专利名称：一种抗人蛋白rn181的单克隆抗体及杂交瘤细胞株3953与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人蛋白RN181的单克隆抗体及其试剂盒。
背景技术：
肝癌是世界上最常见的致命癌症之一，在各种癌症中发病率居第四，大部分患有肝癌的病人都在作出诊断后的一年之内死亡，并且在以往的20多年里死亡率都没有下降。 一部分原因是现有的诊断方法并不是很有效，肝癌的发现和诊断较为困难，尤其是原发性肝癌发现时多为晚期。因此对于原发性肝癌的早期检测可有效的提高对这种疾病的预后。 但是现有的肝癌血清标志物诸如甲胎蛋白AFP和DCP缺乏足够的检测特异性和灵敏性，因此需要选择更加特异性的检测靶点。人蛋白RN181是一种新发现的具有类似E3酶活性的蛋白，它能参与蛋白酶体途径。它具有RING指结构域，属于C3HC4型锌指蛋白家族的蛋白。其基因全长716个碱基， 编码蛋白长153个氨基酸。RING指区域是一种蛋白质相互作用的区域，既往研究提示拥有 RING指的蛋白普遍具有两方面功能①可参与基因转录调控、DNA修复和重组、细胞转化及肿瘤抑制等多种生物过程；②RING指区域是&泛素蛋白连接酶的重要活性区域，许多含有RING指结构域的蛋白都在泛素化途径中起关键作用。我们的研究发现人RN181蛋白在原发性肝癌细胞内会表达下降。RN181免疫组化检测结果显示，所有外科手术时切除的原发性肝癌肿瘤样本中均呈弱阳性或不表达，而相对应的癌旁正常细胞或正常肝脏中则表达强烈。根据检测到的阳性肝细胞着色程度，可将RN181的着色归入四个不同的等级(ScoreO、 ScoreU Score2, Score3)中。koreO显示原发性肝癌恶化的一种高度特异性状况，呈零级着色；对应于癌旁或正常肝样本中三级着色。因此，抗RN181单克隆抗体将有利于原发性肝癌的诊断，并使原发性肝癌的诊断独立于病因学之外，因而更为简便。而其他一些肿瘤标志物诸如KI-67、P53、PCNA的特异性和灵敏性均不理想，仅用于识别肝脏组织中的增殖细胞，相比之下，抗RN181单克隆抗体的应用将提高原发性肝癌检测的灵敏度和特异性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人蛋白RN181的单克隆抗体，它具有区分原发性肝癌组织和正常组织，以及对原发性肝癌组织的作用。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种杂交瘤细胞株，2010年6月25日，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3953。分类命名为锌指蛋白RN181单克隆抗体杂交瘤细胞株。—种抗人蛋白RN181的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌所得。优选的实施方案，抗人蛋白RN181的单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株通过接种小鼠腹腔，抽腹水的方法进行制备。作为优选，纯化抗人蛋白RN181的单克隆抗体是使用protein-G和分子筛的方法， 纯化后的单克隆抗体纯度不低于85%。作为优选，抗人蛋白RN181的单克隆抗体的鉴定方法是SDS-PAGE结合灰度扫描的方法。作为优选，抗人蛋白RN181的单克隆抗体区分原发性肝癌组织和癌旁组织是通过免疫组化方法来实现的。作为优选，抗人蛋白RN181的单克隆抗体对原发性肝癌组织进行分级是通过免疫组化方法来实现的。本发明的另一个目的是利用抗人蛋白RN181的单克隆抗体制备一种原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒。一种原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒，包括3%H202、抗人蛋白RN181的单克隆抗体、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、链霉素标记的辣根过氧化物酶及DAB显色缓冲液，所述抗人蛋白RN181的单克隆抗体为上述保藏编号为CGMCC3953的杂交瘤细胞株分泌的抗体， 工作浓度为2Pg/ml。根据本发明目的一个优选的实施方案，使用原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒检测时，需自配0.01M PBS (pH7. 4)，及使用苏木素，苏木素采用市售产品，推荐北京中杉金桥公司的产品。作为优选，原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒所使用的标本为肝脏组织石蜡切片。根据本发明目的一个优选的实施方案，其中扩增RN181基因的引物序列为上游引物5，-CTC GAG ATG GCG TCC TAT TTC 3，，下游引物5，-GGA TCC CGT GTA CAT GGC 3，。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明的抗人蛋白RN181的单克隆抗体及利用该单克隆抗体制备的原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒可用于区分原发性肝癌组织和癌旁正常组织，以及对原发性肝癌组织进行分级，从而实现原发性肝癌的诊断。
图1 S^festern-blot鉴定结果，其中2为CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181 单克隆抗体。图2为CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体对癌旁正常组织的石蜡切片进行免疫组化检测的结果，结果显示为score 3。图3为CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体对病理分级为1级的癌组织石蜡切片进行免疫组化检测的结果，结果显示为score 2。图4为CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体对病理分级为2级的癌组织石蜡切片进行免疫组化检测的结果，结果显示为score 1。图5为CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体对病理分级为3级的癌组织石蜡切片进行免疫组化检测的结果，结果显示为score 0。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 抗RN181单克隆抗体的制备 1、接种动物
