专利名称：一种基于量子点的免疫荧光检测氯霉素的方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于量子点的免疫荧光检测氯霉素的方法及专用试剂盒。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止用。针对氯霉素在我国一再滥用的状况，我国在《动物性食品兽药残留规定》中也规定可食部分不得检出，并且在出口的日常检测中，将其列为必检项目，一旦发现超标，一律禁止出口。目前，用于氯霉素残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高。基于竞争性酶联免疫反应原理的ELISA方法不需进行复杂的样品前处理过程，检测时间相对短，但其精度不够，只能用于定性筛查，无法用于定量确证。当前出口水产品等农产品中检测氯霉素残留及其污染状况调查的样品数量大，任务重，花费高，检测周期过长。因此，急需检测结果稳定、 快速、经济的标准方法。量子点(Quantum Dots, QDs)标记材料是近年来发展起来的一类新型材料，包括 II-VI族和III-V族半导体纳米晶。由于量子点突出的发光和吸收特性，使其具有荧光寿命长、宽激发光谱、窄发射光谱、可精确调谐的发射波长、很高的光化学稳定性、可进行多色标记等优越特性，采用其作为标记材料，可实现对靶标分子的超微量检测。由于适用于免疫诊断试剂的量子点标记材料必须满足量子产率高、荧光强、生物相容性好、高度稳定及成本低等要求，而现行国外商业化的量子点其量子产率多在40%以下，其尺寸偏小，需要用激光光学仪器来照射激发，目前仅能应用在细胞免疫荧光检测和流式细胞检测和分选等方面，因此国际市场上还没有量子点免疫检测试剂问世。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测氯霉素的免疫荧光检测试剂盒。本发明所提供的用于检测氯霉素的免疫荧光检测试剂盒，包括氯霉素包被原和量子点标记的氯霉素抗体。上述试剂盒中，所述氯霉素抗体为抗体效价为IO6以上(具体为IO6)、抗体亲和常数为IO6 IOi1或IO7 IOi1或IO8M4的氯霉素单克隆抗体；具体为抗体效价为106、抗体亲和常数为IO8M-1的氯霉素单克隆抗体，所述氯霉素单克隆抗体购自云南大学单克隆抗体工程技术中心，产品目录号为CAP-OO1。所述量子点为表面羧基含量为IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%或50 70%或60% ；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是 620nmo
上述任一所述试剂盒中，所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，具体为10 20% 之间，再具体为15% ；上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的氯霉素抗体中，所述量子点上的羧基与所述氯霉素抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述氯霉素抗体连接。上述任一所述试剂盒中，所述氯霉素包被原为氯霉素与载体蛋白的偶联物，其中所述氯霉素与所述载体蛋白通过氯霉素中引入的羧基与载体蛋白中的氨基形成的肽键而连接；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白原和兔和鸡的丙种球蛋白中的任一种。上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中还包括氯霉素标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述氯霉素标准品为D-苏式_(-)-N-[(-(羟基甲基)-(_羟基-对硝基苯乙基]-2，2-二氯乙酰胺；所述稀释液为PBS缓冲液；具体为0. 02M、pH7. 4的PBS缓冲液。所述洗涤液为PBST缓冲液；具体按照如下方法制备取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 NaN3溶于所述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；具体为0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；所述用于包被的蛋白为BSAjP 清蛋白和血蓝蛋白中的任一种。具体按照如下方法制备将IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。上述任一所述试剂盒中，所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述D-苏式-(-)-N-[(-(羟基甲基)-(-羟基-对硝基苯乙基]_2，2- 二氯乙酰胺稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10ug/L。上述任一所述试剂盒中，所述氯霉素包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上， 包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述氯霉素包被原得到10yg/ml的包被液，每孔中加 100 μ 1。上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的氯霉素抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的氯霉素抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中氯霉素的方法。本发明所提供的检测样品中氯霉素的方法，包括如下步骤用上述任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样、饲料、蜂蜜或牛奶样本。所述待测样品具体为猪尿。本发明检测方法的原理采用量子点作为荧光信号标记分子，将氯霉素抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入氯霉素标准品或检测样品，以及量子点标记的氯霉素抗体，使其形成抗原-抗体二元发光免疫复合物，用荧光检测仪激发并检测该免疫荧光复合物的荧光强度，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测氯霉素的浓度。抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的氯霉素抗体后，包被的氯霉素抗原与检测样品中的氯霉素竞争性地结合氯霉素抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。
抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是同时加入量子点标记的氯霉素抗体及检测样品后，包被在聚苯乙烯微孔中的氯霉素抗原与检测样品中的氯霉素竞争性地与氯霉素抗体结合，其中与检测样品结合剩余的氯霉素抗体与包被在微孔板中的氯霉素抗原发生特异结合后形成固定在微孔板中的抗原-抗体二元免疫复合物。本发明的氯霉素免疫荧光检测试剂与量子点标记的免疫荧光检测技术相关，是采用量子点作为荧光信号标记材料，进行免疫荧光定量测定的一类方法，该技术整合了荧光量子点纳米材料化学合成、表面修饰及标记技术、间接竞争式免疫检测技术等相关领域的研究。本发明之所以能检测氯霉素，在于采用了一种基于量子点标记的免疫荧光定量测定的方法，即将氯霉素抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子点标记的间接竞争免疫荧光检测法的测定原理，在加入氯霉素标准品或检测样品，以及量子点标记的氯霉素抗体后，通过检测结合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对氯霉素的检测结合到聚苯乙烯板微孔的量子点标记抗体的数量不同，所产生的荧光强度也不同。在一定浓度范围内荧光强度值的高低与样品中的氯霉素的含量成反比。通过添加不同浓度的氯霉素标准品可制成标准曲线，根据此标准曲线查询各检测样品的荧光强度值可得到对应的氯霉素药物的浓度值。其具体的技术步骤包括(一 )荧光量子点标记探针的制备采用适合的水溶性荧光量子点，活化其表面的羧基后，采用化学偶联的方式将氯霉素抗体定向连接到量子点表面。(二)包被抗原采用与牛血清白蛋白偶联的氯霉素抗原作为包被抗原，通过物理吸附的方法将此抗原直接包被于聚苯乙烯板微孔中。(三)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成于上述包被好的聚苯乙烯板微孔中加入氯霉素标准品或检测样品，以及量子点标记的氯霉素抗体，吸附在孔内的氯霉素抗原与标准或样品中的氯霉素竞争性的与氯霉素抗体相结合，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元发光免疫复合物。(四)定量荧光检测采用荧光酶标仪激发并检测上述所形成的抗原-抗体荧光免疫复合物的荧光强度；激发波长345nm ；发射波长620nm ；通过测定系列对应标准品的荧光强度形成标准曲线，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测氯霉素的浓度。所述抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的氯霉素抗体后，包被的氯霉素抗原与标准或样品中的氯霉素竞争性地结合氯霉素抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物，其上标记的量子点经激发后可发荧光， 本发明使用的激发光波长是345nm，发射波长是620nm，得到发红光的抗原-抗体免疫复合物。所述荧光强度的检测是用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体二元发光免疫复合物的荧光强度，由于所采用的抗体是固定浓度的，通常待测样品中的氯霉素药物的浓度越高，被抗体捕获的药物量越多，与包被的氯霉素抗原结合的抗体越少，测得的荧光强度值越低。由于量子点在与抗体进行偶联中要用超速离心进行分离纯化，粒径太小的量子点如Snm和IOnm的无法离心，偶联后无法纯化，使用效果较差；粒径太大的量子点如60nm以上的比较容易聚集，用在试剂盒上均一性较差。所述量子点的粒径为10 20nm，所述粒径具体为13 20nm，所述粒径尤其优选为20nm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，较好为10 20%之间，优选15%。量子点的荧光量子产率及其荧光强度直接决定了检测灵敏度及其准确性的高低， 传统方法制备的量子点的荧光量子产率通常都低于40%，荧光强度较弱。为提高其灵敏度及准确性，所述量子点的量子产率为40 70%，所述量子点的荧光量子产率具体为50 70%，所述量子点的荧光量子产品尤其优选为60%。为用于氯霉素残留物检测，量子点表面需带有易于与氯霉素抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优化的基团是带羧基的表面官能团，通常采用化学方法连接抗体，即用EDC和NHS活化量子点后，再与抗体发生羧合反应而完成偶联反应。在将氯霉素抗体和量子点以肽键共价结合形成的聚合体前，还包括活化所述量子点表面官能团的步骤。量子点表面的羧基含量不同会影响到检测的灵敏度，为提高灵敏度， 所述官能团具体为羧基，所述羧基的含量为ι χ IO-3 9 X 10-3mmol/mg,所述羧基的含量具体为1 X 10_3 6 X 10_3mmol/mg，所述羧基的含量尤其优选为5 X 10_3mmol/mg。在免疫检测中，抗体的性能指标对于检测的准确性至关重要，通常而言，特异性强、亲和力高的抗体，可以显著地提高检测的准确性。研究发现，为提高灵敏度，所述氯霉素抗体亲和常数为IO6 IO8M-1 ；所述氯霉素抗体亲和常数具体为IO7 IO8M-1 ；所述氯霉素抗体亲和常数尤其优选为IO8MA由于氯霉素是小分子物质，其分子表面特性不利于与聚苯乙烯微孔板的直接结合，需要将其与载体蛋白进行偶联后才能借助于载体蛋白的表面特性而达成与聚苯乙烯微孔板的良好结合。