专利名称：一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法
技术领域：
本发明涉及一种最佳降温速度的预测方法，尤其涉及一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法。
背景技术：
目前血液中心或血库普遍采用4°C液态保存，但是在保存期内，细胞的ATP及2， 3-DPG含量会逐步下降，直接影响治疗效果，而且保存期短(仅42天)。冷冻红细胞则以质量可靠，解冻洗涤后细胞形态及生化特性与4°C液态保存的红细胞相似，且保存期长达10 年，成为稀有血型及自体输血的主要保存方式，此外还能应对战事、自然灾害等突发事件的血源需求。为了减少生物材料遭受低温损伤，确定冷冻时最佳降温速度是亟待解决的问题， 通常该速度应能足够慢以规避胞内冰形成，同时又足够快以避免细胞严重脱水。研究人员往往通过不同降温速度实验，借助若干生化指标筛选出效果最佳的实验方案，整个流程繁琐而冗长。因此，事先获知低温下细胞膜水分跨膜转运量及转运速度，这对准确估计最佳降温速度范围提供极大的便利，大幅降低原有工作量，为红细胞低温保存规程提供操作参考值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，可以形象刻画细胞在低温环境中的应激反应，掌握细胞遭受低温损伤的发展进程， 又能根据细胞失水状况确定细胞在特定保存液中的最佳降温速度，提高红细胞低温保存效^ ο为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤一、制备试样将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0. 9% NaCl溶液反复洗涤3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0. 4， DMSO终浓度为20%的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加 0. 5 Img 丁香假单胞菌，混勻后滴加至标准铝皿中，称重密封；二、DSC试验温度程序(1)测定保存液的熔融温度Tph将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4°C，随后将试样降温至-85 °C，待热流稳定后从-85 °C以10°C /min加热至20°C，用热分析软件Pyris Software 5. 0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度 Tph;(2)测定细胞悬液的放热量在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度Tph以5°C /min降温至-50°C，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度Tph，以200°C /min的速率降温至_150°C，随后重新记录试样从保存液熔融温度 Tph以5°C /min降温至_50°C内的热流曲线；(3)细胞体积的换算将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定Aq(T)ds。及 Aqds。，再结合细胞初始体积Vtl及非渗透性体积Vb，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；
权利要求
1. 一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤一、制备试样将新鲜血液以2500r/min离心5min，弃去血浆及白膜，再用0. 9% NaCl溶液反复洗涤 3次，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用；将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备成压积为0. 4，DMSO 终浓度为20%的细胞悬液，两次添加间隙需将试样在室温下静置5min，随后添加0. 5 Img 丁香假单胞菌，混勻后滴加至标准铝皿中，称重密封；二、DSC试验温度程序(1)测定保存液的熔融温度Tph将试样移入DSC的样品炉腔中，盖好炉盖，将初始温度设定为4°C，随后将试样降温至_85°C，待热流稳定后从_85°C以10°C /min加热至20°C，用热分析软件Pyris Software 5. 0采集这一升温过程的放热峰，该放热峰的外推起始温度即为该溶液的熔融温度Tph ；(2)测定细胞悬液的放热量在溶液形成胞外冰后，细胞悬液从保存液的熔融温度Tph以5°C /min降温至_50°C，此时热流曲线记录细胞具有渗透活性时的热流变化，再将试样重新加热至保存液的熔融温度 Tph,以200°C /min的速率降温至_150°C，随后重新记录试样从保存液熔融温度Tph以5°C / min降温至-50°C内的热流曲线；(3)细胞体积的换算将两条热流曲线进行局部积分，曲线交叠部分形成热量差，确定从起始温度冷冻至任意终结温度T时的放热量Aq (T)ds。及全过程中的放热量Aqds。，再结合细胞初始体积Vtl及非渗透性体积Vb，代入式(1)中计算细胞降温到任意温度下的体积；
2. —种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤一、制备试样将新鲜血液弃去血浆及白膜，而后反复洗涤，弃去上清液，得到红细胞浓缩液备用； 将二甲基亚砜DMSO按四步等体积法添加到红细胞浓缩液中，制备细胞悬液，随后添加丁香假单胞菌，混勻后滴加至容器中，称重密封；二、DSC试验温度程序(1)测定保存液的熔融温度Tph；(2)测定细胞悬液的放热量；(3)细胞体积的换算；三、确定红细胞的渗透参数Lpg[cpa]及ELP[cpa]将红细胞在保存液中的体积变化代入水分跨膜转运的数理模型(式O)、(3))中，运用 MatLab软件中的Lsqnonlin函数求解渗透参数Lpg[cpa]及ELp[cpa]；
全文摘要
本发明揭示了一种红细胞冷冻保存时最佳降温速度的预测方法，包括根据细胞悬液在降温过程中的放热量与细胞体积的线性关系，确定细胞在恒定降温速度下在特定保存液中的体积变化，再根据水分跨膜转运的数理模型拟合红细胞对应的渗透参数，最后通过模拟细胞在不同降温速度下的体积变化来预测其对应的最佳降温速度范围。通过细胞计数仪测定细胞回收率论证得到DSC法能较为准确地预测细胞在特定保存液中的最佳降温速度范围，大幅降低工作强度，便于指导并建立更为合理的低温保存方案。
文档编号G01N25/20GK102411013SQ20111022476
公开日2012年4月11日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者周新丽, 李维杰, 王海松, 袁骥 申请人:上海理工大学