专利名称：磷化蛋白的电化学免疫传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及LPA-p5315Ab2-CNS纳米复合材料制备方法，以及结合高灵敏的阳极溶出伏安法和纳米载体放大技术测定样品中磷化蛋白ph0Sph0-p5315的浓度。
背景技术：
P53蛋白是调控人体内细胞生长和监控细胞分裂时DNA的复制最重要的分子，它是一种重要的肿瘤抑制基因，能防止癌变，还能帮助细胞基因修复缺陷。但当人体受到紫外光照射或化学致癌物的作用时，P53不能执行上述功能时，对细胞的增殖失去控制，往往就会导致细胞发生癌变。据报道超过一半的人体癌细胞中，肿瘤抑制因子P53蛋白都有不同形式和程度的受损现象。人类的P53蛋白是由393个氨基酸残基组成的，有4个结构域，它的磷酸化过程主要发生在几个丝氨酸残基上。大多数癌症患者的基因突变都发生在P53蛋白的中间部分。据有关的研究报道指出，15号位丝氨酸的磷酸化可作为Y-辐射暴露的潜在生物标志物，受Y射线照射越严重，15号位丝氨酸的磷酸化就越严重，也就是磷化蛋白 ph0Sph0-p5315的浓度越高。因此，磷化蛋白ph0Sph0-p5315可以作为人体受Y -辐射暴露的潜在生物标志物。而现在很少有文献报道检测人体癌细胞中ph0Sph0-p5315的含量，所以发展一种快速、高灵敏的分析方法来检测磷化蛋白ph0Sph0-p5315的含量对癌症患者的早期临床诊断具有十分重要的意义。迄今为止，传统检测磷化蛋白ph0Sph0-p5315的方法是酶联免疫法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。该方法虽然准确，且能实现高通量检测，但是它包含多次温育和洗涤步骤，后续的分光光度检测还需要专门的底物显色剂，而且需要昂贵的仪器、专业的实验室和训练有素的专业技术人员，不利于现场检测以及基层使用的推广普及。所以现在急需发展一种简单、快速、高灵敏度的分析方法实现磷化蛋白 phospho-p5315的快速检测。与ELISA相比，基于电化学检测的免疫技术是一种检测生物标志物的有效方法，它具有操作简单，所需样品量少等优点，结合纳米信号放大技术，可以实现磷化蛋白ph0Sph0-p5315的高灵敏度检测。
发明内容
本发明的目的是为检测磷化蛋白提供一种高灵敏、低成本、简单快速的电化学免疫传感器，即提供一种磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法，本发明的技术方案一种磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法第1步免疫反应分别取25 μ L MPs-PSS15Ab1放置于10个容积1. 5mL的塑料离心管中，然后在上述10个塑料离心管分别加入25 μ L浓度为0. 02ng/mL,0. 05ng/ mL,0. Ing/mL,0. 2ng/mL,0. 5ng/mL,1. Ong/mL,2. Ong/mL,5. Ong/mL,lOng/mL,20ng/mL 的 ph0Sph0-p5315，在磁力搅拌器上搅拌反应50分钟后，磁性分离；用磷酸缓冲溶液(PBS)反复洗涤后，再分别加入50 μ L的LPA-p5315Ab2-CNS，反应40分钟，磁性分离和洗涤3遍。
第2步阳极溶出伏安测定。向离心管中加入10 μ L浓度1.0M盐酸，使1 2+从 LPA的内腔中释放出来；然后加入50 μ L含0. 5mg/L Bi的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液浓度0. 2M，pH为4. 6，混合2分钟之后，磁性分离磁性纳米粒子(MPs)；取50 μ L上层清液滴在印刷电极表面，先在-0. 9V富集2分钟，然后从-0. 9-0. 3V记录SWV曲线，电位增量4mV， 振幅25mV，频率15Hz ；在-0. 56V得到铅离子的溶出伏安峰。通过检测磷酸铅-去铁铁蛋白 (LPA)中包裹的pb2+的阳极溶出信号测定样品中磷化蛋白ph0Sph0-p5315的含量。