可用作载体蛋白的有各种动物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，还有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白 (Ovalbumin,OVA)、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白。研究发现，BSA理化性质稳定，赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的PH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂(如吡啶、DMF等)的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态，是作为载体蛋白的极佳选择，故本发明选用BSA作为偶联蛋白。本发明通过对荧光量子点、氯霉素抗原和氯霉素抗体分子特性的研究，通过对各种水溶性荧光量子点制备、包覆及表面修饰条件的优化，选择适合的水溶性荧光量子点与特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得功能性的荧光量子点标记探针，并通过优化竞争性免疫反应的各种条件，达到对氯霉素残留药物的快速和高灵敏定量测定。实验证明，本发明试剂盒的灵敏度高、特异性好、准确度高。本发明方法能实现对氯霉素残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在氯霉素的检测领域具有广阔的应用前景。
图1水溶性Cdk/ZnS荧光量子点电镜(TEM)照片。图2用量子点标记的间接竞争免疫荧光法检测氯霉素的标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测试剂盒的组成及制备氯霉素购自北京恒元启天化工技术研究院，产品目录号为^57GBW(E)060907。其化学名称为D-苏式-(-)-N-[(-(羟基甲基)-(-羟基-对硝基苯乙基]-2，2- 二氯乙酰胺。1、氯霉素包被原氯霉素与载体蛋白BSA的偶联物，氯霉素分子上有羟基，可据此引入羧基，再与 BSA通过氯霉素中的羧基与BSA中的氨基形成的肽键而连接。CAP-BSA抗原的合成采用重氮化法，具体步骤如下1)取50mg氯霉素溶解于Iml无水乙醇溶液中，用lmol/L HCl调PH至1. 0，然后加入锌粉65°C反应40分钟，得到反应液a ；2)反应液a离心(离心的时间为lOmin、离心的离心力为4000g，离心的温度为 40C )，取上清液，用lmol/L HCl调pH至1. 0，于4°C逐滴加入180ul浓度为1. 45mol/L的 NaNO2水溶液，充分搅拌反应池，得到溶液b ；3)在 IOml 0. 02mol/L, pH 为 7. 4 的 PBS 中力口入 400mg BSA (Sigma-aldrich, 85041C)配制成40g/L的BSA-PBS溶液(溶液c)，4)将Iml步骤2)所得溶液b中加入BSA-PBS溶液10ml，用2mol/l NaOH调节至 PH至8. 5，于4°C下进行耦合反应Mi ；得到反应液d ；5)将反应液d于0. 02mol/L, pH为7. 4的PBS中透析48h，每12h更换一次透析液。所得产品用冻干机冻干，于-20°C保存，得到氯霉素抗原。2、氯霉素包被原的包被采用包被缓冲液将氯霉素包被原稀释为浓度10μ g/ml的包被液，在96孔聚苯乙烯微孔板条中每孔各加100 μ 1，于4°C冰箱放置过夜。第二天弃去包被液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，各孔加入200 μ 1封闭液，于37°C封闭处理池。之后弃去封闭液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，进行真空抽干、用铝箔袋密封后放置于-20°C保存。3、量子点标记的氯霉素抗体氯霉素抗体为效价为106、亲和常数为IO8M4的氯霉素单克隆抗体，其购自云南大学单克隆抗体工程技术中心，产品目录号为CAP-001。量子点购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为TLS LumiQD 20。该量子点的表征如下粒径为20nm、粒径的CV为15%，量子产率为60%，表面羧基含量为 5X 10-3mmol/mg，水溶性，CdSe/SiS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm ；红色荧光量子点。量子点的扫描图如图2所示。所述量子点标记的氯霉素抗体中，所述量子点上的羧基与所述氯霉素抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述氯霉素抗体连接。量子点标记方法是1)取2. 5mg的上述量子点用0. IM的MES缓冲液(称取1. 066g MES,0. 45g NaCl 溶于50ml纯水，调pH至4. 7)洗涤并用20000rpm离心富集去上清后，用Iml浓度为0. 1M、 PH值为4. 7的MES缓冲液重悬，加入0. 96mg (终浓度为5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1. 15mg (终浓度为IOmM) N-羟基丁二酰亚胺(NHS)于其中。反应温度为37°C，反应半小时后，得到活化后的量子点；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂缓冲液洗涤，取0. 15mg氯霉素单克隆抗体和2. 5mg 活化后量子点混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂缓冲液(称取1. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于 IOOml纯水，调pH至8. 5)中充分混勻。室温(25°C )下反应3. 5小时，让抗体和量子点形成稳定的肽键共价结合，得到含有偶联后量子点的反应液；3)反应结束后，向步骤2)得到的反应液中加入终浓度为5% (质量百分含量)的 BSA(Sigma-Aldrich,85041C)对剩余活性氨基位点进行封闭，反应在37°C下进行0. 5小时， 得到含有封闭后量子点的反应液；完成后，用pH = 7. 4的0. 02M PBS缓冲液(称取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 纯水，调 pH 至 7. 4)洗涤，20000rpm 离心
