图2显示了检测板反应孔中心检测点无红色斑点，为阴性结果。
具体实施例方式实施例1胶体金制备条件选择1. 1柠檬酸三钠用量选择A组0. 05%氯化金溶液100毫升加入5%柠檬酸三钠2. 0毫升。B组0. 05%氯化金溶液100毫升加入5%柠檬酸三钠1. 5毫升。C组0. 05%氯化金溶液100毫升加入5%柠檬酸三钠1. 0毫升。D组0. 05%氯化金溶液100毫升加入5%柠檬酸三钠0. 5毫升。实验结果波长λ 540 535 530 525 520 510nm。ABS 值:A 组 0. 471 0. 608 0. 791 1. 044 1. 426 1. 063B 组 0.601 0.746 1.093 1.411 0.942 0.711C 组 0.623 0.803 1.318 0.952 0.714 0.635D 组 0.998 1.431 1.091 0.801 0.678 0.600目测胶体金溶液颜色A组橙红色。B组红色。C组红色、D组紫红色。根据比色法胶体金峰值比较及目测观察胶体金溶液颜色，制备40纳米左右的胶体金颗粒，0. 05%氯化金溶液100毫升拟加入5. 0%柠檬酸三钠1. 2毫升。实施例2胶体金结合物制备条件选择2. 1胶体金标记SPA的pH值选择选择胶体金标记SPA的pH值，使用1. 0 %无水碳酸钠溶液调节胶体金标记pH值， 通过检测灵敏度比较胶体金标记SPA的合适pH值范围。实验结果
权利要求
1.一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于包括检测板、环瓜氨酸肽抗原、由胶体金标记的重组金黄色葡萄球菌A蛋白结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。
2.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于所述的检测板包括一个塑料盒底盒，所述的塑料盒底盒中设置有一层吸水层，所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上设置有一个塑料盒面盖，所述的塑料盒面盖面盖中央设置有一个检测反应孔，在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加环瓜氨酸肽抗原。
3.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液，磷酸盐溶液的PH 7. 0 7. 5之间，牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1.0%。
4.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于所述的洗涤液是含有Tween-20的iTris-HCl溶液，Tris-HCl溶液的pH7. 0 7. 5之间，Tween-20 在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0. 05%。
5.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于在每毫升胶体金结合物中，重组金黄色葡萄球菌A蛋白的质量为0. 025毫克。
6.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于所述的阳性参考品为浓度大于6. 0 RU/mL的抗CCP抗体。
7.如权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒，其特征在于所述的阴性参考品为浓度小于6. 0 RU/mL的抗CCP抗体。
8.权利要求1所述的一种抗环瓜氨酸肽抗体体外检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括一个制备检测板的步骤，一个配制环瓜氨酸肽抗原溶液的步骤，一个制备胶体金标记的重组金黄色葡萄球菌A蛋白结合物的步骤，一个配制封闭液的步骤，一个配制洗涤液的步骤，一个制备阳性参考品的步骤和一个制备阴性参考品的步骤。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，提供了一种抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体体外检测试剂盒，包括检测板、环瓜氨酸肽(CCP)抗原、由胶体金标记的重组金黄色葡萄球菌A蛋白结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。本发明还提供了上述的抗CCP抗体体外检测试剂盒的制备方法。本试剂盒采用间接法免疫吸附法原理检测人血清中的抗CCP抗体，将CCP抗原包被于硝酸纤维素膜，制成固相抗原，用以捕获人血清中的抗CCP抗体，再将胶体金标记于SPA，形成胶体金结合物作为示踪物，如被测人血清中含有抗CCP抗体，则形成固相抗原-抗CCP抗体-胶体金结合物，呈红色斑点反应。本发明可应用于类风湿性关节炎的辅助诊断。
文档编号G01N33/532GK102323402SQ20111014235
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者刘颖冰, 刘颖成, 张瑞镐, 朱慧琳, 朱晓敏, 杨杰, 王泉龙 申请人:上海精臻生物科技有限公司