专利名称：食物过敏原检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种食物过敏原检测试剂盒及其制备方法，属于酶联免疫检测技术。
背景技术：
机体对某种食物过敏时，会在体内产生特异性抗体，能特异性结合食物中导致过敏的成份——过敏原。目前，临床上常采用检测特异性抗体的种类来确定患者食物过敏的类型，而酶联免疫吸附实验是常用的检测方法。传统的食物过敏酶联免疫检测法通常采用的都是直接包被模式，即由生产厂家预先将过敏原固相化于作为载体的聚苯乙烯微孔板上，供检测人员直接使用。然而，食物过敏的种类很多，同一患者可对多种食物过敏，但存在个体差异。在检测时往往需要同时进行多种过敏原的检测，而每一个患者所需的检测组合又各不相同。传统试剂常常由生产厂家将多种过敏原同时包被于微孔板制成类似套餐性质的检测组合，由于采用直接包被法，组合方式将无法改变。而实际工作中，每一患者的检测需要各不相同，食物过敏组合是个性化的，往往与厂家提供的项目组合产生冲突，造成多余的检测和漏检，同时会增加检测成本。链霉亲和素与生物素系统，是基于生物素与链霉亲和素相结合这一特性所建立的体系称为生物素-亲和素系统。生物素(biotin，B)分子量为对4. 31，现已能人工合成，制备方便。生物素基本结构为双环结构1环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体、酶等。生物素与生物大分子结合后并不影响生物分子和生物素原有的生物活性，即生物素标记抗体同时具备与亲和素和相应抗原结合之特性。链霉亲合素(Str印tavidin，SA)，分子量65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。与亲和素相比，链霉亲和素对生物素具有高度亲和力(亲和常数为1015/mol)，与生物素结合后形成非常稳定复合物，很难解离。
发明内容
本发明就是为了克服直接包被模式制备的食物过敏酶标反应板，无法满足患者个性化需求的不足，而提供一种灵活选择所需过敏原，包被和检测过程同步进行的食物过敏原检测试剂盒及其制备方法。本发明的设计原理是引入生物素-亲和素间接包被模式，对酶标反应板的包被制作环节进行改进，过敏原不需预先包被，而是标记上生物素，同包被了亲和素的微孔反应板同时提供给使用者，检测人员根据被检者的具体情况灵活选择所需过敏原并可同血清一道加入微孔板，实现即时包被，并且包被和检测过程同步进行。本发明是按以下技术方案设计的。一种食物过敏原检测试剂盒的制备方法，包括显色液A、显色液B，终止液，酶标抗 IgE抗体，该试剂盒还包括包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，多种分别生物素化过敏原，其中
a.包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，是在聚苯乙烯微 孔板上，每孔加入稀释液I稀释的浓度为3-5P g/ml的生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液 150ド1，甩净后用稀释液I洗板，甩净，拍干；每孔再加入稀释液II稀释的浓度为3-5P g/ml 的链霉亲和素包被缓冲液150ド1，温浴，甩净，用稀释液II洗板，甩净，拍干；每孔加入封闭 溶液体积250ド1，温浴过夜，甩净，拍干备用；
b.多种生物素化过敏原，即将多种纯化的特异性抗体的过敏原分別用0.lmol/L, PH9. 5的NaHCO3缓冲液透析，过夜并于280nm处测吸光度值，计算抗体总量；另将多种活化 的生物素分别溶于ニ甲基甲酰胺，按照生物素与过敏原的摩尔比为15-20:1的比例将二者 混合反应lh，反应后的液体分別再用0. lmol/L磷酸盐缓冲液4°C透析M小吋，分装于试剂 瓶中备用。所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其多种纯化的特异性抗体的过敏原分別 是牛奶过敏原，鸡蛋过敏原，虾蟹过敏原，小麦过敏原，花生过敏原等。所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其稀释液I是按以下重量百分比的原料 制备的
三羟甲基氨基甲烷(Tris)6. 06 g (0. 606g/100ml)
氯化钠(NaCl)8. 77 g (0. 877g/100ml)
Proclin 3000.5ml (0. 05ml/100ml)
双蒸水(ddH20) 950 ml 调 pH=8. 0 加 0. 5 ml Procilin 300 定溶至 1000 ml。所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其稀释液II是按以下重量百分比的原料 制备的
磷酸ニ氢钠(NaH2PO4 2H20)4. 68 g (0. 468g/100ml)
磷酸氢ニ钠(Na2HPO4 Iffl2O)7. 16 g (0. 716g/100ml)