将处于液氮中的保藏编号为CGMCC3953杂交瘤细胞进行复苏，用含10%胎牛血清的 1640培养基培养，收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，在已用石蜡油致敏的BALB/c小鼠腹腔接种处于对数生长期的杂交瘤细胞约IO6个。10天后采集腹水并使用12000r/min离心IOmin得到上清，将上清用0. 22 μ m滤膜过滤。采用Protein-G亲和层析纯化已过滤的腹水上清先用0. 01mol/L PBS平衡柱子3个柱体积，用0. Olmol/L PBS 1 10稀释上清，上样，O.Olmol/L PBS洗杂质后，用0. lmol/L盐酸甘氨酸缓冲液(pH2. .8)洗脱，再用lmol/L This-HCl (pH9. 0)按1:100比例中和。将经ProteinG纯化的上清通过kpharose S-200分子筛脱盐，O.Olmol/L PBS洗脱，收集的蛋白峰用12%SDS_PAGE电泳，用灰度扫描，抗RN181 单克隆抗体纯度达到91.2%。2、Western-blot 鉴定
收集肝癌细胞(H印G2 )，用1 X SDS裂解缓冲液裂解后上样，经12%SDS-PAGE后用 Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，TTBS洗膜3次，每次 lOmin，加入使用CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体，室温孵育Ih后，TTBS 洗膜3次，每次lOmin，二抗为Marker抗体和1 5000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗， 室温孵育lh，TTBS洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1. 4ml SuperSignal 系列Western化学发光底物反应液(A:B=1 1)，使膜完全浸润于反应液中， 迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体出现单一的特异性条带，结果如图1所示。3、单克隆抗体浓度测定
纯化后的CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体使用BIO-RAD公司生产的 Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为0. 818mg/ml。
实施例2 抗RN181单克隆抗体使用浓度的确定
把CGMCC3953杂交瘤细胞制备的抗RN181单克隆抗体按4、3、2、1、0. 5ug/ml浓度进行稀释，对不同病理分级肝癌组织和癌旁正常组织的石蜡切片免疫组化检测，结果发现单克隆抗体在浓度为2Pg/ml时，结果特异且清晰，且对不同病理分级的标本可以进行很好的分级，参见图2 5。
实施例3 原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒的组成(规格为120片)及使用方法 1、试剂盒的组成
1)3% H2O2 6ml
2)2μδ/πι1抗人蛋白RN181的单克隆抗体(CGMCC3953杂交瘤细胞制备)6ml
生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、链霉素标记的辣根过氧化物酶(HRP)、DAB显色缓冲液购买的是Dako REAL Envision detection system，其中各组分的体积均为6ml。
2、试剂盒的使用方法
试剂盒的使用方法相同，如下所示
1)3% H2O2每片滴一滴，室温孵育IOmin ；
2)0.OlM PBS (PH7.4)冲洗 5minX3 次；
3)2ug/ml抗人蛋白RN181的单克隆抗体室温孵育1小时；
4)0.OlM PBS (PH7.4)冲洗 5minX3 次；
5)生物素标记的羊抗鼠IgG抗体每片滴一滴，室温孵育30分钟；
6)0.OlM PBS (PH7.4)冲洗 5minX3 次；
7)链霉素标记的辣根过氧化物酶每片滴一滴，室温孵育10分钟；
8)0.OlM PBS (PH7.4)冲洗 5minX3 次；
9)DAB显色缓冲液每片滴一滴，室温反应5-lOmin ；
10)苏木素复染lmin，盐酸酒精(盐酸75%酒精按1:99比例配制)分化5秒，自来水返蓝1分钟；
11)脱水、透明、封片，观察结果。 实施例4 使用试剂盒进行99对临床标本的检测
收集中山大学肿瘤研究中心原发性肝癌手术标本99对，每对含癌组织和癌旁正常组织，其中病理分级为1级的19对，2级的51对，3级的四对。使用试剂盒按照实施例3的方法进行免疫组织化学实验，按照染色程度1、2、3、4级和染色细胞程度1 (<10%)，2 (11-50%), 3 (51-75%), and 4 (>75%)进行评分，最后用SPSS11. 0统计软件进行统计分析。RN181在癌旁正常组织中表达强烈，所有的99例癌旁正常组织都获得评分为score 3。 对应的癌组织RN181的表达明显下降(Ζ = -8.864，Ρ<0. 001)。在99例样品中，病理分级为1级的19例癌组织染色程度均为中等(score 2)，病理分级为2级的51例癌组织均呈现弱染色(score 1)，而剩余病理分级为3级的四例癌组织染色程度很弱甚至无染色 (score 0)。结论利用试剂盒的检测结果与病理检测结果完全一致。
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，2010年6月25日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏编号为CGMCC3953。
2.一种抗人蛋白RN181的单克隆抗体，其特征在于是由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌所得。
3.—种原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒，包括3%H202、抗人蛋白RN181的单克隆抗体、 生物素标记的羊抗鼠IgG抗体、链霉素标记的辣根过氧化物酶及DAB显色缓冲液，其特征在于所述抗人蛋白RN181的单克隆抗体为权利要求2所述的单克隆抗体，工作浓度为2Pg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种抗人蛋白RN181的单克隆抗体及杂交瘤细胞株3953与试剂盒。一种杂交瘤细胞株，其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3953。一种抗人蛋白RN181的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌所得。优选的实施方案，抗人蛋白RN181的单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株通过接种小鼠腹腔，抽腹水的方法进行制备。本发明的抗人蛋白RN181的单克隆抗体及利用该单克隆抗体制备的原发性肝癌免疫组化诊断试剂盒可用于区分原发性肝癌组织和癌旁正常组织，以及对原发性肝癌组织进行分级，从而实现原发性肝癌的诊断。
文档编号G01N33/577GK102277334SQ20111017705
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者李明, 李月, 王穗海, 董慧敏, 黄湘 申请人:南方医科大学