专利名称：：人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法。
背景技术：
：血小板输注是预防和治疗因血小板减少或功能异常而引发的出血性疾病的重要手段。由于目前人类血小板抗原(humanplateletantigen，HPA)分型技术的局限性，临床输注血小板时多考虑ABO血型，而忽视了血小板血型相配合的问题。血小板血型不配合可引发一系列临床同种免疫症状的出现，如新生儿同种免疫血小板减少症(NAIT)、输血后紫癜(PTP)及血小板输注无效(PTR)等。建立一种新型、高效且实用的HPA分型技术，为患者提供相配合的血小板，对于促进临床血小板输注的安全性和有效性无疑具有重要意义。HPA是由血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，其基因具有单核苷酸多态性(SNP)0目前已发现有24个血型抗原，被国际血小板命名委员会(PNC)正式命名的HPA有22个，其相应基因遗传多态性的分子基础也被阐明。这些HPA系统的共同特点是常染色体显性遗传，多数已证实由共显性双等位基因控制，在cDNA序列中仅有12个碱基的差别而导致翻译时1个氨基酸的不同。随着HPA分子生物学特性的不断阐明，HPA基因分型成为可能。长久以来，HPA分型一直采用血清学方法，如混合被动血凝试验(MPHA)、血小板抗原单克隆特异性抗体固定试验(MAIPA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)等。由于这些方法所需的一些抗血清，如抗2a和抗3b等，都难以获得，加之在一些NAIT、PTP或PTR患者中较难得到足够的血小板用于血清学试验，人们一直考虑用一种更有效、实用的方法来取代血清学试验。进入上世纪90年代后，随着分子生物学技术的不断发展和对HPA基因结构研究的突破性进展，使得HPA基因分型成为可能。到目前为止，主要有以下几种HPA基因分型方法聚合酶链反应_序列特异性引物技术(PCR-SSP)、DNA序列分析、聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-AS0)、聚合酶链反应_限制性片断长度多态性分析(PCR-RFLP)、固相基因芯片，其检测的准确性、敏感性、简便性及线性范围等方面均有待进一步提高。
发明内容本发明的目的是提供一种准确性、敏感性和灵活性更高的人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法，可对目前正式命名的22种人类血小板抗原型别一次性检测，以克服目前的人类血小板抗原基因分型技术中存在的通量低、准确度和灵敏度较差的问题。本发明所采用的技术方案是人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于所述的液相芯片包含有(1)扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24引物1-12的序列分别为SEQIDNO.1-12，扩增包括la、lb、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、Ilw和8w在内的六个目标片段；引物13-24的序列分别为SEQIDNO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w禾口14w在内的六个目标片段；(2)用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQIDNO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；(3)分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPAlHPA2HPA3HPA4HPA5HPAl5HPA6HPA7HPA8HPA9HPAlOHPAllHPA12HPAl3HPA14HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。如所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于由以下步骤实现步骤一采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；步骤二以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物；步骤三连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素_藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球_特异性探针_单链连接产物_生物素_链亲和素_藻红蛋白复合物；步骤四通过流式荧光检测仪进行信号阅读。所述的步骤一中的扩增温度为95°C，变性3分钟，95°C—30s52°C—30s72°C—30s5个循环，95°C—30s55°C—30s72°C—30s30个循环，72°C延伸1分钟；PCR扩增使用的酶为taq聚合酶。所述的步骤二中的连接反应，其反应体系包括IXthermostableIigasereactionbuffer，两管多重扩增产物各1μ1，连接探针各0.2μΜ,thermostableligase4U,总体积为20μ1；连接温度为95°C，变性3分钟，95°C—30s60°C—30s30个循环；连接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶。所述的步骤三中的杂交反应为，将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μ1置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μ1；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混勻；置于控温器上，设置并运行如下温度程序94°C3min50°C30min，此运行时按照80μ1/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50°C，同时请将Luminex加热装置设定为52°C，运行结束后每孔加入荧光素80μ1，并继续在50°C下孵育10分钟。