专利名称：糖类抗原15-3(ca15-3)定量测定试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中糖类抗原 15-3(CA15-3)含量的试剂盒及其测试方法。
背景技术：
CA15-3是一种多形态上皮糖蛋白，分子量400KD。血清CA15-3测定是检测乳腺癌较重要的指标，30% 50%的乳腺癌患者的CA15-3血清水平明显升高，而且CA15-3与组织学分级、肿瘤大小和腋窝淋巴结转移的出现呈正相关，对乳腺癌的动态追踪、疗效判定与判断复发转移很有价值。CA15-3还可与其它肿瘤标志物一起检测，用于相关肿瘤病例的辅助诊断。与CA125 —起检测时，CA15-3可作为卵巢癌早期复发的指标；在肝、胃、肺、胰腺和结肠肿瘤患者中也可能升高。另外，在肝炎、肝硬化等非恶性疾病时也可见CA15-3升高的现象。临床检测CA15-3的方法有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)和电化学发光免疫分析(ECLA)等。过去以放免为代表的糖类抗原15-3(CA15-;3)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种糖类抗原15-3(CA15_3)定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行CA15-3检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。本发明提供了一种糖类抗原15-3(CA15_3)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有 CA15-3磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，标准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。所述的磁分离试剂含有标记有抗CA15-3单克隆抗体的磁性微球。所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗CA15-3单克隆抗体。所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。所述稀释液是含有BSA溶液。所述的标准品及质控品是含有一定量的CA15-3抗原的BSA蛋白溶液。
所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的缓冲液。所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。本发明糖类抗原15-3(CA15_3)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤第一步磁分离试剂的制备过程一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制IL 1、称取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，称取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器将ftOclin-300量取0. 2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7. 95-8. 05之间；4、称取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2_8°C冷库贮存。二、磁分离试剂的制备过程1、将1. Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CA15-3单克隆抗体溶于PH9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min ；3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重复操作3次； 将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混勻后室温反应4小时；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分钟；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重复操作3次；8、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0. 05%的CA15-3磁分离试剂；磁珠保存液配方为0. 1% BSA, 0. 05%吐温-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1 1的比例混勻，即得本发明试剂盒中磁分离试剂。第二步酶反应物制备过程一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g、Proclin_3000· 2ml 和 MgCl2O. 05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；2、调 PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范围内；3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um滤器过滤即得。二、碱性磷酸酶ALP与抗CA15-3单克隆抗体的偶联1、取IOmgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；2、向步骤1获得浓缩液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；3、向步骤3获得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CA15-3单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0. Iml的％ig/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小时；4、将上述液装入透析袋中，对0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时，然后 3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB缓冲盐水透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10，OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与CA15-3单克隆抗体的偶联物， 最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与CA15-3单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶反应物。第三步反应增强剂配制步骤，配制IL 1、称取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器将ftx)clin-300量取 0. 2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之间；3、称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤
器过滤ο第四步稀释液配制步骤，配制IL 1、称取 NaC19. Og 和 BSA 60g 于 IL 的容器中；2、用移液器将Proclin-300量取0. 5ml加IOml纯化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤器过滤，贴好标签于2_8°C冷库贮存， 有效期为12个月。第五步CA15-3校准品和CA15-3质控品的配制CA15-3 校准品中 CA15-3 抗原的浓度分别为 0. 1，0. 3，1，2. 5，7. 5U/ml U/ml ； CA15-3质控品中CA15-3抗原的浓度分别为0. 3,2. 5U/ml ；第六步清洗浓缩液配制步骤，配制IL 1、称取 TRIS 12. 54g 和 NaC1325. 6g 于 IL 容器中；2、称取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml纯化水的烧杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解；5、调PH，控制其范围在7. 35-7. 45之间；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um滤器过滤即得。第七步底物溶液配制步骤，配制IL 1、称取 TRIS 2. 35g、NaCl 6. 41g, Na2SO3 0. 002g 禾口 Proclin-3000. 2ml 于 IL 烧杯中；2、用量筒量取600ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7. 95-8. 05之间；3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0. 2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混勻后即得。本发明工作原理本品为夹心法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标CA15-3单抗、结合着磁性微粒的CA15-3单克隆抗体及稳定增强剂。37°C孵育后，磁性微粒上结合的CA15-3单克隆抗体与酶标单克隆抗体分别与CA15-3分子的不同表位结合，形成“三明治”结构。在外加磁场中直接沉淀，不需离心即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即可算出样品中的CA15-3含量。在检测范围内，发光强度与样本中的CA15-3浓度成正比。本发明的主要创新之处在于1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数。2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，标准品、质控品，清洗液浓缩液、稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
