专利名称：一种甘薯病毒病血清检测取样方法
技术领域：
本发明涉及一种农作物病毒病血清检测，具体说是涉及一种甘薯病毒病血清检测取样方法，属农业植保技术领域。
背景技术：
甘薯病毒病是甘薯生产中的主要病害之一，广泛存在于种薯种苗中，严重影响了甘薯的产量和品质。有资料显示，甘薯病毒病的田间品种发病率100%，东非、南美由于病毒病造成甘薯大幅度减产甚至绝产。美国、日本也相继报道了甘薯病毒病造成甘薯产量降低、 品质下降，甘薯病毒病是中国甘薯产区的重要病害，是造成甘薯退化减产的重要原因。病毒病的感染可使产量降低30% 50%，病毒病的防治方法主要是对品种进行脱毒培养，脱除病毒后的甘薯能够大幅度提高产量和质量，一般品种脱毒后增产20%以上，高者达200% 之多，且品种间有较大差异。甘薯脱毒种薯在生产上利用，可有效地防治病毒病的发生，但脱毒种薯的质量是保证防治措施实施的重要环节，因此，有效、快速地鉴定品种的带毒率， 是保证脱毒种薯质量的关键。血清学检测是甘薯病毒病检测的重要手段，而以往检测的样品是以甘薯的叶片为主，在2002年谢逸萍对此进行了部分改进，以叶柄为检测的样品，为此，病毒检出率提高了 20%，2010年，谢逸萍等人又根据不同甘薯病毒在甘薯体内存在的部位，对血清学检测的取样方法进行了再次改进，从而提高了甘薯脱毒种薯的检测效率。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种甘薯病毒病血清检测取样方法。根据国际甘薯病毒病的研究报道，不同甘薯病毒在甘薯中存在的部位不同，有的病毒在甘薯叶肉中含量较高，有的病毒在甘薯的叶柄中含量较高，该方法通过对甘薯叶片、 叶柄和叶片与叶柄结合部的甘薯病毒检出率比较试验，从CI部提取液进行对应检测，记录显色结果，阳性表示含有病毒。本发明是以如下技术方案实现的一种甘薯病毒病血清检测取样方法，其特征是 按如下步骤进行(1)参试样品准备从田间取回待检测的脱毒甘薯样品(取叶片加叶柄)；(2)取样对塑料袋进行编号，用直径15mm试管取叶片和叶柄的结合部，需隔在塑料袋外取，只留叶片和叶柄的结合部，其余除去；(3)检测样品的制备加Iml提取缓冲液，用玻璃试管在塑料袋外碾磨，室温放置 20-30分钟，使植物汁液充分提取；(4)点样a、将一张干燥的滤纸放在实验台上，将膜放在上面，避免气泡产生；b、 用一个无菌的枪头吸塑料袋中提取液上清部分(15-20微升)，点在膜上方格正中，不要用枪头碰到膜，一个样品用一个枪头，点样过程中一直戴手套和用镊子接触膜，手指印可能造成假阳性结果；(5)设阳性对照在每张膜的最后设置阳性对照，点样完成将膜转到一张干燥的滤纸上，干燥15-20分钟，在继续实验前可以用两张滤纸夹着膜保存；(6)血清学检测血清学检测根据酶联包中的步骤进行封闭液孵育60分钟 —TBS快速洗膜一加入病毒抗体液50rpm孵育过夜一倒掉病毒抗体液加入T-TBSlOOrpm洗膜3次一加入酶标抗液体50rpm孵育1小时一除去酶标抗液体，用30mlT_TBS洗膜4次一将膜放入装有染色液的培养皿中，50rpm孵育30分钟一用蒸馏水IOOrpm洗膜3次，终止显色一滤纸吸干水分，记录显色结果，阳性的表示含有病毒。本发明的优点是以叶片与叶柄结合部提取液做为样本进行病毒血清学检测，提高了病毒阳性检出率，利用叶柄汁液中病毒浓度高、杂质少，及叶柄叶肉兼顾，有效地消除了叶片和叶柄取样的局限性，因为不同甘薯病毒在叶片上存在的部位不同，病毒主要通过维管束传播，大部分病毒可在维管束中增殖，叶柄中含有大量维管束，而有少数甘薯病毒主要是在叶肉中繁殖和存在，单用叶柄检测则无法检测到所有病毒，以叶片与叶柄结合部提取液作为检测样品可消除取样上的误差。同时叶片与叶柄结合部提取液比较清淡，避免了叶绿素的沉积影响。提高脱毒种薯病毒病检出率，对于全面了解生产中脱毒种薯的带毒率、 指导脱毒薯的开发利用具有重要意义和现实作用。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例、甘薯病毒病血清检测取样新方法，我们对叶、叶柄、叶片和叶柄结合部进行检出率比较试验，按如下步骤进行(1)参试样品准备从田间取回徐薯18和北京553的样品，每品种取15个；(2)检测样品的制备对塑料袋进行编号，每个样分别取叶片、叶柄、叶片和叶柄和结合部进行对应检测，每一塑料袋中加Iml提取缓冲液，用玻璃试管在塑料袋外碾磨，室温放置20-30分钟，使植物汁液充分提取；(3)点样a.将一张干燥的滤纸放在实验台上，将膜放在上面，避免气泡产生； b.用一个无菌的枪头吸塑料袋中提取液上清部分(15-20微升)，点在膜上方格正中，不要用枪头碰到膜，一个样品用一个枪头，设阳性对照，点样过程中戴手套和用镊子接触膜，手指印可能造成假阳性结果；c.将膜转到一张干燥的滤纸上，干燥15-20分钟，采用两张滤纸