上述本发明的检测方法步骤1)中，所用的MPs-PSS15Ab1的制备方法将10 μ L羧基化的磁性纳米粒子(MPs)分散于1. OmL pH 5. 2的MES缓冲溶液中， 并加入400mM的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和IOOmM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化30分钟，用磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤，除去过量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入1. OmL浓度为0. 5mg/mL的p5315Ab1; 4°C搅拌过夜，制备得到磁性纳米粒子-磷化蛋白抗体复合物(MPs-PSS15Ab1)。上述本发明的检测方法步骤1)中，所用的LPA-p5315Ab2-CNS纳米载体的制备方法步骤为第1步，磷酸铅-去铁铁蛋白(LPA)的制备40yL浓度为50mg/mL的去铁铁蛋白 (apoferritin)溶液用pH 8. 0摩尔浓度0. IM的Tris-HCl 稀释至2. OmL,然后一边搅拌一边加入250yL浓度6mM的硝酸铅，持续搅拌1小时使得1 2+扩散进入去铁铁蛋白的内腔， 再一滴一滴加入250 μ L浓度为0. 2Μ，pH为7. 0的PBS缓冲液，继续搅拌1小时，让磷酸根离子扩散进入腔，形成稳定的磷酸铅内核；最后加入PBS缓冲液将过量的1 2+沉淀下来；混合液在5000rpm的速度下离心5分钟，弃去下层固体，上层清液就是磷酸铅_去铁铁蛋白 LPA ；第2步，纳米碳球(CNS)功能化首先将5mg的CNS在硝酸中回流10小时，去掉 CNS表面的金属和碳杂质，并且让其表面羧酸化；羧酸化处理后的CNS用水反复洗涤直至pH 为 7.0 ·’3)、离心弃去上层清液，加入1. OmL含有400mM的1_乙基_3_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和IOOmM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的pH 5. 2的磺基脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液(MEQ活化30分钟后，用磷酸缓冲溶液反复洗涤以除去多余的EDC和 NHS ；4)，将上述功能化的CNS重新分散于1. OmL pH 7. 4磷酸缓冲溶液(PBS)中，超声 5分钟，然后加入50 μ L浓度为1. Omg/mL的磷酸铅-去铁铁蛋白和50 μ L浓度为5. 0 μ g/ mL的p5315Ab2，于4°C搅拌过夜，利用CNS表面的羧基与蛋白质和抗体上的氨基反应将 LPA和p5315Ab2固定在CNS表面，以13，OOOrpm离心5分钟，弃去上层清液，即制备得到 LPA-p5315Ab2-CNS 纳米载体。本发明有益效果1、制得了 LPA-p5315Ab2_CNS纳米载体。由于CNS良好的生物兼容性和大的比表面积可以极大的提高信号分子LPA的固定量，而且每一个LPA分子中包裹有大量的此2+，所以该纳米放大技术极大地提高了电化学响应信号。2、建立了阳极溶出峰电流与磷化蛋白ph0Sph0-p5315浓度之间的线性关系。峰电流与其浓度呈良好的线性关系，磷化蛋白ph0Sph0-p5315的线性浓度范围为0. 02 20ngmL—1，检出限为O.Olng mL—1。与ELISA方法相比，基于纳米放大技术的电化学免疫方法的灵敏度提高了 30倍。3、本发明的免疫传感器对磷化蛋白ph0Sph0-p5315有良好的选择性。其它蛋白如 p53, phospho-P5 3 392, phospho_P5346 不干扰检测。4、在血清样品中加入4个不同浓度的ph0Sph0-p5315，应用该免疫方法检测，测定结果见表1。回收率为91.0-110.2%，该方法重现性好。该免疫方法不仅避免了复杂的样品处理过程，而且能够准确检测实际样品中的磷化蛋白含量。对0. 2和2. Ong/mL的 phospho-p53156次重复测定，相对偏差分别为4. 7%和6. 2%。