本发明具有以下优点①通量大液相芯片体系中的微球采用荧光编码技术，可产生100种有颜色差别的荧光微球。这样便可对同一标本中多达100种不同的待检分子同时进行定性、定量分析。与传统检测方法相比，这可谓是一个质的飞跃。②敏感性高微球表面积大，每个微球表面可包被多达广2XIO6个捕获分子。因此结合的待检分子多，产生的信号强。加之采用荧光检测，其敏感性大大高于现有的其它检测手段。③特异性强液相芯片检测的特异性主要是由反应系统内生物分子间结合的特异性所决定的。另外，用两束激光分别检测微球的荧光信号和分子间的杂交信号，其中荧光信号决定特异性，杂交信号决定敏感性，而且激光只分析微球一定半径内的信息，因此可进一步增强检测的特异性，降低背景信号。④重复性好液相芯片的杂交反应发生在准均相液态环境中，其结果稳定，重复性好。另外，每一指标在一个反应体系中有相对应的100(Γ5000个相同的微球。检测时，抽取其中10(Γ500个进行读数，取其均值作为最终结果，从而使得定量结果更为精确可靠。⑤线性范围宽其检测的线性范围可以达到4飞个数量级。⑥操作简便、省时、经济液相芯片检测可无需洗涤，整个过程只涉及加样和孵育，最后上机读取结果，因此操作省时、省力。加之整个反应过程在液态悬浮状态下进行，可保持生物分子的天然构象，更有利于生物分子间的特异性结合反应，使得反应速度大大提高。可同时检测同一标本中多个待检分子的液相芯片方法，不仅经济，而且更节约标本用量。⑦灵活性大、应用范围广包被有不同捕获分子的微球可分开保存，以便根据需要及时调整检测体系的设计，包括调整包被于微球上捕获分子的种类，这样便可灵活地对检测体系进行调整与完善。包被于微球表面的捕获分子可以是蛋白质，也可以是核酸，因此可满足不同的研究和诊断需求。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。一、液才目芯片(liquichip)，又禾尔悬浮,点阵技术(suspensionarraytechnology,SAT)，是新一代的生物芯片技术。液相芯片体系主要由4种要素构成微球、捕获分子即抗原、抗体或核酸探针、待检分子和报告分子。微球由聚苯乙烯制作而来，主要用来固定和区分不同的捕获分子；利用荧光编码技术，即在微球制备过程中精确掺入两种不同比例的红色分类荧光染料，就可获得100种有颜色差别的荧光编码微球，这样便可对100种不同的探针分子进行标记，也就能完成对一个标本中多达100种不同的待检分子同时进行检测。包被于微球上的捕获分子若为抗原或抗体，便可检测蛋白质，即所谓液相蛋白芯片；若为核酸探针，便可检测核酸，即所谓液相基因芯片；将每种包被有相应捕获分子的荧光编码微球混悬于一个液相体系中，依次加入待检标本及报告分子。不同微球上的捕获分子与标本中的相应待检分子便特异性结合，报告分子与相应待检分子也特异性结合，即构成了一个液相芯片的反应系统。反应结束后，让单个的微球依次通过检测通道进行检测。液相芯片的检测系统内置有双色激光发射器，产生的红色激光用来激发微球上的红色分类荧光，可将微球分类，从而将各种不同的分析反应区分开来，即定性。产生的绿色激光用来激发报告分子上的绿色报告荧光，从而确定与微球结合的相应待检分子的数量，即定量。利用这种液相芯片系统，可以对同一微量标本中的多个不同待检分子同时进行快速的定性、定量分析。二、本发明所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片包含有(1)扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24。如表1所示，人类血小板抗原22种基因型的SNP位点分布在7个基因的16个不同位置，本发明根据各SNP位点的分布，设计了A、B两组多重引物。其中，引物1-12为A组，序列分别为SEQIDNO.1-12，扩增包括la、lb、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、Ilw和8w在内的六个目标片段；引物13-24为B组，序列分别为SEQIDNO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w和14w在内的六个目标片段。通过优选确定了每组引物中各引物对之间的浓度配比，通过这两组引物可将12个目的片段在A、B两管中进行有效扩增，同时避免扩增出非特异性产物。A、B两组引物的序列及其对应扩增片段包含的基因型及浓度配比见表2。表122种人类血小板抗原基因型所在的基因名称、基因登录号、氨基酸变化及CD分类信息序腿ttSfiS因SlSfilmmnmmnCD分类01HPA-IiCPXlIaITCB3I39SP176TLevCD6102HPA-IbGPIllaITCB3138999176CPioCDc03HPA-4aGPIIIaFTOB31389996GJtciC16104HPA-4bGPIlIaITCB36AGin051ΡΑ-βGPIlIaITCB313S91544OAArj>GlnCWl06ΗΡΑ-GPIIIaITCB3M35J991297OGPro>AlaCWI01HPA-BwGFIII，ITCiS139399_OTIxsCysCKI08ΗΡΑ"VC%GPIlIaITCB313S999263OAAiC〉GlnCBil05ΗΓΑ"IlvGPIIIaITG83139919ΦAig>HisCKl10ΗΡΑ-14GFIlIaITGB313S999delMGDelLysCBiI11IPA-16'jr11131IbDiSmJiMy49OTThr">IIeCKI12HPA-SaOPlIb1TGS2B1344802521TlieCMl13HPA-SbOFIIbimm■44802621CSeiCMl14ΗΡΑ9GFIIbITCA2BWjMW2602G>h￥Λ>letCD4115ΗΡΑ-2aGPIbaGPlBAM.000173482CTte'J42b16HPA-1'bGPIbaGPlBlIijX173482Tlet■:...