专利名称：聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器及制备方法
技术领域：
本发明涉及聚苯胺改性有序介孔碳漆酶的生物传感器及制备方法。
背景技术：
漆酶传感器可以方便快速地检测废水中的酚类、芳香胺类、有机磷化合物以及二恶英等有毒物质，具有广阔的应用前景。因此，研究高传感性能(如高灵敏度、快速响应、宽检测线以及低检测线等)的漆酶传感器在环境监测和检测方面具有十分重要的意义。酶电极是发展最早，也是目前最成熟的一类生物传感器，其发展经历了三个阶段。 第二代介体型酶电极利用人为加入电子媒介体来增加化学修饰层，扩大了基体电极检测化学物质的范围，同时也提高了测定的灵敏度。但媒介体的流失、生物相容性以及生物中毒等问题会导致酶电极的性能有所下降。第三代直接电化学酶电极是酶的氧化还原活性中心与电极直接“交流”，能够更快地进行电子传递。但是酶通常具有较大的分子量，酶分子的电活性中心被多肽链包围，使电极与酶催化反应中心之间的电子转移受到阻碍，且酶在电极表面吸附后易发生变形甚至失活，所以酶与电极间难以直接进行电子转移。因此，解决生物活性中心与电极表面间的电子转移的问题成为电流型生物传感器成功的关键。为了进一步提高酶传感器的灵敏性和稳定性，降低邻苯二酚氧化还原反应的过电位，改善漆酶分子氧化还原的可逆性，以SBA-15为模板，用低分子量的水溶性海因环氧树脂为碳源合成了有序介孔碳EOMC ；再利用电子传递性较高的聚苯胺，将EOMC与苯胺通过电化学聚合得到复合材料EOMC/PAn，并对其修饰的电极进行表征。然后将第二代和第三代酶传感器的优势有效的结合，即在有序介孔碳EOMC固定漆酶的基础上，在介孔碳的外围包覆一层易于底物扩散的聚苯胺膜以增加传感器的稳定性，期望构建性能更加优异的酶传感
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发明内容
本发明的目的是提供聚苯胺改性有序介孔碳(EOMC/PAn)的制备及其固定化漆酶的生物传感器的制备方法。本发明在实际监测等领域具有广泛的研究前景。本发明的技术方案如下聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器，于在介孔碳的外围包覆一层聚苯胺膜，能够更固定酶以及EOMC+Lac和EOMC+Lac/PAn修饰金电极。本发明的漆酶生物传感器的制备方法，介孔碳的外围包覆一层易于底物扩散的聚苯胺膜的制备方法步骤为将2. 5g环氧树脂溶于8-lOml无水乙醇中，加入0. 4-0. 6g 固化剂2-乙基-4-甲基咪唑，搅拌2- 后，再加入2g SBA-15,充分搅拌10_1证，使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中，然后置于真空干燥箱中80-100°C加热3- 除去溶剂；将所得产品在流量为SO-lOOmL/min的N2气氛保护下，以4_6°C /min的升温速率升至 800-1000°C碳化5- ；最后，将得到的产品用30-50wt%的氢氟酸浸泡过夜以除去模板，然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，80-100°C干燥至恒重即得到EOMC ；采用三电极体系，在30ml 25mM的AN/0. 5MH2S04电解液中进行电聚合①先在_0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；②然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈。本发明的聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器，聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶的制备方法是取^Ig酸化的EOMC加入到3-4mL已配制好的0. 5-1. Omg/mL的 Lac溶液，并在3-5°C下搅拌20-2 以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到EOMC固定化的漆酶。。本发明EOMC+Lac/PAn修饰金电极的制备方法是用粒径均勻的Al2O3粉将Au电极在麂皮上打磨抛光，经二次蒸馏水冲洗、超声后，置于pH为5. O的PBS溶液中经循环伏安扫描活化10圈；再将7ml的0. 5wt%的CS溶液超声混合5min，以制备0. 6mg/ml的EOMC+Lac/ CS溶液；然后用微量移液器取该混合液IOyL均勻地覆盖在预先处理好的Au电极，室温下静置2h，即得到EOMC+Lac/CS/Au电极。详细说明如下本发明聚苯胺改性有序介孔碳(EOMC/PAn)漆酶生物传感器的制备方法包括的步骤(1)有序介孔碳(EOMC)的制备首先，将适量的环氧树脂溶于8_12ml无水乙醇中，加入0. 