富集去上清，重悬后4°C保存待用，得到量子点标记氯霉素抗体。4、氯霉素标准品用稀释液将氯霉素稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005、
0.0U0. 05、0· 1、0. 5、l、5、10ug/L ；5、稀释液0. 02M、ρΗ7· 4 的 PBS 缓冲液；配制称取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H2O 和 8. 77g NaCL 溶于 IL 纯水，调 pH 至 7. 4。6、洗涤液=PBST缓冲液；取0. 2ml Tween20及0. Ig的NaN3溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用上述PBS缓冲液定容至1L。7、包被缓冲液0. 05M、pH9. 6的碳酸盐缓冲液。8、封闭液将IOg BSA和0. 2ml Tween20溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用PBS缓冲液定容至1L。实施例2、标准曲线的制备方法在制备好的氯霉素微孔板条中加入浓度为0、0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、
1、5、10ug/L的氯霉素标准溶液，50ul/孔，将量子点标记ENR抗体用PBS-T稀释液1 50 稀释[即25ug标记抗体5ml稀释液]，每个微孔中加入50ul，室温振荡1小时，洗涤液洗 3次后用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长 620nmo将竞争检测的检测限定为Β0/Β = 1. 2时(B0为0标准样检测值，B为待测样检测值)的竞争药物的质量浓度，根据曲线回归方程确定检测体系的灵敏度。检测结果如下表 1所示，将检出限定为0. 001ug/L。表1氯霉素不同浓度样品的量子点试剂盒检测值
氯·_素浓度(Ugl)00.0010.0050.010.050.10.51510荧光Testl1.72061.52781.36511.22150.96060.75070.50650.28670.09280.0438强度Test21.86241.56511.33881.15470.96380.71310.58790.27860.11660.049权利要求
1.一种用于检测氯霉素的免疫荧光检测试剂盒，包括氯霉素包被原和量子点标记的氯霉素抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素抗体为抗体效价为IO6以上、抗体亲和常数为IO6 IO8M-1的氯霉素单克隆抗体；所述量子点为表面羧基含量为ι χ 10_3 9X 10_3mmol/mg的水溶性Cdk/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40 70%。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述量子点的粒径为10 20nm，其粒径的偏差在10 30%之间；所述氯霉素包被原为氯霉素与载体蛋白的偶联物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括氯霉素标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；所述氯霉素标准品为D-苏式-(-)-N-[(-(羟基甲基)-(-羟基-对硝基苯乙基]_2， 2-二氯乙酰胺；；所述稀释液为PBS缓冲液；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述标准品为如下溶液形式的标准品用所述稀释液将所述D-苏式-(-)-N-[(-(羟基甲基)-(-羟基-对硝基苯乙基]-2，2- 二氯乙酰胺；稀释成如下各个浓度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、 5、10ug/Lo
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述氯霉素包被原得到 10 μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述量子点标记的氯霉素抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中将每25ug所述量子点标记的氯霉素抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。
8.—种检测样品中氯霉素的方法，包括如下步骤用权利要求1-7中任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样、饲料、蜂蜜或牛奶样本。
全文摘要
本发明公开了一种基于量子点的免疫荧光检测氯霉素的方法及专用试剂盒。本发明提供的用于检测氯霉素的免疫荧光检测试剂盒，包括氯霉素包被原和量子点标记的氯霉素抗体。本发明方法能实现对氯霉素残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在氯霉素的检测领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/577GK102288765SQ20111018930
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者吴峰, 袁航, 马岚 申请人:清华大学深圳研究生院