专利名称：丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种丙酮酸激酶2 (PKM2)乙酰化抑制剂及其用途，还涉及检测PKM2K305乙酰化的抗体和检测方法。
背景技术：
肿瘤属于代谢性疾病源自于Otto Warburg在上个世纪30年代提出肿瘤细胞代谢概念，即迅速生长的组织中细胞代谢调节(如胚胎或肿瘤)不同于正常成熟细胞，通过糖酵解或Warburg效应，癌细胞比其他细胞以更高的效率吸收葡萄糖并产生能量和快速生长(Warburg, 1956)。研究显示，正常细胞只有在缺氧的情况下进行糖酵解，而肿瘤细胞即使在不缺氧的情况下也优先进行糖酵解，消耗更多的葡萄糖和产生更多的乳酸，这就是著名的Warburg效应，Warburg先生也因此获得了诺贝尔医学奖。随后医学界开展了广泛的相关研究，越来越多的证据表明细胞代谢在肿瘤的发生和发展中起着非常重要的作用，但是关于 它的分子机制还不清楚，许多方面还值得深入探讨(Mazurek et al. ,2005);更加引人注目的是，在不同种类的原发和转移的肿瘤中FDG PET影像都表现为葡萄糖吸收的增高和代谢的改变，加上细胞信号通路研究的突破和实验手段的创新，尤其是蛋白组学研究手段的大量应用，肿瘤代谢调控的研究重新成为国际研究的热点。有研究发现，许多代谢酶受到乙酰化的调控；后续的功能研究也表明，代谢酶的乙酰化调控在肿瘤发生发展中可能起着重要作用(Choudhary et al. , 2009 ；Zhao et al.,2010)。研究还发现，丙酮酸激酶是糖酵解过程中的关键酶之一，在胚胎组织只表达胚胎型丙酮酸激酶(PKM2)，成年后表达成年型的丙酮酸激酶(PKMl)，但在肿瘤组织又只表达PKM2，而不是PKMl (Mazurek et al.，2005)。最新研究表明，PKM2为一种磷酸化酪氨酸结合蛋白，肿瘤细胞增殖必须通过磷酸化酪氨酸结合来调控PKM2活性(Christofk et al.,2008a ；Christofk et al.，2008b);另外，Myc调控的异构核糖核酸蛋白(HnRNP)可调节PKM的两种剪接体PKMl和PKM2的比例(David et al.，2009)。上述研究表明，PKM2在肿瘤细胞代谢中的重要作用。在所有肿瘤中都表达PKM2 —直是困惑生物学家的热点和难点，特别是关于PKM2的翻译后修饰及其蛋白稳定性国际上未见报道。本发明人的前期研究发现，前列腺癌组织样品中PKM2受到乙酰化的调控；随后进行的功能研究发现乙酰化可能调节代谢酶的活性及其降解；基于PKM2不仅在糖酵解中处于丙酮酸产生的上游，且PKM2存在所有的癌症细胞中而不存在于大多数正常的细胞中，同时对肿瘤细胞的发展又是至关重要的，因此，研究者认为，PKM2是潜在的有前景的癌症治疗的靶标。
发明内容
本发明的目的是提供一种丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂。本发明的进一步目的是提供所述丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂的用途。本发明中，所述的丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂，为抑制PKM2 K305乙酰化的抑制齐U，其特征在于，所述的抑制剂其含有PKM2K305乙酰化及其乙酰化酶和去乙酰化酶。本发明所述的PKM2K305，位于 PKM2 的外显子 8 中(Homo sapiens 270 KIENHEGVRRFDEILEASDGIMVARGDLGIEIPAEKVFLAQKMM 313)，具有如 SEQ ID No. I 的序列；本发明中，所述的去乙酰化酶包括Sirtl、Sirt2、HDAC5、HDAC6、HDAC7，所述的去乙酰化酶，导致PKM2K305的去乙酰化(如图2所示)；本发明中，所述的乙酰化酶选自核受体辅激活因子PCAF，核受体辅活化子P300，组蛋白乙酰基转移酶复合体GCN5或糖结合蛋白(=carbohydrate-binding protein, CBP)所述的乙酰化酶，导致PKM2K305的乙酰化(如图I所示)；本发明中，抑制乙酰化酶降低PKM2K305的乙酰化(如图3所示)。
