专利名称：一种考马斯亮蓝g250染色方法及其专用染色液和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种考马斯亮蓝的染色方法及其染色液和应用，具体涉及一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用染色液和应用。
背景技术：
双向电泳和质谱(MS)是蛋白质组学研究的最重要的两项技术，经过SDS-PAGE之后，灵敏高效的蛋白染色成为后续蛋白质组学研究的先决条件(Choi et al. 1996 ；Wang et al. 2007a ；Yasumitsuet al. 2010b)。在蛋白分析和检测上，考染、银染和荧光染色是广泛使用在蛋白分析和检测上的三种染色方法(Patton，2000)。在这些方法中，银染是目前公认的除了放射性标记以外的最为灵敏的蛋白检测方法，可以在纳克级水平上检测蛋白(Yan et al. 2000 ；Candiano et al. 2004 ；Yasumitsu et al. 2010b)。但是，银染通常会有相对低的重复性，造成很高的背景，并且由于加入的戊二醛和甲醛会对蛋白进行修饰，导致银染的质谱兼容性能普遍不佳(Candiano et al. 2004 ；Lin et al. 2008)。最近发展以来的荧光染料技术有很高的灵敏性和质谱兼容性(Patton，2000 ;Steinberg et al. 2000 ；Candianoet al. 2004)，但由于荧光染料价格昂贵，且极易淬灭，还需要高端的仪器设备和特殊的分析软件(Patton 2000 ；Steinberg et al. 2000 ；Wang et al. 2007a ；Yasumitsu et al. 2010a)， 限制了该项技术在蛋白质组学领域的广泛应用。因此，在蛋白质组学研究中，考马斯亮蓝染色法(CBB)仍然目前仍然最受欢迎。该法具有良好的重复性、很低的染色背景、良好的灵敏度以及优良的质谱兼容性(Candiano et al. 2004 ；Wang etal. 2007a)。传统的CBB染料包括G-250和R-250，通常只能检测到微克或几百纳克水平的蛋白(Choiet al. 1996 ；Yasumitsu et al. 2010b)。为了提高染色效率，人们最近报道了许多更加灵敏的CBB改进染色方法(Choi et al. 1996 ；Patton 2000 ； Pink et al. 2010 ；Yang et al. 2010 ；Yasumitsu et al. 2010a ；Yasumitsu et al. 2010b)。 几年前，本申请发明人通过改进固定液和敏化液的配方，以及增加R-250浓度，也发明了一种改进的CBB R-250染色方法，能检测到10纳克的BSA条带，有较高的分辨率和很好的MS 兼容性(Wang et al. 2007a ；Wang et al. 2009 ；Wang et al. 2010 ；Wang et al. 2011)。但是，这种染色方法步骤繁琐，耗时较长，限制了其应用范围。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种考马斯亮蓝G250染色液，该染色液集固定液， 敏化液和染色液为一体，其使用CBB G-250做染料，这种染料能彻底的在染色液里溶解，并且染出胶的背景比较轻；其采用磷酸代替了醋酸，提高了染色的灵敏度。本发明的第二个目的在于提供一种利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，该方法除具有较好的重复性、很低的染色背景外，该检测方法快速灵敏，检测到的蛋白点数目比较多；有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；应用范围比较广泛，能广泛的用在哺乳动物和植物组织中。
本发明的最后一个目的在于提供上述利用考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术手段来实现的一种考马斯亮蓝G250染色液，含有以下组分质量体积浓度为0. 1-0. 2%的CBB G-250，质量体积浓度为5-15%的硫酸铵，体积百分含量为3-8%的磷酸，体积百分含量为20-40%的乙醇，体积百分含量为 5-20%的甲醇。优选的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0. 12-0. 13%,所述的硫酸铵的质量体积浓度为8-12%，所述的磷酸的体积百分含量为4-6%，所述的乙醇的体积百分含量为20-30%，所述的甲醇的体积百分含量为10-15%。最佳的，本发明所述的CBB G-250的质量体积浓度为0. 125%，所述的硫酸铵的质量体积浓度为10%，所述的磷酸的体积百分含量为5%，所述的乙醇的体积百分含量为 30%，所述的甲醇的体积百分含量为10%。