专利名称：一种合成氨基功能化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的方法
技术领域：
本发明涉及一种合成水溶性的无机纳米荧光标记材料的方法，尤其是涉及一种具有氨基功能化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的制备方法。
背景技术：
无机稀土纳米晶在绿色照明光源、纳米光电子器件、平板显示等领域已有广阔的用途，但其作为荧光生物标记材料是直到最近几年才备受关注。目前广泛用于荧光生物标记的材料主要是有机染料、荧光蛋白、稀土鳌合物、有机发色团掺杂的硅胶/乳胶纳米珠、半导体量子点和无机稀土纳米晶等。其中，相比于其他的标记材料，无机稀土纳米晶由于具有高光化学稳定性、几乎无毒性、窄线宽、长荧光寿命、高发光效率和可调谐荧光发射波长等综合优势，因此是目前普遍看好的新一代荧光生物标记材料。在实际应用中，对荧光标记材料要求颗粒均匀单分散，在不影响发光效率的情况下颗粒越小越好，并具有良好的水溶 性，这些都对纳米发光材料的制备和表面修饰提出较严格的要求。为了解决纳米颗粒的水溶性以及与生物分子之间的连接问题，通常需要采取两步法，即在纳米颗粒合成后再进行第二步的表面修饰，这也是该类材料实用化的一个关键技术。近年来，氟化物作为一类具有较低声子能量，较稳定物理化学性质的发光基质而受到人们的青睐，其中稀土掺杂氟化镧荧光标记纳米材料由于其优良的光学性能以及在生物标记等方面的潜在应用，已经引起了国内外学者的普遍关注。目前，用于荧光标记的稀土掺杂氟化镧纳米晶主要是通过水热法合成。不仅所得到的纳米颗粒较大(一般为30-50 nm)而影响到后续的生物检测分析效率；而且为了实现纳米颗粒的水溶性，需进一步通过表面硅烷化或胶体静电吸附有机聚合物等方法采取表面修饰。显然后续的表面功能化处理增加了合成步骤，而且对于纳米颗粒的表面的重新处理也会影响到纳米晶的发光性能，这些因素都限制了纳米材料的实际应用。针对以上问题，本发明以磷酸乙醇胺(AEP)为表面活性齐U，采用低温共沉淀法一步合成水溶性的稀土掺杂氟化镧纳米晶。这种方法不仅可以控制纳米颗粒的大小在5 nm左右,而且能同时实现纳米颗粒的表面氨基功能化以利于纳米颗粒能与生物分子进行连接，通过纳米颗粒内掺杂稀土离子特定发光对这一连接进行检测，即可应用于荧光标记分析。
发明内容
本发明的目的在于提出一种合成颗粒小、水溶性好的氨基化稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的制备方法。本发明采用如下技术方案
I.一种合成氨基功能化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的方法，其特征在于把磷酸乙醇胺溶于蒸馏水中并用氨水调节溶液的PH值，接着向其中加入氟化钠，搅拌得到无色透明溶液；另将稀土硝酸盐溶于蒸馏水后滴加到上述溶液中，在30-90°C保温并搅拌一段时间，然后往该溶液中加入丙酮使纳米晶沉淀，并进行离心分离，洗涤，干燥后即可得到氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米晶。2. 一种如项I所述的稀土掺杂氟化镧纳米晶的制备方法，其特征在于选用磷酸乙醇胺为表面活性剂，既可控制纳米晶大小，又可实现其表面的氨基功能化。3. 一种如项I和2所述的氟化镧纳米晶的制备方法，其特征在于反应物的加入摩尔量比例
硝酸镧1份；
氟化钠:3 6份；
磷酸乙醇胺0.广5份。4.如项1-3所述的方法，所得到的稀土掺杂氟化镧纳米晶，其组分为 xLn3+-(l-x) LaF3,其中 Ln3+=Ce3+' Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+、Pr3+，x=0-50 mol%05.如项1-4所述的制备方法所得到氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的用途，其特征在于应用于生物标记和检测。制备所得的稀土掺杂氟化镧纳米晶利用其表面的氨基与生物分子进行连接，同时可通过纳米晶内掺杂不同的稀土离子实现特定的发光，来对这一生物连接进行检测，应用于荧光生物标记等领域。制备流程称取磷酸乙醇胺溶解在蒸馏水中，然后用氨水调节pH值，接着往其中加入氟化钠，搅拌使其完全溶解，另将稀土硝酸盐溶解在蒸馏水后滴加到上述溶液中，在加热条件下继续搅拌并保温一段时间。然后往该溶液中加入丙酮沉淀出纳米晶，离心分离，将得到的沉淀分别用水和乙醇洗涤数次，干燥后即可得到稀土掺杂氟化镧纳米晶粉末。氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米晶的表征通过X射线粉末衍射(XRD)实验检测表明制备出的氟化镧纳米晶为纯六方相结构。透射电镜(TEM)测试显示得到的是5纳米左右的均匀分散纳米颗粒；高分辨透射电镜(HRTEM)照片可以清楚的观察到均匀连续的晶格条纹，表明纳米颗粒结晶较好。通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)检测表明，纳米晶表面有很明显的对应于磷酸乙醇胺的红外振动吸收峰1085 CnT1是对应于P-O的伸缩振动吸收峰；2853 CnT1和2924 cnT1是对应于-CH2-的伸缩振动吸收峰；而1635 cnT1则是对应于-NH2的伸缩振动吸收峰，表明纳米晶表面已经被成功修饰上了氨基，因此颗粒也具有较好的水溶性。另外，在纳米晶中，可以通过掺杂不同的稀土离子实现所需要的特定荧光发射。通过本发明可以一步合成水溶性的氨基化稀土掺杂LaF3荧光标记材料，制备设备简单、合成条件易控制、重复性好，可以进行大批量生产。本发明与国内外制备得到的氟化镧纳米晶相比，具有颗粒均一，尺寸较小；同时由于在合成纳米晶时就加入了磷酸乙醇胺，纳米颗粒有较好的水溶性，表面具有的氨基可用于与生物分子进行连接；另外可以通过掺杂不同稀土离子而实现特定的荧光发射等优点，因此有希望成为一种新型的纳米荧光标记材料，应用于荧光免疫分析以及生物成像。
附图I :纳米晶的X射线粉末衍射图。附图2 (a)纳米晶的透射电镜图；(b)纳米晶的高分辨透射电镜图；(C)纳米晶的水溶液。
附图3 :纳米晶的傅立叶变换红外光谱图。附图4 :表面氨基化纳米晶的结构图。附图5:(a)LaF3: 29ffiu及(b)LaF3: 15%Ce，5%Tb纳米晶分散于蒸馏水中的荧光光谱及溶液发光照片，激发波长分别为394纳米和253纳米。附图6 :生物素修饰后的纳米晶与荧光素修饰后的亲和素连接,进行时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)检测的原理。
具体实施例方式本发明所提供的水溶性的氨基化稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的制备方法，其实质特点和初步应用可以通过以下实施例子进一步予以体现。
实例I :称取O. 07 g AEP，溶解在30 mL蒸馏水中得到透明溶液，然后用氨水调节pH值至6，接着往其中加入O. 126 g NaF，搅拌使其完全溶解，得到溶液A，将其保温在30°C;另将O. 424 g La (NO3) 3·6H20和O. 009 g Eu (NO3) 3 ·6Η20完全溶解在5 mL蒸馏水中得到透明溶液B ;在搅拌状态下，将溶液B逐滴加入到溶液A，继续搅拌20小时，将得到透明溶液。然后往该溶液中加入50 mL丙酮沉淀出纳米晶，离心分离，将得到的沉淀分别用水和乙醇洗涤数次，然后60°C真空条件下干燥即得到LaF3: 29ffiu纳米晶粉末。将得到的纳米晶粉末溶解在水中，可以得到无色透明的水溶液。用光谱仪进行检测，在394 nm激发下，可以得到强的红色铕离子发光。实例2:称取O. 14 g AEP,溶解在30 mL蒸馏水中得到透明溶液，然后用氨水调节pH值至7，接着往其中加入O. 168 g NaF，搅拌使其完全溶解，得到溶液C，将其保温在60°C;另将 O. 346 g La(NO3)3 · 6H20，O. 065 g Ce (NO3) 3 · 6H20 和 O. 023 g Tb (NO3) 3 · 6H20 完全溶解在5 mL蒸馏水中得到透明溶液D ;在搅拌状态下，将溶液D逐滴加入到溶液C，继续搅拌20小时，将得到透明溶液。然后往该溶液中加入50 mL丙酮沉淀出纳米晶，离心分离，将得到的沉淀分别用水和乙醇洗涤数次，然后60°C真空条件下干燥得到LaF3: 15%Ce, 5%Tb纳米晶粉末。将得到的纳米晶粉末溶解在水中，可以得到无色透明的水溶液。用光谱仪进行检测，253 nm激发下，可以得到强的绿色铽离子发光。实例3:称取O. 28 g AEP,溶解在30 mL蒸馏水中得到透明溶液，然后用氨水调节pH值至8，接着往其中加入O. 21 g NaF,搅拌使其完全溶解，得到溶液E，将其保温在90°C ；另将O. 216 g La(NO3)3 ·6Η20和0.228 g Dy (NO3) 3 ·6Η20完全溶解在5 mL蒸馏水中得到透明溶液F ;在搅拌状态下，将溶液F逐滴加入到溶液E，继续搅拌20小时，将得到透明溶液。然后往该溶液中加入50 mL丙酮沉淀出纳米晶，离心分离，将得到的沉淀分别用水和乙醇洗涤数次，然后60°C真空条件下干燥得到LaF3: 50%Dy纳米晶粉末。