夹着膜保存(4)血清学检测a.所有的孵育和洗涤在室温下进行，孵育振荡摇床转速50rpm，洗涤IOOrpm ；b.加30ml封闭液在培养皿中，将膜倾斜45度角浸入，避免气泡产生，孵育60分钟，50rpm ；同时配一抗(病毒抗体)0. lml9#包加30ml酶标缓冲液，10种单抗各一；c.倒掉封闭液，用TBS快速洗膜，向培养皿中加入抗体液(一抗)，盖上盖子，用 parafilm膜封住培养皿边缘，防止挥发，孵育过夜，50rpm ；d.倒掉一抗，用30mlT-TBS洗膜，4次，每次3分钟，IOOrpm ；除去未结合抗体；同时准备配备溶液(Conjugatesolution，二抗溶液)0· 1111110#瓶二抗加 30ml: 抗缓冲液，Conjugatebuffer 6# 包加 300mlTBS ；
e.用吸水纸夹住膜除去多余的T-TBS，将膜放入装有二抗液体的培养皿中，孵育1 小时，50rpm ；底物缓冲液(substratebuffer) :ρΗ9· 5, 250ml, 8# 包加 250ml 蒸溜水，加 0. 5mlHCl ( 包)，调 pH ；f.除去二抗溶液，用30mlT-TBS洗膜，4次，每次3分钟，lOOrpm。除去未结合抗体；最后洗膜时，配染色液(NBT/BCIP)将12#瓶中吸Iml加入11#瓶中标注NBT和 BCIP的每个瓶中，充分溶解后，各吸0. Iml混合后，加入25ml底物缓冲液，4度保存6_8个月；g.用吸水纸夹住膜除去多余的T-TBS，将膜放入装有染色液的培养皿中，孵育30 分钟，50rpm ；h.用蒸馏水洗膜，终止显色，3次，每次10分钟，IOOrpm ；i.膜用滤纸吸干水分，记录显色结果，夹在滤纸中保存；(5)调查结果记录阳性检出率，叶、叶柄和叶片与叶柄结合部甘薯病毒检测结果见表
权利要求
1. 一种甘薯病毒病血清检测取样方法，其特征是按如下步骤进行(1)参试样品准备从田间取回待检测的脱毒甘薯样品(取叶片加叶柄)；(2)取样对塑料袋进行编号，用直径15mm试管取叶片和叶柄的结合部，需隔在塑料袋外取，只留叶片和叶柄的结合部，其余除去；(3)检测样品的制备加Iml提取缓冲液，用玻璃试管在塑料袋外碾磨，室温放置20-30 分钟，使植物汁液充分提取；(4)点样a、将一张干燥的滤纸放在实验台上，将膜放在上面，避免气泡产生；b、用一个无菌的枪头吸塑料袋中提取液上清部分(15-20微升)，点在膜上方格正中，不要用枪头碰到膜，一个样品用一个枪头，点样过程中一直戴手套和用镊子接触膜，手指印可能造成假阳性结果；(5)设阳性对照在每张膜的最后设置阳性对照，点样完成将膜转到一张干燥的滤纸上，干燥15-20分钟，在继续实验前可以用两张滤纸夹着膜保存；(6)血清学检测血清学检测根据酶联包中的步骤进行封闭液孵育60分钟一TBS快速洗膜一加入病毒抗体液50rpm孵育过夜一倒掉病毒抗体液加T-TBSlOOrpm洗膜3次一加入酶标抗体液50rpm孵育1小时一除去酶标抗体液，用30mlT_TBS洗膜4次一将膜放入装有染色液的培养皿中，50rpm孵育30分钟一用蒸馏水IOOrpm洗膜3次，终止显色一滤纸吸干水分，记录显色结果，阳性的表示含有病毒。
全文摘要
本发明涉及一种农作物病毒病血清检测，具体说是涉及一种甘薯病毒病血清检测取样方法，属农业植保技术领域。该方法通过对甘薯叶片、叶柄和叶片与叶柄结合部的甘薯病毒检出率比较试验，从CIP(国际马铃薯中心)获得10种甘薯病毒检测(NCM-ELISA)酶联包，从田间采集开放二年的脱毒原种苗徐薯18和北京553，分别取其叶片提取液、叶柄提取液及叶片与叶柄结合部提取液进行对应检测，记录显色结果，阳性的表示含有病毒。检测结果表明以叶片与叶柄结合部提取液作为样本进行病毒血清学检测，其病毒阳性检出率最高。
文档编号G01N1/10GK102305727SQ20111021096
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者孙厚俊, 王欣, 谢逸萍, 赵永强, 邢继英, 陈晓宇 申请人:江苏徐州甘薯研究中心