本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的一种利用上述考马斯亮蓝 G250染色液进行染色的方法，含有以下步骤将SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝G250染色液中，进行染色，再将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，振荡脱色直到背景干净为止。在上述染色方法中本发明所述的SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250中前先置于ddH20 (双蒸水)中振荡2-lOmin。本发明利用上述考马斯亮蓝染色液G250进行染色的时间优选为3-Mh。本发明所述的脱色液优选为含有体积百分含量为20-40%的乙醇和体积百分含量为1-10%的乙酸。本发明振荡脱色的时间为2_池。本发明所述的SDS-PAGE胶优选为单向胶，其含有质量百分含量优选为10_15%的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量优选为1-5%的聚丙烯酰胺浓缩胶；或所述的SDS-PAGE 胶优选为双向胶，其含有质量百分含量优选为10-15%的聚丙烯酰胺分离胶。本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的利用考马斯亮蓝染色液 G250进行染色的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明染色液使用CBB G-250做染料，它能彻底的溶解，并且染出胶的背景比较轻；(2)本发明染色液用磷酸代替了醋酸，提高了染色的灵敏度；(3)使用本发明染色方法可以减少整个染色过程的时间，它把固定，敏化和染色放在一起进行，简化了染色步骤；(4)使用本发明染色方法，检测到的蛋白点数目比较多(5)使用本发明染色方法有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；(6)本发明染色方法应用范围比较广泛，能广泛的用在哺乳动物和植物组织中；(7)本发明方法在蛋白质组学的研究中发挥着重要作用，应用前景广阔。
图Ia是实施例1中通过牛血清蛋白BSA检测几种常规CBB染色法和本发明染色法的灵敏度；图Ib是实施例1中通过牛血清蛋白BSA检测几种常规CBB染色法和本发明染色法的灵敏度；图2是实施例2中不同的CBB染色后胶乳和木薯块根的2_DE图谱比较图，其中 从胶乳C-乳清里获得1200微克蛋白，上样到Mcm胶上，每个至少做了 3个重复，得到的凝胶通过 CBR (A)，GAP (B)，GPP (C)，RAP (D)和 RAM (E)染色或 RAM 脱色，通过 GAP 重新染(F)。 从木薯中获得的1200微克蛋白，上样到Mcm胶上，每个至少做了 3个重复，得到的凝胶通过GRP (G)，GPP⑴或RAM⑷观察，然后脱干净，紧接着通过GAP重新染6个小时(H，J，K， 箭头标的是做MS鉴定的点)；图3是实施例2中通过MALDIT0F/T0F MS鉴定出来的特殊蛋白点，其中蛋白点1被切除，用胰蛋白酶酶解通过MALDI-T0F/T0F分析，肽指纹图谱(PMF)光谱峰代表不同肽段的强度，序列下面划线的部分和非划线的部分分别代表匹配的和非匹配的肽段数，匹配的肽段数下面进一步做MALDI TOF-TOF MS/MS，并且注释了母离子光谱，使用Mascot software 搜索NCBInr数据库鉴定出来的目标蛋白是来自于橡胶树的小橡胶粒子(SRPP)；图如是实施例2中人类癌细胞蛋白凝胶GAP染色后的2-DE图谱，其中使用BPP 法提取人类癌细胞的蛋白，1200微克蛋白在Mcm，pH 4-7的胶条上分离，并通过GAP染色3 小时；在癌细胞㈧蛋白的双向电泳胶上检测到沈80士 112(n = 3)个蛋白点；图4b是实施例2中小鼠肾脏蛋白凝胶GAP染色后的2_DE图谱，其中使用BPP法提取生长9天的小鼠肾脏的蛋白，1200微克蛋白在Mcm，pH 4_7的胶条上分离，并通过GAP 染色3小时；在小鼠肾脏⑶蛋白的双向电泳胶上检测到1950 士 65 (n = 3)个蛋白点。
具体实施例方式实施例1本实施提供的考马斯亮蓝染色液含如下组分质量体积浓度为0. 125%的CBB G-250，质量体积浓度为10%的硫酸铵，体积百分含量为5%的磷酸，体积百分含量30%的乙醇和体积百分含量10%的甲醇，各溶液采用ddH20配制，其具体配制过程如下(1)将 300mL 乙醇，IOOmL 甲醇和 IOOmL ddH20 混合在一起；(2)称取1. 25g CBB G-250，并且把它加入到(1)混合后的溶液中；(3)将⑵中得到的溶液放在摇床上，设转速为150rpm，温度为37°C摇一个小时以上，保证CBBG-250完全溶解，然后放在室温备用，称此溶液为CBB-A液；(4)称取IOOg硫酸铵，加入300mLddH20，待硫酸铵完全溶解；(5)向⑷中得到的溶液中加入58. 8mL体积百分含量为85%的磷酸，用ddH20定容到500mL，称此溶液为CBB-B液；(6)使用前把500mL的CBB-A液和500mL的CBB-B液混合即可。本实施提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法，具体包括以下步骤