实例4:LaF3: 15%Ce，5%Tb纳米晶连接生物素的制备。称取O. 2 mmol生物素(biotin)以及O. 2 mmol I-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和O. 5 mmolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于20 mL磷酸盐缓冲液(pH=7. 2)，搅拌15分钟，接着向其中加入20 mg LaF3: 15%Ce，5%Tb纳米颗粒，搅拌I天，然后将沉淀离心分离，用蒸馏水和乙醇洗涤多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修饰生物素的LaF3: 15%Ce, 5%Tb无机纳米晶。实例5 :将连接上生物素的LaF3: 15%Ce，5%Tb纳米晶溶解于磷酸盐缓冲液(pH=7. 2)，分成相同体积的数份，然后与不同浓度的标记有异硫氰酸荧光素的亲和素(FITC-avidin)进行培养后，在荧光读板机上采取时间分辨光谱法进行检测，激发波长为253 nm，延迟时间为100 //S，门控时间为I ms。由于纳米颗粒内掺杂的稀土离子Tb3+与荧光素FITC存在的荧光共振能量传递(FRET)，结果显示随着加入的FITC-avidin浓度的增大，检测到Tb3+对应于489 nm波段的发光强度减小，同时荧光素FITC对应于520 nm波段的发光强度增大，在3. 7-200 nM范围内，亲和素浓度与荧光强度变化之间存在着较好的线性关系，说明利用纳米颗粒的荧光可以应用于 检测亲和素。
权利要求
1.ー种合成氨基功能化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的方法，其特征在于把磷酸こ醇胺溶于蒸馏水中并用氨水调节溶液的PH值，接着向其中加入氟化钠，搅拌得到无色透明溶液；另将稀土硝酸盐溶于蒸馏水后滴加到上述溶液中，在30-90°C保温并搅拌一段时间，然后往该溶液中加入丙酮使纳米晶沉淀，并进行离心分离，洗涤，干燥后即可得到氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米晶。
2.一种如权利要求I所述的稀土掺杂氟化镧纳米晶的制备方法，其特征在于选用磷酸こ醇胺为表面活性剤，既可控制纳米晶大小，又可实现其表面的氨基功能化。
3.—种如权利要求I和2所述的氟化镧纳米晶的制备方法，其特征在于反应物的加入摩尔量比例 硝酸镧1份； 氟化钠:3 6份； 磷酸こ醇胺0. I飞份。
4.如权利要求1-3所述的方法，所得到的稀土掺杂氟化镧纳米晶，其组分为xLn3+-(l-x) LaF3,其中 Ln3+=Ce' Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+、Pr3+，x=0-50 mol%0
5.如权利要求1-4所述的制备方法所得到氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的用途，其特征在于应用于生物标记和检测，制备所得的稀土掺杂氟化镧纳米晶利用其表面的氨基与生物分子进行连接，同时可通过纳米晶内掺杂不同的稀土离子实现特定的发光，来对这一生物连接进行检测，应用于荧光生物标记等领域。
全文摘要
一种合成氨基功能化的稀土掺杂氟化镧纳米荧光标记材料的方法，涉及利用磷酸乙醇胺为表面活性剂，在蒸馏水中将氟化钠、硝酸镧和稀土硝酸盐混合，在30-90℃保温并搅拌一段时间，进行洗涤干燥后即可得到氨基化的稀土掺杂氟化镧纳米晶，其组分为xLn3+-(1-x)LaF3，其中Ln3+=Ce3+、Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+、Pr3+，x=0-50mol％。采用本方法制备的稀土掺杂LaF3纳米荧光标记材料，不仅可以控制纳米颗粒的大小在5nm左右，而且水溶性较好，能利用其表面的氨基与生物分子进行连接。另外能通过在纳米颗粒内掺杂不同的稀土离子实现所需的特定荧光发射，来对这一生物连接进行灵敏的检测，表明了通过这一制备方法得到的纳米荧光标记材料应用于生物标记领域的潜力。
文档编号G01N33/533GK102676171SQ20111024252
公开日2012年9月19日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年3月14日
发明者刘丽琴, 刘永升, 朱浩淼, 涂大涛, 陈学元 申请人:中国科学院福建物质结构研究所