4-0. 6g固化剂2_乙基-4-甲基咪唑，搅拌2- 后，再加入适量的SBA-15，充分搅拌10-1 ，使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中；第二步，将上述制备的混合物置于真空干燥箱中80-100°C加热3_4h除去溶剂；第三步，将所得产品在流量为SO-lOOmL/min的N2气氛保护下，以3_5°C /min的升温速率升至800-1000°C碳化6-8h ；最后，将得到的产品用30-50wt%的氢氟酸浸泡过夜以除去模板，然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，80-100°C干燥至恒重即得到E0MC。(2)有序介孔碳(EOMC)的酸化处理将适量的EOMC加入到70-100ml 98wt %的硫酸和20_50ml 68wt %的硝酸混合溶液中，用超声波处理10-20min后，在50-80°C水浴中加热搅拌l_2h，采用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，除去酸液，用去离子水洗涤至弱酸性，最后在50-60°C下真空干燥，得到酸化的 EOMC0(3)电极的预处理用粒径均勻的氧化铝(Al2O3)粉将金(Au)电极在麂皮上打磨抛光，经二次蒸馏水冲洗、超声后，置于PH为5.0的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中经循环伏安扫描活化10圈。(4) EOMC修饰金电极的制备先用冰乙酸配制0. 5-lwt%的壳聚糖溶液，然后再配制0. 5_0.8mg/ml EOMC的壳聚糖的悬浮液，超声混合3-6min，取5_10 μ L溶液滴加到处理好的Au电极表面，室温干燥后得到EOMC修饰Au电极，即E0MC/Au电极。(5)苯胺的蒸馏苯胺在使用前需要将其在常压下蒸馏加以纯化。用量筒取40_50ml的粗苯胺(分析纯)，放入蒸馏烧瓶中，再加入少许沸石，用电热套加热，用直形冷凝管进行空气冷却，收集182 183°C的馏分。若一次蒸馏效果不好，可以进行二次蒸馏。(6)聚苯胺改性有序介孔碳的制备在常压冰水浴的条件下，采用三电极体系(直径为Imm的Pt丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，修饰的金电极为工作电极)，在20-50ml 20-30mM的ΑΝ/0. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合①先在-0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；②然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈；实验结束后，用0. 3-0. 8M H2S04和二次蒸馏水反复冲洗工作电极，以除去未聚合的和低聚合度的苯胺。(7)聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶取适量酸化的EOMC加入到3_4mL已配制好的0. 5-1. Omg/mL的Lac溶液，并在 3_5°C下搅拌20-2 以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到 EOMC固定化的漆酶。本发明经聚苯胺改性的EOMC固定化漆酶修饰的金电极能显示出良好的直接电化学行为，在室温25士2°C，pH = 5. O的磷酸盐缓冲溶液，工作电压为+0. 45V vs SCE的实验条件下，EOMC/PAn+Lac/Au电极相比未经聚苯胺改性的EOMC+Lac/Au电极表现了更好的传感性能，其对邻苯二酚的线性检测范围是0. 55 10. 45 μ Μ,选择灵敏度为0. 08314A/M(n = 19)，表观米氏常数值为11. 5327 μ Μ，检测限为0. 173yM(S/N = 3)；此外，该漆酶传感器还表现出良好的重复性和稳定性。因此，聚苯胺改性介孔碳有望成为一种固定漆酶的复合材料，为介孔碳改性固定化酶提供了新思路。
图1实施例1制备的EOMC的透射电子显微镜图。图2实施例2制备的EOMC电聚合苯胺后的扫描电子显微镜图。图3实施例3制备的EOMC+Lac/Au电极(a)和EOMC+Lac/PAn/Au电极(b)在邻苯二酚含量为0. 05mM, pH = 5. 0的PBS溶液中的CV曲线扫描速度50mV/s图4实施例4的 E0MC+Lac/CS/Au 电极(a)和 EOMC+Lac/PAn/CS/Au 电极(b)的计时电流响应曲线+0. 45V vs SCE, IOmL pH = 5. OPBS溶液，连续滴加0. 5mM邻苯二酚溶液。图5实施例4的EOMC+Lac/ CS/Au电极(a)和EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极(b)的邻苯二酚浓度-响应电流关系图(1)和 Lineweave-Burk 曲线(2) +O. 45V vs SCE，IOmL pH = 5. OPBS 溶液，连续滴加 0. 5mM 邻苯二酚溶液