(1)将SDS-PAGE胶置于ddH20中摇5分钟； (2)将SDS-PAGE胶转移至上述染色液中，染色三个小时以上或者过夜；
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(3)将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，震荡脱色2_3个小时，直到背景干净为止；其中脱色液包括体积百分含量为30%的乙醇和体积百分含量为5%的乙酸水溶液。上述(3)中的SDS-PAGE胶指分离胶为质量百分含量为12. 5%聚丙烯酰胺和浓缩胶为质量百分含量为4%聚丙烯酰胺(Laemmli 1970)。以下通过牛血清蛋白(BSA)对GAP的灵敏度进行检测的，牛血清蛋白(BSA)被上样到8. 3cm宽，7. 3cm长和0. 75mm厚的胶上，上样量分别为IOOng, 80ng, 50ng, 40ng, 30ng, 20ng，IOng, 5ng，4ng, 2ng, lng，0. 5ng 和 0. Ingo 用 CBR 染色后如图 1 所示，66. 2kD 的目标蛋白条带的强度随着100到0. Ing逐渐减弱(图la，A_D)，用CBR(图la，B)和GPP (图la， Α)染色后，发现它们的灵敏度一样，都能检测到10-5ng的牛血清蛋白(BSA)。其中GAP 本发明所述的考马斯亮蓝G-250染色法；其中RAP 把GAP染色液中的CBB G-250换成了 CBB R-250，其它成分不变；改进的CBB染色法包括CBR，GPP和RAP染色方法，具体如下其中CBR来自(Wang et al. 2007a)的染色方法，CBR的染色步骤为(1)将SDS-PAGE凝胶于固定液(10 %乙酸、10 %甲醇、40 %无水乙醇)中固定 40min ；(2)将凝胶转入敏化液(1 %乙酸、10%硫酸铵)中敏化50min ；(3)敏化结束后，将SDS-PAGE凝胶用纯水或蒸馏水漂洗一下，转入染色液 (0. 125% CBB-R250、5%乙酸、45%无水乙醇)中染色过夜(至少6h以上)；(4)染色完后，SDS-PAGE凝胶用纯水或蒸馏水漂洗一下，转入脱色液I (5%乙酸、 40%无水乙醇)中脱色约30min ；(5)再转入脱色液II (30%乙酸、30%无水乙醇)中脱色约40min ；(6)将凝胶转入保存液(5% 7%乙酸)中长时间浸泡。其中GPP来自(Pink et al. 2010)的染色方法，该方法的染色步骤(1)将SDS-PAGE凝胶转入固定液(体积百分含量为30%乙醇和体积百分含量为 2%磷酸)中固定40min ；(2)用纯水漂洗一下2-DE凝胶，转入染色液(5%硫酸铝，10%无水乙醇，0. 02% CBB-G250和8%磷酸)中染色过夜；(3)纯水漂洗(1)中凝胶后，转入脱色液磷酸和10%无水乙醇)中脱色Ih ；(4)转入保存液(5% 7%乙酸)中长时间浸泡，以脱净杂色。RAM来自(Yasumitsu et al. 2010a)的染色方法，该方法染色步骤为(1)凝胶在ddH20中漂洗三次，每次约5min ；(2)凝胶置于RAMA染液(0.05% CBB R250，10%乙酸，15%甲醇和3%硫酸铵)中染色约2-3h ；(3)用ddH20脱色三次，每次约30min。其中上述硫酸铵，硫酸铝，考马斯亮蓝G-250和R250优选来自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。用GAP和RAP染色后，发现RAP和GAP的灵敏度明显要比CBR和GPP要高(图la C，D和图lb)，这与报道的CBR灵敏度能检测到IOng水平的BSA条带(Wang et al. 2007a) 一致。RAP能检测到5ng水平的BSA (图la，C)，GAP的灵敏度稍微高一点，检测范围是^g/BSA条带水平，达到0. 2ng/mm2。值得注意的是，GAP在低丰度蛋白区域能染出很强的的条带， 但是在高丰度区域，要比RAP (图la :C和图lb)的灵敏度和对比度弱，可能是由于CBBG-250 比R-250更适合于低丰度蛋白，这个结果表明，GAP比改进的CBB染色法(GPP，CBR和RAP) 在纳克水平上检测蛋白的灵敏度更高。另外，为了确定GAP染色过程中在体外造成的翻译后修饰，BSA(图la，D)B1箭头标的位置被用来通过MALDI TOF MS和T0F/T0F MS/MS质谱(表1，Bi)鉴定。CBB染色后发生翻译后修饰包括甲基化，磷酸化和糖基化，还有蛋白在谷氨酸或天冬氨酸上的甲基化 (Sumpton and Bienvenut2009)。有报道介绍，在体外主要引起甲基化是由于在CBB染色过程中使用强酸，如三氯乙酸和磷酸(Yasumitsu et al. 2010a ；Yasumitsu et al. 2010b)。