专利名称：基于p100蛋白基础上的肿瘤检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学，蛋白组学，免疫学领域。
背景技术：
plOO蛋白是一种多功能蛋白，它既作为共激活因子介导STAT6和基本转录调控元件之间的作用，又参与pre-mRNA剪接加工过程。此外，plOO蛋白作为RISC的组份之一可能参与调控microRNA的代谢。最近研究表明plOO在结肠癌和前列腺癌中表达异常，这些表象提示我们PlOO蛋白与肿瘤的发生发展之间可能存在某种联系。本课题的主要目的是在已有的PlOO蛋白研究基础上，发现plOO蛋白异常表达对乳腺肿瘤形成等生物学行为的影响并探讨其可能的分子机制。
发明内容
本发明在已有的P100蛋白研究的基础上，进一步证明该蛋白在乳腺肿瘤及其他肿瘤形成中的作用，并成功建立一种应用该蛋白的新型治疗手段。
具体实施例方式具体实施例一采用免疫组化方法检测人乳腺癌组织和正常乳腺组织中PlOO蛋白的表达情况。我们观察到plOO蛋白在人乳腺癌组织中PlOO的表达显著高于正常乳腺组织。具体实施例二我们将plOOI质粒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞并建立了稳定低表达plOO蛋白的细胞株，利用此细胞株进行体外Transwel I小室侵袭实验和划痕实验，观察plOO低表达对乳腺癌细胞侵袭性和迁移能力的影响，从而了解PlOO蛋白低表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响。我们成功地建立了稳定表达plOOI的乳腺癌MDA-MB-231稳定株细胞。体外Transwell小室实验结果显示，plOO蛋白提高乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力，plOO蛋白低表达降低231稳定株细胞的侵袭性。用231稳定株细胞进行的划痕实验得到了与侵袭实验相似的结果ρ100蛋白过表达提闻231稳定株细胞的迁移能力。具体实施例三我们进行了裸鼠乳腺肿瘤移植实验，将对照组和Pioo低表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞株接种至裸鼠第二对乳腺脂肪垫，观察并测定肿瘤体积变化，分析在体内Pioo低表达对乳腺肿瘤生长速率和侵袭性有何作用。我们进行的裸鼠体内实验表明，PlOO低表达对乳腺原位肿瘤生长具有明显的抑制作用，PlOO蛋白过表达促进肿瘤细胞的体内增殖。此外，PlOO蛋白低表达组裸鼠肿瘤向周围组织侵袭的能力低于对照组。具体实施例四
采用ChIP-GLAS启动子芯片技术筛选出启动子能与plOO蛋白高亲和力结合的靶基因-TGF-β信号通路成员，RT-PCR进行验证。利用mRNA表达谱基因芯片技术筛选出与Pioo低表达密切相关的基因，同时利用分析软件将筛选出的差异表达基因按照其所在的信号通路归类。选取其中差异表达较大的TGF-β通路成员进行Real-time PCR和Westernblot,检测裸鼠乳腺原位肿瘤组织，瞬时转染siRNA-plOO细胞和plOOI稳定株乳腺癌MDA-MB-231细胞中几种Smad蛋白的mRNA水平和蛋白表达水平。在前期完成的ChIP-GLAS启动子芯片结果中，我们发现TGF-β信号通路相关的十几个转录因子或调节因子的启动子与PlOO蛋白具有较高的亲和力。我们选取其中七个在HeLa细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞中进行mRNA水平的验证实验。结果与芯片结果基本一致当 plOO 蛋白过表达时，HeLa 和 MDA-MB-231 细胞中 Smadl，Smad2, TGIFl, Smad4,TGF β 111和Smurf2的mRNA水平显著高于对照组。分析mRNA表达谱基因芯片结果时我们发现，TGF-β信号通路中的某些成员的表达水平随plOO蛋白低表达而发生明显的改变。Western blot检测裸鼠乳腺原位肿瘤组织中TGF-β通路蛋白的表达水平时，我们发现plOO低表达肿瘤组织中p-Smadl, Smad2/3和p_Smad2蛋白的表达均低于HK组和对照组。 瞬转siRNA-plOO组细胞中Smad6和Smad9的mRNA相对表达量明显低于对照组,而Smad3和Smurf2的mRNA水平高于对照组。稳定表达plOOI组细胞只有Smad6的相对表达量显著低于对照组，其余被检测蛋白均无明显变化。具体实施例五已制备抗体
权利要求
1.Pioo蛋白在乳腺癌组织中高表达。
2.PlOO蛋白提高乳腺癌MDA-MB-231细胞在体外的侵袭和迁移能力。P100蛋白促进裸鼠体内乳腺原位肿瘤的生长、侵袭和增殖能力。活体内PlOO蛋白低表达影响TGF-β两个信号转导通路的活性。
3.细胞内PlOO蛋白异常表达可能通过调节TGF-β信号通路中的一条或两条途径的活性进而影响细胞的生物学行为。
4.PlOO蛋白可作为一种肿瘤标志物，并由此构建检测该肿瘤标志物的试剂盒。
全文摘要
p100蛋白是一种多功能蛋白，它既作为共激活因子介导STAT6和基本转录调控元件之间的作用，又参与pre-mRNA剪接加工过程。此外，p100蛋白作为RISC的组份之一可能参与调控microRNA的代谢。最近研究表明p100在结肠癌和前列腺癌中表达异常。我们基于对P100的研究构建了基于p100蛋白基础上的肿瘤检测试剂盒，可用于肿瘤的早期诊断。
文档编号G01N33/574GK102928582SQ20111022854
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者杨洁, 姚智, 刘欣, 赵秀娟, 赵秀兰, 于林 申请人:杨洁