具体实施例方式电极的电化学测试测试系统采用三电极测试体系以各种修饰金(Au)电极为工作电极，Pt丝(直径为Imm)为对电极，甘汞饱和电极为参比电极。实施例1将2. 5g环氧树脂溶于IOml无水乙醇中，加入0.5g固化剂2-乙基-4-甲基咪唑， 搅拌池后，再加入2g SBA-15，充分搅拌12h，使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中，然后置于真空干燥箱中100°c加热4h除去溶剂；将上述制备的混合物在流量为lOOmL/min 的N2气氛保护下，以5°C /min的升温速率升至950°C碳化Mi ；最后将得到的产品用40wt% 的氢氟酸浸泡过夜以除去模板，然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，100°C干燥至恒重即得到E0MC。将制得的EOMC做透射电子显微镜(TEM)分析，如图1所示，垂直于EOMC孔轴方向可以明显的看到孔道呈有序线性排布，可以看到EOMC的结构具有良好的长程有序性， 而且也证实了 EOMC是SBA-15结构较好的复制品。将800mg EOMC加入到90ml 98wt%的硫酸和30ml硝酸混合溶液中，用超声波处理20min后，在60°C水浴中加热搅拌lh，采用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，除去酸液，用去离子水洗涤至弱酸性，最后在60°C下真空干燥，得到酸化的EOMC。用量筒取30ml的粗苯胺(分析纯)，放入蒸馏烧瓶中，再加入少许沸石，用电热套加热，用直形冷凝管进行空气冷却，收集182 183°C的馏分。在常压冰水浴的条件下，采用三电极体系，在30ml 25mM 的ΑΝ/Ο. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合先在-0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈；实验结束后，用0. 5M H2S04和二次蒸馏水反复冲洗工作电极，以除去未聚合的和低聚合度的苯胺。将制得的电聚合苯胺后的EOMC做扫描电子显微镜(SEM)分析，如图2所示，可以明显的看到电聚合苯胺后的EOMC成均勻的颗粒状态，证明苯胺均勻的电聚合在了介孔碳的表面。取4mg酸化的EOMC加入到4mL已配制好的1. Omg/mL的Lac溶液，并在4°C下搅拌Mh以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到EOMC固定化的漆酶。(l)EOMC+Lac/CS/Au电极的制备先将上述制备的复合物与7ml预先配备好的0. 5wt %的CS溶液超声混合5min，以制备0. 6mg/ml的EOMC+Lac/CS溶液；然后用微量移液器取该混合液10 μ L均勻地覆盖在预先处理好的Au电极，室温下静置2h，即得到 EOMC+Lac/C S/Au 电极。O)E0MC+Lac/PAn/CS/Au电极的制备制备过程同上。电极干燥后浸入30ml 25mM 的ΑΝ/Ο. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合。当电极不用时，悬浮在pH = 5.0的PBS溶液中，4°C下保存。将制得的E0MC+Lac/Au电极和E0MC+Lac/PAn/Au电极在邻苯二酚含量为0. 05mM, PH = 5. 0的PBS溶液中分别做CV曲线分析。电化学测试采用三电极测试体系为钼(Pt) 丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以EOMC+Lac/Au电极和EOMC+Lac/ PAn/Au电极为工作电极。结果表明，E0MC+Lac/PAn/Au电极氧化还原峰的峰值电流绝对值高于EOMC+Lac/Au电极的峰值电流，而且(a)中的ΔΕρ = 0. 3168V，而b中的氧ΔΕρ仅有 0.080V，这主要是由于聚苯胺改性介孔碳后，EOMC上的π电子与含有π电子的聚苯胺通过 η-η非共价键作用相结合，提高了介孔碳的电化学活性，降低了底物邻苯二酚的氧化还原反应的过电位，使得邻苯二酚有更多的机会参与反应，而且改善了生物分子漆酶的氧化还原可逆性。