具体实施例方式实施例1、一、磁珠缓冲液配制操作规程配方见表1，以配制IL为例1、称取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，称取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器将Proclin-300量取0. 2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；然后在IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；3、调节PH计测量其PH值；用HCl或NaOH调PH，测量其PH在7. 95-8. 05之间即符合要求；4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7. 95-8. 05之间即符合要求，用0. 2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2_8°C冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为12个月；磁珠缓冲液表权利要求
1.一种糖类抗原CA15-3的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含CA15-3磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，CA15-3标准品、CA15-3质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的CA15-3磁分离试剂含有标记有抗 CA15-3单克隆抗体的磁性微球；所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗CA15-3单克隆抗体；所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液；所述稀释液是含有BSA的溶液；所述的标准品及质控品是含有一定量的CA15-3抗原的BSA溶液；所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的缓冲液；所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
3.如权利要求1-2任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得一、磁分离试剂的制备过程一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制IL1、称取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，称取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用移液器将ftx)Clin-300量取0.2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；3、调节PH,控制PH在7.95-8. 05之间；.4、称取BSA3g倒入上述IL容器中；.5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；二)、磁分离试剂的制备过程.1、将1.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CA15-3单克隆抗体溶于PH9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；.2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温 90min ；.3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心 30min 浓缩至 0. 5ml ；.4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混勻后室温反应4小时；.5、加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分钟，然后加入 1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB 清洗已经标记的磁珠，混勻30秒；.6、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；.7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1 1的体积比例混勻，即得权利要求 1或2所述试剂盒中的磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制IL .1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2O. 05g、Proclin-3000. 2ml 和 MgCl2O. 05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；2、调PH,控制PH在7.35-7. 45范围内;3、称取BSA3g倒入上述烧杯中；4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得；二)、碱性磷酸酶ALP与抗CA15-3单克隆抗体的偶联1、取IOmgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；3、向步骤2获得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CA15-3单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻， 置4°C下2小时；4、将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4的 PBS 中；6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10，OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶ALP与抗CA15-3单克隆抗体的偶联物； 将收集到的碱性磷酸酶ALP与抗CA15-3单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶反应物。三、反应增强剂的制备过程，配制IL1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.35-7. 45之间；3、称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制IL:1、称取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；2、取0.5ml Proclin-300加IOml纯化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；五、CA15-3校准品和CA15-3质控品的配制CA15-3 校准品中 CA15-3 抗原的浓度分别为 0. 1，0. 3，1，2. 5，7. 5U/ml U/ml ；CA15-3 质控品中CA15-3抗原的浓度分别为0. 3,2. 5U/ml ；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制IL1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；3、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；·4、取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解；·5、调PH，控制其范围在7.35-7. 45之间；·6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得； 七、底物溶液的制备过程，配制IL ·1、取TRIS 2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g 和 Proclin-3000. 2ml 于 IL 烧杯中；·2、取600ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调PH在7.95-8. 05之间；·3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混勻后即得。
4、如权利要求1-3任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下1)、加15μ 1 CA15-3标准品、CA15-3质控品、待测标本至对应试管底部；2)、加30μ 1酶反应物至每一试管中；3)、加30μ 1反应增强剂至每一试管中；4)、加30μ 1磁分离试剂至每一试管中；5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混勻器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；7)、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μ 1稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混勻器上轻轻振荡混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至试管中混勻3秒，发光检测仪检测。
5、如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，待测标本为高值HOOK样本时，根据需要使用稀释液对标本进行稀释。
全文摘要
本发明公开了一种糖类抗原15-3(CA15-3)的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含CA15-3磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，CA15-3标准品、CA15-3质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。
文档编号G01N33/543GK102288766SQ20111023405
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者不公告发明人 申请人:内蒙古科慧生物科技有限责任公司