L-色氨酸(L-Tryptophan)0. 2 g (0. 02g/100ml)
氯化钠(NaCl)8. 77g (0.877g/100ml)
双蒸水(ddH20) 950 ml.pH=8.0 定溶至 1000 ml。所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其封闭溶液是按以下重量百分比的原料 制备的
磷酸ニ氢钠(NaH2PO4 2H20) 0.145 g (0. 029g/100ml) 磷酸氢ニ钠(Na2HPO4 12H20) 1. 45 g (0. 29g/100ml) 6-氨基己酸(ACA) 1. 5 g (0. 3g/100ml)
氯化钠(NaCl) 4. 38 g (0.876g/100ml)
双蒸水(ddH20) 450 ml 调 pH=7. 3 7.5
牛血清白蛋白(BSA) 2. 0 g (0. 4g/100ml)
蔗糖17. 5 g (3. 5g/100ml)
Procilin 3000. 25 ml (0. 05ml/100ml)
加双蒸水定溶至500 ml。如上所述ー种食物过敏原检测试剂盒，包括显色液A、显色液B，终止液，酶标抗 IgE抗体，该试剂盒还包括包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，多种的生物素化过敏原。使用时根据患者的病史等情况选择所需的过敏原分别加入通用反应板，同时加入患者血清，血清中的特异性抗体与过敏原通过抗原抗体反应结合的同时，过敏原通过生物素和微孔板的的链霉亲和素结合，从而过敏原-特异性抗体复合物固定于微孔板上，其后的反应过程和结果判读过程同传统的酶联免疫检测模式，即洗板去除未结合成分，再加入酶标记的第二抗体-IgE抗体(PAb)同固定与微孔板的待检抗体结合，通过酶催化底物显色而得出结果。如果血清中不含该特异性抗体，则反应不能顺利进行，最终不会显色。这样设计的本发明
1.克服了传统的直接包被模式不能满足患者个性化检测需求的不足，便于检测人员根据患者临床表现选择疑似的食物种类进行鉴别，方便灵活地选择项目组合，提高了检测试剂的通用性和利用率，避免无关项目的检测和试剂浪费，减少检测成本；由于包被和检测过程的同步进行，反应时间和操作并未增加，而使检测操作更加方便。2.链霉亲和素与生物素之间具有较高亲和力，确保酶标反应板具有很好稳定性。 牛血清白蛋白分子来源丰富，价格低廉，且易于包被于酶标反应板。
附图是过敏原间接包被模式的原理示意图。其中1:聚苯乙烯微孔板4:链霉亲和素
2生物素化牛血清白蛋白5 生物素化过敏原
3生物素。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。一.相关试剂及配比 1.稀释液I
Tris (三羟甲基氨基甲烷)6.06 g (0. 606g/100ml)
NaCl (氯化钠)8.77 g (0. 877g/100ml)
Proclin 3000.5ml (0. 05ml/100ml)
ddH20 (双蒸水)950 ml 调 ρΗ=8· 0 加 0· 5 ml Procilin 300 定溶至 1000 ml,2.生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液
用稀释液I将生物素化牛血清白蛋白稀释，终浓度为5μ g/ml，充分搅拌混勻。3.稀释液 II
4. 68 g (0. 468g/100ml) 7. 16 g (0. 716g/100ml) 0. 2 g (0. 02g/100ml) 8.77g (0. 877g/100ml)
NaH2PO4 2H20 (磷酸二氢钠) Na2HPO4 Iffl2O (磷酸氢二钠) L-Tryptophan (L-色氨酸) NaCl(氯化钠)
ddH20(双蒸水)950 1111 调？!1=8.0 定溶至 1000 ml。 4.链霉亲和素包被缓冲液
用稀释液II将链霉亲和素稀释，终浓度为3 μ g/ml，充分搅拌混勻<
5.封闭溶液
NaH2PO4 2H20 (磷酸二氢钠) 0.145 g (0. 029g/100ml) Na2HPO4 12H20 (磷酸氢二钠) 1. 45 g (0. 29g/100ml) ACA(6-氨基己酸) 1. 5 g (0. 3g/100ml)
NaCl(氯化钠)4. 38 g (0. 876g/100ml)
ddH20(双蒸水)450 ml 调 pH=7. 3 7. 5
BSA(牛血清白蛋白)2.0 g (0.4g/100ml)
蔗糖17. 5 g (3. 5g/100ml)
Procilin 3000. 25 ml (0. 05ml/100ml)
加ddH20定溶至500 ml。6.磷酸盐缓冲盐水(0. lmol/L, pH7. 4) ddH20(双蒸水)3600ml
NaH2PO4. 2H20 (磷酸二氢钠) 11.84g (2. 96g/1000ml) Na2HPO4. 12H20 (磷酸氢二钠) 116g (29g/1000ml) 调 pH=7. 3 7. 45 加ddH20定容至4000ml。7.碳酸氢钠缓冲液(0. lmol/L, pH9. 5) ddH20(双蒸水)450ml