电化学测试采用三电极测试体系Pt丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以EOMC+Lac/CS/Au电极和EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极为工作电极，设定工作电压 +0. 45V。在相对饱和甘汞电极电位(SCE)下测定修饰电极的不同浓度邻苯二酚底液中的响应电流，做响应电流-浓度曲线和Lineweave-Burk曲线。如图4与5所示。实施例2将2. 5g环氧树脂溶于8ml无水乙醇中，加入0. 4g固化剂2_乙基_4_甲基咪唑， 搅拌池后，再加入2g SBA-15，充分搅拌10h，使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中， 然后置于真空干燥箱中80°C加热池除去溶剂；将上述制备的混合物在流量为SOmL/min的 N2气氛保护下，以4°C /min的升温速率升至800°C碳化证；最后将得到的产品用40wt%的氢氟酸浸泡过夜以除去模板，然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，80°C干燥至恒重即得到E0MC。将制得的EOMC做透射电子显微镜(TEM)分析，如图1所示，垂直于EOMC孔轴方向可以明显的看到孔道呈有序线性排布，可以看到EOMC的结构具有良好的长程有序性，而且也证实了 EOMC是SBA-15结构较好的复制品。将800mg EOMC加入到70ml 98wt%的硫酸和20ml硝酸混合溶液中，用超声波处理IOmin后，在50°C水浴中加热搅拌lh，采用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，除去酸液，用去离子水洗涤至弱酸性，最后在50°C下真空干燥，得到酸化的E0MC。用量筒取30ml的粗苯胺(分析纯)，放入蒸馏烧瓶中，再加入少许沸石，用电热套加热，用直形冷凝管进行空气冷却，收集182 183°C的馏分。在常压冰水浴的条件下，采用三电极体系，在30ml 25mM 的ΑΝ/0. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合先在-0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈；实验结束后，用0. 5M H2S04和二次蒸馏水反复冲洗工作电极，以除去未聚合的和低聚合度的苯胺。将制得的电聚合苯胺后的EOMC做扫描电子显微镜(SEM)分析，如图2所示，可以明显的看到电聚合苯胺后的EOMC成均勻的颗粒状态，证明苯胺均勻的电聚合在了介孔碳的表面。取^ig酸化的EOMC加入到3mL已配制好的1. Omg/mL的Lac溶液，并在3°C下搅拌20h以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到EOMC固定化的漆酶。(1)EOMC+Lac/CS/Au电极的制备先将上述制备的复合物与7ml预先配备好的0. 5wt %的CS溶液超声混合5min，以制备0. 6mg/ml的EOMC+Lac/CS溶液；然后用微量移液器取该混合液10 μ L均勻地覆盖在预先处理好的Au电极，室温下静置2h，即得到 E0MC+Lac/C S/Au 电极。O) EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极的制备制备过程同上。电极干燥后浸入30ml 25mM 的ΑΝ/0. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合。当电极不用时，悬浮在pH = 5.0的PBS溶液中，4°C下保存。将制得的E0MC+Lac/Au电极和E0MC+Lac/PAn/Au电极在邻苯二酚含量为0. 05mM, PH = 5. 0的PBS溶液中分别做CV曲线分析。电化学测试采用三电极测试体系为钼(Pt) 丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以EOMC+Lac/Au电极和EOMC+Lac/ PAn/Au电极为工作电极。结果表明，E0MC+Lac/PAn/Au电极氧化还原峰的峰值电流绝对值高于EOMC+Lac/Au电极的峰值电流，而且(a)中的ΔΕρ = 0. 3168V，而b中的氧Δ Ep仅有 0.080V，这主要是由于聚苯胺改性介孔碳后，EOMC上的π电子与含有π电子的聚苯胺通过 η-η非共价键作用相结合，提高了介孔碳的电化学活性，降低了底物邻苯二酚的氧化还原反应的过电位，使得邻苯二酚有更多的机会参与反应，而且改善了生物分子漆酶的氧化还原可逆性。电化学测试采用三电极测试体系Pt丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以EOMC+Lac/CS/Au电极和EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极为工作电极，设定工作电压 +0. 