本发明中，检测了肿瘤组织中的PKM2K305乙酰化表达，检测结果表明，肿瘤组织中的K305乙酰化明显高于癌旁组织。在本发明的一个实施例中，前列腺癌及癌旁组织的乙酰化位点特异K305的乙酰化水平显示，PKM2K305的乙酰化水平在前列腺癌组织中明显高于癌旁组织；结合多年研究结果，通过分子伴侣介导的自噬和抑制PKM2的酶活导致代谢中间产物的积累，从而促进肿瘤的生长；其中，关联研究结果显示，在15例前列腺癌组织和癌旁组织中PKM2 K305的乙酰化水平存在显著性差异(P < O. 05)，在肿瘤组织中的PKM2K305乙酰化水平明显高于癌旁组织(如图5所示)，所述位点的乙酰化水平升高促进肿瘤细胞生长(如表I所示)。表I K305乙酰化/PKM2的比例数据·
X 土 SDpaired sample T test (n-15)
normal tissue0.751士0.371
K305ac/PKM2P=0.004
prostate cancer1.22±0.230本发明的试验结果表明了所述的PKM2可为肿瘤的治疗提供新的靶标，治疗的肿瘤包括前列腺癌；同时，可拓展对肿瘤发生及其Warburg效应的理解。本发明提供了一种丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂，尤其是一种PKM2K305乙酰化的抑制剂，该抑制剂可有效抑制K305的乙酰化；本发明进一步提供一种用于癌症治疗的药物组合物，尤其是针对降低PKM2K305的乙酰化的靶点药物；所述的药物组合物含有安全有效的PKM2乙酰化酶抑制剂和去乙酰化酶或乙酰化酶、以及药学上可接受的载体或赋形剂；其中，所述的载体包括但并不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合；所述的药物组合物应与给药方式相匹配。本发明中，所述的药物组合物可被制成针剂形式，如采用常规方法用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液进行制备；所述的药物组合物也可采用常规方法制成片剂和胶囊等；所述的药物组合物，如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造；其中，活性成分的给药量是治疗有效量，如每天0. I微克/千克体重-约10毫克/千克体重；此外，本发明中所述的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用所述的药物组合物时，是将安全有效量的PKM2乙酰化酶和去乙酰化酶或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中安全有效剂量通常至少约0. I微克/千克体重，且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地安全有效剂量是约O. I微克/千克体重-约100毫克/千克体重；具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，熟练医师在未超出其技能范围的情况下可自行配制。本发明的另一目的是提供检测PKM2 K305乙酰化的抗体和PKM2 K305乙酰化的检测方法；所述的检测PKM2 K305乙酰化的抗体，是检测含有乙酰化位点特异K305的乙酰化抗体，制备K305乙酰化抗体的多肽为acetyl-PKM2 (K305)，(多肽IEIPAEKVFLAQ)，具有如SEQ ID No. 2的序列。检测方法中还包括检测乙酰化位点特异性的抗体-抗K305的乙酰化抗体(图6所示)。本发明中，所述的PKM2 K305乙酰化的检测方法，为检测所述位点的乙酰化水平、以辅助判断所述个体的肿瘤是否处于生长/复发期，包括以下步骤(I)制备乙酰化位点特异K305的乙酰化抗体；(2)抽提组织样品的蛋白质/或制备肿瘤组织石蜡切片； (3)检测肿瘤组织K305乙酰化水平。本发明的检测方法中，制备K305乙酰化抗体的多肽为acetyl-PKM2 (K305)，(多肽IEIPAEKVFLAQ)，具有如 SEQ ID No. 2 的序列；所述检测方法中，检测肿瘤组织K305乙酰化水平的抗体浓度为I : 500;所述检测方法中，涉及的蛋白提取、组织切片、抗体制作和免疫组化等技术均可采用本领域的常规操作方法；本领域的技术人员可按所述的常规操作方法，进行蛋白提取、组织切片、抗体制作和免疫组化。本发明所述的检测方法，可用于对个体的肿瘤进行检测，尤其是对个体的前列腺癌等进行检测。在使用所述的PKM2K305乙酰化辅助监测个体的肿瘤是否处于生长/复发期时，还可同时使用降低其乙酰化的其他治疗肿瘤的药剂。