醋酸钠8.2g (16.4g/1000ml)
柠檬酸1. 58g (3. 16g/1000ml)
30% H2O2(双氧水)0. 27ml (0. 54ml/1000ml)
用IM柠檬酸或IOM NaOH调节pH值至5. 3，去离子水定容至500ml，分装，4°C储存。8.显色液A 市售商品
权利要求
1.一种食物过敏原检测试剂盒的制备方法，包括显色液A、显色液B，终止液，酶标抗 IgE抗体，其特征在于该试剂盒还包括包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯 乙烯微孔板，多种分别生物素化过敏原，其中a.包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，是在聚苯乙烯微 孔板上，每孔加入稀释液I稀释的浓度为3-5 ii g/ml的生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液 150l_a，甩净后用稀释液I洗板，甩净，拍干；每孔再加入稀释液II稀释的浓度为3-5 ii g/ml 的链霉亲和素包被缓冲液150l_a，温浴，甩净，用稀释液II洗板，甩净，拍干；每孔加入封闭 溶液体积250l_a，温浴过夜，甩净，拍干备用；b.多种生物素化过敏原，即将多种纯化的特异性抗体的过敏原分别用0.Imol/L， pH9. 5的NaHCA缓冲液透析，过夜并于280nm处测吸光度值，计算抗体总量；另将多种活化 的生物素分别溶于二甲基甲酰胺，按照生物素与过敏原的摩尔比为15-20:1的比例将二者 混合反应Ih，反应后的液体分别再用0. Imol/L磷酸盐缓冲液4°C透析M小时，分装于试剂 瓶中备用。
2.根据权利要求1所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于多种纯化的 特异性抗体的过敏原分别是牛奶过敏原，鸡蛋过敏原，奸蟹过敏原，小麦过敏原，花生过敏原。
3.根据权利要求1所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于稀释液I是 按以下重量百分比的原料制备的三轻甲基氨基甲烧0. 606g/100ml氯化钠0.877g/100mlProclin 3000. 05ml/100m双蒸水 950 ml 调 pH=8. 0 加 0. 5 ml Procilin 300 定溶至 1000 ml。
4.根据权利要求1所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于稀释液n是 按以下重量百分比的原料制备的磷酸二氧钠0. 468g/100ml磷酸氧二钠0. 716g/100mlL-色氨酸0.02g/100ml氯化钠0.877g/100ml双蒸水950 ml调pH=8.0 定溶至1000 ml。
5.根据权利要求1所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于封闭溶液是 按以下重量百分比的原料制备的磷酸二氧钠0. 029g/100ml磷酸氧二钠0. 29g/100ml6-氨基己酸0. 3g/100ml氯化钠0.876g/100ml双蒸水450 ml调pH=7. 3 7. 5牛血清白蛋白0.4g/100ml蔴糖3. 5g/100mlProcilin 3000. 05ml/100ml加双蒸水定溶至500 ml。
6.根据权利要求1所述食物过敏原检测试剂盒的制备方法，其特征在于一种食物过敏原检测试剂盒，包括显色液A、显色液B，终止液，IgE抗体，其特征在于该试剂盒还包括包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的聚苯乙烯微孔板，多种的生物素化过敏原。
全文摘要
本发明公开了一种食物过敏原检测试剂盒及其制备方法，属于酶联免疫检测技术。本发明包括显色液A、显色液B，终止液，酶标抗IgE抗体，而在聚苯乙烯微孔板上包被有生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素；以及常见的多种过敏原如牛奶过敏原，鸡蛋过敏原，虾蟹过敏原等分别标记生物素。检测时，选择所需种类的生物素化过敏原与患者血清一道加入微孔板，生物素化过敏原与血清中的特异性抗体结合的同时，生物素和链霉亲和素结合，从而使过敏原-特异性抗体复合物固定于微孔板上，实现包被和反应的同步进行。通过一个检测试剂盒提供多种项目组合，满足患者个性化的检测需求。提高了检测试剂的通用性和利用率，避免无关项目的检测和试剂浪费。
文档编号G01N33/543GK102331495SQ20111016710
公开日2012年1月25日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者张明华, 张珩, 李会强, 李立和, 陈寅, 靳宝英 申请人:沃克(天津)生物科技有限公司