45V。在相对饱和甘汞电极电位(SCE)下测定修饰电极的不同浓度邻苯二酚底液中的响应电流，做响应电流-浓度曲线和Lineweave-Burk曲线。如图4与5所示。实施例3将2. 5g环氧树脂溶于12ml无水乙醇中，加入0.6g固化剂2-乙基-4-甲基咪唑， 搅拌池后，再加入2g SBA-15,充分搅拌15h，使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中，然后置于真空干燥箱中100°C加热证除去溶剂；将上述制备的混合物在流量为lOOmL/min的 N2气氛保护下，以6°C /min的升温速率升至1000°C碳化他；最后将得到的产品用40wt% 的氢氟酸浸泡过夜以除去模板，然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，100°c干燥至恒重即得到E0MC。将制得的EOMC做透射电子显微镜(TEM)分析，如图1所示，垂直于EOMC孔轴方向可以明显的看到孔道呈有序线性排布，可以看到EOMC的结构具有良好的长程有序性， 而且也证实了 EOMC是SBA-15结构较好的复制品。将800mg EOMC加入到IOOml 98wt %的硫酸和50ml 68wt %的硝酸混合溶液中，用超声波处理15min后，在60°C水浴中加热搅拌2h，采用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤，除去酸液，用去离子水洗涤至弱酸性，最后在60°C下真空干燥，得到酸化的E0MC。用量筒取30ml的粗苯胺(分析纯)，放入蒸馏烧瓶中，再加入少许沸石，用电热套加热，用直形冷凝管进行空气冷却，收集182 183°C的馏分。在常压冰水浴的条件下，采用三电极体系，在30ml 25mM 的ΑΝ/0. 5Μ H2S04电解液中进行电聚合先在-0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈；实验结束后，用0. 5M H2S04和二次蒸馏水反复冲洗工作电极，以除去未聚合的和低聚合度的苯胺。将制得的电聚合苯胺后的EOMC做扫描电子显微镜(SEM)分析，如图2所示，可以明显的看到电聚合苯胺后的EOMC成均勻的颗粒状态，证明苯胺均勻的电聚合在了介孔碳的表面。取4mg酸化的EOMC加入到4mL已配制好的1. Omg/mL的Lac溶液，并在4°C下搅拌Mh以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到EOMC固定化的漆酶。(1)EOMC+Lac/CS/Au电极的制备先将上述制备的复合物与7ml预先配备好的0. 5wt %的CS溶液超声混合5min，以制备0. 6mg/ml的EOMC+Lac/CS溶液；然后用微量移液器取该混合液10 μ L均勻地覆盖在预先处理好的Au电极，室温下静置2h，即得到 E0MC+Lac/C S/Au 电极。O) EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极的制备制备过程同上。电极干燥后浸入30ml 25mM的ΑΝ/0. 5M H2S04电解液中进行电聚合。当电极不用时，悬浮在pH = 5.0的PBS溶液中，4°C下保存。将制得的EOMC+Lac/Au电极和EOMC+Lac/PAn/Au电极在邻苯二酚含量为0. 05mM, PH = 5. 0的PBS溶液中分别做CV曲线分析。电化学测试采用三电极测试体系为钼(Pt) 丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以EOMC+Lac/Au电极和EOMC+Lac/ PAn/Au电极为工作电极。结果表明，EOMC+Lac/PAn/Au电极氧化还原峰的峰值电流绝对值高于EOMC+Lac/Au电极的峰值电流，而且(a)中的ΔΕρ = 0. 3168V，而b中的氧Δ Ep仅有 0.080V，这主要是由于聚苯胺改性介孔碳后，EOMC上的π电子与含有π电子的聚苯胺通过 η-η非共价键作用相结合，提高了介孔碳的电化学活性，降低了底物邻苯二酚的氧化还原反应的过电位，使得邻苯二酚有更多的机会参与反应，而且改善了生物分子漆酶的氧化还原可逆性。电化学测试采用三电极测试体系Pt丝(直径为Imm)为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以E0MC+Lac/CS/Au电极和EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极为工作电极，设定工作电压 +0. 45V。