图1为基于LPA-p5315Ab2_CNS纳米放大技术的电化学免疫检测示意2为免疫反应过程的QCM响应图两次QCM频率降低分别说明phospho-p5315和LPA_p5315Ab2_CNS吸附到 MPs-PSS15Ab1表面，说明抗原抗体的识别能力并没有因为MPs和CNS表面修饰而减弱。图3是磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测对照中=(^i)MPs-Ab1在电极上没有明显的电化学信号，夹心免疫反应完成后， LPA-pSS^Abyphospho-pSS'VMPs-Ab!免疫复合物(b)和 LPA-p5315Ab2-CNS/phospho-p5315/ MPs-Ab1免疫复合物(c)在-0. 53V出现明显的1 2+溶出峰，并且曲线c比曲线b的氧化电流大大提高，这归功于CNS表面负载了大量的LPA，说明该纳米载体放大技术比传统的单标记方法更有利于提高电化学响应信号。图4为不同浓度ph0Sph0-p5315的阳极溶出伏安曲线，插图为校正曲线。电流响应与ph0Sph0-p5315的浓度成正比。图中a :0. 02ng/mL, b :0. 05ng/mL, c :0. Ing/mL, d :0. 2ng/mL, e :0. 5ng/mL, f 1. Ong/mL, g :2. Ong/mL, h :5. Ong/mL phospho_p5315 在含有 0. 5mg/mL Bi 的醋酸缓冲液中的电流响应。
具体实施例方式实施例1磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测向离心管中加入IOyL 1. OM盐酸，使1 2+从LPA的内腔中释放出来；然后加入 50 μ L含0. 5mg/L Bi的醋酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液浓度为0. 2M，pH为4. 6，混合2分钟之后，磁性分离磁性纳米粒子(MPs)；取50 μ L上层清液滴在印刷电极表面，先在-0.9V富集2 分钟，然后从-0. 9-0. 3V记录SffV曲线，电位增量4mV,振幅25mV,频率15Hz ；在-0. 56V得到铅离子的溶出伏安峰。通过检测磷酸铅-去铁铁蛋白(LPA)中包裹的1 2+的阳极溶出信号测定样品中磷化蛋白ph0Sph0-p5315的含量。其实验结果如图3。实施例2在10个1.5mL的塑料离心管中分别加入25 μ L不同浓度(0. 02,0. 05,0. 1,0. 2, 0.5,1.0,2.0,5.0,10, 20ng/mL)的 phospho_p5315。经过免疫反应后形成 LPA_p5315Ab2_CNS/ Phospho-PSS1VMPs-Ab1免疫复合物，再分别进行电化学免疫测定，其实验结果如图4。
权利要求
1.磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法，其特征在于，方法步骤如下1)、免疫反应分别取25μ L MPs-PSS15Ab1放置于10个容积1. 5mL的塑料离心管中，然后在上述10个塑料离心管分别加入25 μ L浓度为0. 02ng/mL,0. 05ng/mL,0. lng/mL，0. 2ng/ mL, 0. 5ng/mL, 1. Ong/mL, 2. Ong/mL, 5. Ong/mL, lOng/mL, 20ng/mL 的 phospho_p5315，在磁力搅拌器上搅拌反应50分钟后，磁性分离；用PBS缓冲溶液反复洗涤后，再分别加入50 μ L的 LPA-p5315Ab2-CNS,反应40分钟，磁性分离和洗涤3遍；2)、阳极溶出伏安测定通过检测步骤1)中磷酸铅-去铁铁蛋白LPA中包裹的1 2+的阳极溶出信号，测定样品中磷化蛋白ph0Sph0-p5315的含量。