本发明人的MS结果表明，GAP染色牛血清蛋白(BSA)条带能产生高质量的肽指纹(PMF)图和达到241鉴定得分(表1，B1)。有三个主要的母离子的光谱图927. 3，1283. 4和2044. 5m/z 被进一步通过T0F/T0F和肽碎片指纹图谱(PFF)分析，搜索分数依次是48，56和67(表1， Bi)。在它们之中，BSA中的R. HPEYAVSVLLR. L序列U83. 4m/z，众所周知是最频繁的甲基化序列(Sumpton and Bienvenut 2009 ；Yasumitsu et al. 2010b)。比较主要的峰和有潜在甲基化的峰，结果显示，有潜在甲基化的峰是1297. 7，低于检测极限。即使甲基化发生，它的峰不超过非甲基化峰的1%。因此，总结出来，GAP染色能诱导极少的蛋白样品在体外甲基化修饰，这可能是由于在染色液中用到了低浓度(体积百分含量为5%)的磷酸和磷酸代替了乙酸抑制了蛋白修饰的过程(Yasumitsu et al. 2010b)。上述提到的这些结果表明， GAP染色法不仅有好的质谱兼容性，而且体外有很少的蛋白修饰，因而更适合于将来的比较蛋白质组学研究。表1胶乳中C-乳清和BSA蛋白的MALDI T0F/T0F MS/MS鉴定结果
权利要求
1.一种考马斯亮蓝G250染色液，其特征是含有以下组分质量体积浓度为0. 1-0. 2% 的CBBG-250，质量体积浓度为5-15%的硫酸铵，体积百分含量为3_8%的磷酸，体积百分含量为20-40%的乙醇，体积百分含量为5-20%的甲醇。
2.根据权利要求1所述的考马斯亮蓝G250染色液，其特征是所述的CBBG-250的质量体积浓度为0. 12-0. 13%，所述的硫酸铵的质量体积浓度为8-12%，所述的磷酸的体积百分含量为4-6%，所述的乙醇的体积百分含量为20-30%，所述的甲醇的体积百分含量为 10-15%。
3.根据权利要求1所述的考马斯亮蓝G250染色液，其特征是所述的CBBG-250的质量体积浓度为0. 125%，所述的硫酸铵的质量体积浓度为10%，所述的磷酸的体积百分含量为5%，所述的乙醇的体积百分含量为30%，所述的甲醇的体积百分含量为10%。
4.利用权利要求1-3任一项所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是含有以下步骤将SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250中，进行染色，再将染色后的SDS-PAGE胶转移至脱色液中，振荡脱色直到背景干净为止。
5.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是所述的SDS-PAGE胶置于上述考马斯亮蓝染色液G250前先置于ddH20中振荡2-lOmin。
6.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是染色时间为3-Mh。
7.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是所述的脱色液含有体积百分含量为20-40%的乙醇和体积百分含量为1-10%的乙酸。
8.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是振荡脱色的时间为2-池。
9.根据权利要求4所述的利用所述的考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，其特征是所述的SDS-PAGE胶为单向胶，其含有质量百分含量为10-15%的聚丙烯酰胺分离胶和质量百分含量为1-5%的聚丙烯酰胺浓缩胶；或所述的SDS-PAGE胶为双向胶，其含有质量百分含量为10-15%的聚丙烯酰胺分离胶。
10.权利要求4所述的方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种考马斯亮蓝G250染色液，含有以下组分质量体积浓度为0.1-0.2％的CBB G-250，质量体积浓度为5-15％的硫酸铵，体积百分含量为3-8％的磷酸，体积百分含量为20-40％的乙醇，体积百分含量为5-20％的甲醇。该染色液集固定液，敏化液和染色液为一体，染出胶的背景比较轻，染色灵敏度高；还公开了利用上述考马斯亮蓝G250染色液进行染色的方法，该方法除具有较好的重复性、很低的染色背景外，该检测方法快速灵敏，检测到的蛋白点数目比较多；有很好的质谱兼容性，能减少蛋白在体外修饰；应用范围比较广泛。同时公开了上述方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。
文档编号G01N1/30GK102288470SQ20111020387
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者王东阳, 王旭初, 王海燕, 郭安平 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所