在相对饱和甘汞电极电位(SCE)下测定修饰电极的不同浓度邻苯二酚底液中的响应电流，做响应电流-浓度曲线和Lineweave-Burk曲线。如图4与5所示。结果表明，EOMC+Lac/PAn/CS/Au传感器对邻苯二酚的线性检测范围是0. 55 10. 45 μ Μ，选择灵敏度为0. 08314A/M(n = 19)，EOMC/PAn修饰的漆酶电极的选择灵敏度很高，而这说明经聚苯胺改性后的介孔碳的线性范围明显扩大，这是由于在介孔碳的外围包覆了一层易于底物扩散的聚苯胺膜，使之能够更好的固定酶，使得该传感器的稳定性增加。 从l/l-l/c图中所得直线的斜率和截距即可得到EOMC+Lac/PAn/CS/Au电极的表观米氏常数K:为11. 5327 μ Μ。检测限可由公式3 σ b/m求得，m指1/I-1/C图中直线斜率的倒数， σ b指一定信噪比下空白信号的标准偏差，因此计算得出构建的N-OMC+Lac/PVA/Au漆酶传感器对邻苯二酚的检测限分别为0. 173 μ M(S/N = 3)。以上实施例仅是为说明本发明而所举，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代和变换，均在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器，其特征在于在介孔碳的外围包覆一层聚苯胺膜，能够更固定酶以及EOMC+Lac和EOMC+Lac/PAn修饰金电极。
2.权利要求1所述的漆酶生物传感器的制备方法，其特征是介孔碳的外围包覆一层易于底物扩散的聚苯胺膜的制备方法步骤为将2. 5g环氧树脂溶于8-lOml无水乙醇中，加入 0. 4-0. 6g固化剂2-乙基-4-甲基咪唑，搅拌2-3h后，再加入2g SBA-15,充分搅拌10_15h， 使聚合物溶液充分分散于介孔硅SBA-15中，然后置于真空干燥箱中80-100°C加热3- 除去溶剂；将所得产品在流量为SO-lOOmL/min的N2气氛保护下，以4_6°C /min的升温速率升至800-1000°C碳化5- ；最后，将得到的产品用30-50wt%的氢氟酸浸泡过夜以除去模板， 然后再过滤，分别用乙醇、去离子水洗涤，80-100°C干燥至恒重即得到EOMC ；采用三电极体系，在30ml 25mM的AN/0. 5MH2S04电解液中进行电聚合①先在_0. IV 1. 3V范围内扫描两圈至稳定；②然后在-0. IV 0. 9V，扫描速率50mv/s的条件下扫描25圈。
3.如权利要求1所述的聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器，其特征在于聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶的制备方法是取^ig酸化的EOMC加入到3-4mL已配制好的0. 5-1. 0mg/mL的Lac溶液，并在3_5°C下搅拌20-2 以保证酶的充分固定于载体材料上；离心分离，去除上层清液后得到EOMC固定化的漆酶。
4.如权利要求1所述的漆酶生物传感器，其特征是EOMC+Lac/PAn修饰金电极的制备方法是用粒径均勻的Al2O3粉将Au电极在麂皮上打磨抛光，经二次蒸馏水冲洗、超声后，置于 pH为5. 0的PBS溶液中经循环伏安扫描活化10圈；再将7ml的0. 5wt%的CS溶液超声混合5min，以制备0. 6mg/ml的EOMC+Lac/CS溶液；然后用微量移液器取该混合液10 μ L均勻地覆盖在预先处理好的Au电极，室温下静置2h，即得到EOMC+Lac/CS/Au电极。
5.如权利要求1所述的漆酶生物传感器的应用，其特征在于可用于环境保护方面检测 /监测有毒物质的电子设备中。
全文摘要
本发明涉及聚苯胺改性有序介孔碳固定化漆酶生物传感器及制备方法；在介孔碳的外围包覆一层聚苯胺膜，能够更固定酶以及EOMC+Lac和EOMC+Lac/PAn修饰金电极。本发明经聚苯胺改性的EOMC固定化漆酶修饰的金电极能显示出良好的直接电化学行为，在室温25±2℃，pH＝5.0的磷酸盐缓冲溶液，工作电压为+0.45V vs SCE的实验条件下，EOMC/PAn+Lac/Au电极相比未经聚苯胺改性的EOMC+Lac/Au电极表现了更好的传感性能，其对邻苯二酚的线性检测范围是0.55～10.45μM，选择灵敏度为0.08314A/M(n＝19)，表观米氏常数值为11.5327μM，检测限为0.173μM(S/N＝3)；此外，该漆酶传感器还表现出良好的重复性和稳定性。因此，聚苯胺改性介孔碳有望成为一种固定漆酶的复合材料，为介孔碳改性固定化酶提供了新思路。
文档编号G01N27/327GK102253096SQ20111018402
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者侯红帅, 吴湘锋, 许鑫华, 路会冉, 郭美卿 申请人:天津大学