2.根据权利要求1所述的磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法，其特征在于，步骤1)中所用的MPs-PSS15Ab1的制备方法将10 μ L羧基化的磁性纳米粒子分散于l.OmL ρΗ 5. 2的磺基脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液中，并加入400mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，和IOOmM 的N-羟基琥珀酰亚胺，活化30分钟，用磷酸缓冲溶液洗涤，除去过量的1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，然后加入1. OmL浓度为0. 5mg/ mL的ρ5315ΑΙν4τ下搅拌过夜，制备得到磁性纳米粒子_磷化蛋白抗体复合物，记为 MPs-PSS15Ab1。
3.根据权利要求1所述的磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法，其特征在于，步骤1)中所用的LPA-p5315Ab2-CNS纳米载体的制备方法步骤为1)、磷酸铅-去铁铁蛋白的制备40μ L浓度为50mg/mL的去铁铁蛋白溶液，用pH 8. O 摩尔浓度0. IM的1Tris-HCl稀释至2. OmL,然后一边搅拌一边加入250 μ L浓度为6mM的硝酸铅，持续搅拌1小时，再一滴一滴加入250 μ L浓度为0. 2Μ，ρΗ为7. 0的PB S缓冲液，继续搅拌1小时，最后加入PB S缓冲液将过量的1 2+沉淀下来；混合液在5000rpm的速度下离心5分钟，弃去下层固体，上层清液就是磷酸铅-去铁铁蛋白LPA ；2)、纳米碳球功能化首先将5mg的纳米碳球在硝酸中回流10小时，去掉纳米碳球表面的金属和碳杂质，让其表面羧酸化；羧酸化处理后的纳米碳球用水反复洗涤直至PH为 7. 0 ；3)、离心弃去上层清液，加入1.OmL含有400mM的1-乙基_3_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，和IOOmM的N-羟基琥珀酰亚胺的ρΗ 5. 2的磺基脂肪酸甲酯钠盐缓冲溶液活化30分钟后，用磷酸缓冲溶液反复洗涤，除去过量的1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺；4)，将上述功能化的纳米碳球重新分散于1.OmL ρΗ为7. 4的磷酸缓冲溶液中，超声5 分钟，然后加入50 μ L浓度为1. Omg/mL的磷酸铅-去铁铁蛋白，和50 μ L浓度为5. 0 μ g/ mL的p5315Ab2，于4°C下搅拌过夜，利用纳米碳球表面的羧基与蛋白质和抗体上的氨基反应将LPA和p5315Ab2固定在纳米碳球表面，以13，OOOrpm离心5分钟，弃去上层清液，即制备得到LPA-p5315Ab2-CNS纳米载体。
4.根据权利要求3所述的磷化蛋白ph0Sph0-p5315的电化学免疫检测方法，其特征在于，在步骤2)中所述的离心弃去上层清液是以13，OOOrpm离心5分钟后，弃去上层清液。
全文摘要
一种磷化蛋白电化学免疫传感器。它以磁纳米-抗体复合物MPs-p5315Ab1为吸附剂分离磷化蛋白，以纳米碳球CNS为载体并在其表面修饰磷酸铅-去铁铁蛋白LPA和磷化蛋白抗体p5315Ab2，制备LPA-p5315Ab2-CNS纳米复合剂，用于检测信号放大。根据夹心免疫分析原理，待测磷化蛋白含量与捕获到的LPA-p5315Ab2-CNS成正比，根据溶出伏安法检测LPA中包裹的铅离子含量来测定样品中磷化蛋白浓度的。此方法优点操作简便，分离简单高效，整个免疫反应在EP管中完成；以CNS为载体引入大量信号分子LPA，每个LPA分子中含有大量的Pb2+，因此提高了检测灵敏度；直接将溶解的Pb2+作为检测信号，无需加入酶底物，为无试剂传感器。本磷化蛋白电化学免疫传感器，磷化蛋白phospho-p5315的线性浓度范围为0.02～20ng mL-1，检出限为0.01ng mL-1。
文档编号G01N33/68GK102253221SQ20111019911
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者杜丹 申请人:华中师范大学