，17舰-5aCPIa1TCA2I1TO331600CCluOb18ΗΡΑ-5bCPIa11Π12X17033IfiOOALys9b19ΗΡΑ-13GPIa1TGA2I1TO332483OTThr>letGMSb20HPA-ISaCD103CDlOSNH_i334332108CSeimm.21HPA-Ia01109CP1093fM_1334932iOSATyiCDlOe22HPA-I^GPIbPGPlBB麗_00_71190>AGly>Glu4ie表2引物的序列、对应扩增目的片段包含基因型、引物配比权利要求1.人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于所述的液相芯片包含有(1)扩增出包含有人类血小板抗原22种基因型SNP位点的目标序列的引物1-24引物1-12的序列分别为SEQIDNO.1-12，扩增包括la、lb、10w、2a、2b、3a、3b、9w、5a、5b、15a、15b、Ilw和8w在内的六个目标片段；引物13-24的序列分别为SEQIDNO.13-24，扩增包括4a、4b、16w、6w、7w、12w、13w禾口14w在内的六个目标片段；(2)用于区分22种SNP位点的特异性连接探针25-46，序列分别为SEQIDNO.25-46，每个探针是针对每一个SNP位点的前后相邻的两个寡核苷酸片段，即前端连接探针和后端连接探针；(3)分别包被有对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68的荧光编码微球。2.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于所述的前端连接探针的末位碱基为区别SNP突变的碱基，前端连接探针的首位碱基标记有生物素，后端连接探针的首位碱基有磷酸化修饰，在碱基完全匹配的情况下有耐热连接酶将前端后端连接探针进行共价连接，形成首位碱基有标记有生物素的多碱基核苷酸链。3.根据权利要求1所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片，其特征在于所述的对应人类血小板抗原22种SNP位点的特异性检测探针47-68，分别选自HPAlHPA2HPA3HPA4HPA5HPA15HPA6HPA7HPA8HPA9HPAlOHPAllHPA12HPA13HPA14HPA16抗原决定基因碱基突变位点两侧序列，包括特异序列、连续10个T碱基间隔序列及修饰合成的氨基。4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于由以下步骤实现步骤一采用两组扩增引物1-24在两个扩增管中对检测DNA样本进行多重PCR扩增，并将两管中的产物进行等量混合，获得包含有22种SNP位点所在的目的片段；步骤二以上述获得的扩增产物为模板，用连接探针25-46在同一管中进行多重连接反应，获得样品中存在的代表各基因型的单链连接产物；步骤三连接产物同包被有特异性探针47-68的荧光微球进行杂交反应，随后通过连接产物前端碱基上标记的生物素和链亲和素_藻红蛋白荧光标记分子反应，从而形成荧光微球_特异性探针_单链连接产物_生物素_链亲和素_藻红蛋白复合物；步骤四通过流式荧光检测仪进行信号阅读。5.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于所述的步骤一中的扩增温度为95°C，变性3分钟，95°C—30s52°C—30s72°C—30s5个循环，95°C—30s55°C-30s72°C—30s30个循环，72°C延伸1分钟；PCR扩增使用的酶为taq聚合酶。6.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于所述的步骤二中的连接反应，其反应体系包括IXthermostableligasereactionbuffer，两管多重扩增产物各1μ1，连接探针各0.2μΜ,thermostableligase4U,总体积为20μ1；连接温度为95°C，变性3分钟，95°C—30s60°C—30s30个循环；连接反应使用的连接酶为90N耐热连接酶。7.根据权利要求4所述的人类血小板抗原基因分型液相芯片的检测方法，其特征在于所述的步骤三中的杂交反应为，将液相芯片放置于室温下静置30分钟平衡温度；微球于振荡器上震荡30秒，充分悬浮微球；取微球20μ1置于杂交反应室内；每个反应加入连接产物1.5μ1；贴上合适的封板纸，并于振荡器上震荡10秒钟充分混勻；置于控温器上，设置并运行如下温度程序94°C3min50°C30min，此运行时按照80μ1/反应的体积准备荧光素，并孵育至温度为50°C，同时请将Luminex加热装置设定为52°C，运行结束后每孔加入荧光素80μ1，并继续在50°C下孵育10分钟。全文摘要本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种人类血小板抗原基因分型液相芯片及其检测方法。人类血小板抗原基因分型技术是为患者提供相配合的血小板、促进临床血小板输注的安全性和有效性的重要技术手段，但现有的人类血小板抗原基因分型技术存在通量低、准确度和灵敏度等指标均有待提高等问题。本发明所述的液相芯片包含有引物1-24、连接探针25-46和包被有检测探针47-68的荧光编码微球，经过扩增、连接和杂交反应完成人类血小板抗原基因分型检测。本发明所采用的液相芯片和检测方法具有通量大、敏感性高、特异性强、重复性好、线性范围宽、操作简单、灵活性强、应用范围广的优点，是临床上准确、高效而实用的人类血小板抗原基因分型检测方法。文档编号G01N21/64GK102230017SQ201110171128公开日2011年11月2日申请日期2011年6月23日优先权日2011年6月23日发明者安群星,李翠莹,白艳军,穆士杰申请人:中国人民解放军第四军医大学