一种检测肿瘤PKM2K305乙酰化的方法，用于检测肿瘤生长或复发，在肿瘤组织中的PKM2K305乙酰化水平明显高于癌旁组织，如图5所示。本发明提供了一种丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂，尤其涉及一种PKM2K305乙酰化的抑制剂，该抑制剂可有效抑制K305的乙酰化。本发明还提供相应的检测方法，所述的检测方法可检测肿瘤样品中的PKM2K305乙酰化的水平，该检测方法简单易行、快速高效、成本低廉；利用本方法检测PKM2K305乙酰化水平，并针对其进行抑制，能为肿瘤代谢诊断和治疗提供简捷的新途径。
图I表明PCAF导致PKM2K305的乙酰化。图2表明Sirtl导致PKM2K305的去乙酰化。图3表明PCAF敲除导致PKM2K305的乙酰化降低。图4表明葡萄糖增加PKM2K305的乙酰化。图5表明前列腺癌中的K305乙酰化水平明显高于癌旁组织。图6是K305乙酰化抗体的鉴定图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I免疫组化检测一、实验材料前列腺组织石蜡切片来自仁济医院泌尿外科；PKM2K305乙酰化抗体自备；PSA，PKM2分别从公司购买。二、样本检测 实验共检测15例前列腺癌及其癌旁组织，每例收集5例石蜡切片，分别进行HE染色，PKM2，PSA和PKM2K305的乙酰化的免疫组织分析，并挑选不同的视野用软件对染色的强度进行分析，最后进行配对T检验。三、检测结果表I K305乙酰化/PKM2的比例数据·
权利要求
1.一种丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂，其特征在于，含有PKM2K305乙酰化及其乙酰化酶和去乙酰化酶。
2.按权利要求I所述的抑制剂，其特征在于，所述的PKM2K305，位于PKM2的外显子8中，具有如SEQ ID No. I的序列。
3.按权利要求I所述的抑制剂，其特征在于，所述的去乙酰化酶选自Sirtl、Sirt2、HDAC5、HDAC6 或 HDAC7。
4.按权利要求I所述的抑制剂，其特征在于，所述的乙酰化酶选自PCAF、P300、GCN5或CBP。
5.PKM2K305乙酰化的抗体，其特征在于，所述的抗体是含有乙酰化位点特异K305的乙酰化抗体，制备该K305乙酰化抗体的多肽为acetyl-PKM2(K305)，具有如SEQ ID No. 2的序列。
6.一种检测PKM2 K305乙酰化的方法，其特征在于，检测所述位点的乙酰化水平，包括以下步骤 (1)制备乙酰化位点特异K305的乙酰化抗体； (2)抽提组织样品的蛋白质/或制备肿瘤组织石蜡切片； (3)检测肿瘤组织K305乙酰化水平。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的制备的乙酰化位点特异K305的乙酰化抗体的多肽为acetyl-PKM2 (K305)，具有如SEQ ID No. 2的序列。
8.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤组织K305乙酰化水平为抗体浓度为I 500。
9.权利要求I的丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂在制备治疗癌症药物中的用途。
10.按权利要求9所述的用途，其特征是，所述的癌症为前列腺癌。
全文摘要
本发明属分子生物学和医学领域，涉及丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂及其用途。所述的丙酮酸激酶2乙酰化抑制剂，包括PKM2K305乙酰化的抑制剂，可有效抑制K305的乙酰化。本发明还提供相应的检测PKM2K305乙酰化的抗体和方法，所述的检测方法可检测肿瘤样品中的PKM2K305乙酰化的水平，且简单易行、快速高效、成本低廉；利用本方法检测PKM2K305乙酰化水平，并针对其进行抑制，为肿瘤代谢诊断和治疗提供简捷的新途径。
文档编号G01N33/574GK102805860SQ20111014557
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者雷群英, 吕雷, 李 东, 赵地, 管坤良, 熊跃, 林瑞婷, 刘颖 申请人:复旦大学