专利名称：一种早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。研究显示，乳腺癌发病率占妇科肿瘤的31%，死亡率在肿瘤中居第二位，且近年来乳腺癌发病率有升高趋势，已成为威胁我国女性健康的首要恶性肿瘤。乳腺癌目前虽无特殊的预防措施，但是它属于一种早期易治易控的肿瘤，若能早期发现、早期诊断、早期治疗，预后情况一般比较好。临床上，部分乳腺癌因早期发现而取得了理想的治疗疗效，但大部分患者因发现较晚错失了最佳治疗时机。因此，当前以及将来相当长的一段时间内，争取早期诊断将是乳腺癌防治的一项基本策略。诊断早期乳腺癌的方式，在诊断发现方面主要是自查异常(如乳腺自查等)或医院体检(如采用乳腺钼靶X线摄影、乳腺彩色多谱勒超声检查、乳腺导管内视镜检查、乳腺导管灌洗、CT和磁共振等，若有无法辨别的肿块或脓肿可进行细胞学穿刺检查)，在确诊方面则为病理组织检查。但在临床中存在如下缺陷一、目前的自查异常或医院体检，在诊断的早期性提示方面仍显滞后，特别是对于那些由于肿块较小、或者浸润较轻、成膨胀性生长、 表现为光滑、活动、边界清楚，与良性肿瘤不易区别的早期乳腺癌患者，漏检率较高，或者当诊断发现时已过了最佳的早期治疗时机；二、由于涉及社会文化伦理等方面问题，一些年轻女性对于乳腺检查容易忽视或产生抗拒心理，上述的医院体检方法对处于早期阶段的乳腺癌患者，特别是年轻患者的诊断能力更为有限；三、病理学检查虽是肿瘤确诊的“金标准”， 但非手术患者作病理学检查存在取材所致的肿瘤细胞扩散风险等原因，因此不被普遍应用。目前，随着技术的发展，对于就乳腺癌方面的体检和未确诊者，大多作外周血乳腺癌相关指标的检查，其优点是简便可行，但仍存在如下缺点一、现有指标在早期的表达是微量的，且敏感性和特异性低，故检出率偏低；二、现有指标在临床诊断中相对不稳定，使部分患者错过早期诊断机会。另外，术后患者的疗效监察和复发诊断，也同样存在缺乏理想外周血检测指标的问题。因此，发现理想的早期诊断指标，其意义十分重大。目前在国内外，本领域当前的研究重点有如下四个方面
①全基因组层面筛选新指标
现有的血清学指标中，对乳腺癌诊断价值大的不多，特别缺少早期诊断有价值的指标。 缺乏理想诊断指标，原因可能是未能全面筛选相关指标；近年来全基因组表达的检测已有较大突破，可以进行噬菌体展示技术、全基因组芯片技术等检测，因此国内外已开始从全基因组层面筛选各类肿瘤新的、有价值指标，这种方案可以发现新的诊断指标，故成为研究热
；ο②多指标联合诊断模型的开发肿瘤标志物诊断价值未达到预期目标的另一原因，可能是肿瘤不同类型、不同时期表达的指标不同有关，因此期望用单一指标解决各阶段的诊断问题不现实。国内外已有多指标联合诊断的研究报道，本课题组曾对12种常用指标联合诊断进行研究，取得较好效果。 多指标联合诊断，能提高诊断的准确度。③寻找外周血中能反映肿瘤早期病变的指标
在以外周血检查为主要手段筛查肿瘤的现阶段，外周血指标是否理想，决定着早期诊断效果的好坏。对多数肿瘤而言，目前仍缺少理想的诊断指标。肿瘤特异蛋白最早表达在病灶组织，但这种表达在早期是微量的，加上即使病灶组织表达，也未必分泌到外周血，所以有必要从早期表达指标中找出能分泌到外周血中的指标。近年有试图利用抗体为指标， 实现早期诊断的研究；其理论依据是，病灶细胞一旦有表达蛋白的改变，就会通过免疫学反应产生相应的抗体，抗体可以从血液中检测到，并且现有方法学可以检测到血液中微量的抗体。除此，还有检测外周血中微转移肿瘤细胞、微RNA为诊断指标的研究、DNA水平的基因突变等。④新方法学的开发和应用
方法学的灵敏度、特异性是评价其优劣的重要标准，蛋白检测主要有蛋白芯片技术、噬菌体展示技术、酶免疫技术等，mRNA检测主要有核酸芯片技术、RT-PCR技术等。噬菌体展示技术是近年用于新指标筛选的重要手段。噬菌体展示技术构建肿瘤蛋白文库，以此筛选血清中特异性指标已有部分报道， Zhong Li等报道了肺癌中的研究结果，取得较好效果，其产品诊断非小细胞肺癌的敏感性达90 %、特异性达95 %，都远远地高出现有的任何其它诊断方法。国内外文献报道的类似研究，主要还局限在肺癌、前列腺癌和卵巢癌，而在乳腺癌方面的报道并不多见。从发展趋势看，乳腺癌等的诊断指标筛选，主要是从全基因组层面展开；蛋白质是直接起生理作用的物质形式，因此也较DNA或RNA层面的研究更有价值；噬菌体展示技术可表达导入的单个基因，便于特定蛋白的针对性研究。因此，应用噬菌体展示构建全基因组蛋白文库，筛查新的蛋白质指标，已成重要研究趋势。有鉴于此，本发明人作为专门从事乳腺癌诊断检测的医生，结合在该领域多年工作的经验，对上述问题及前沿技术进行长期跟踪研究，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于克服乳腺癌现有肿瘤标志物不理想问题，旨在提高乳腺癌早期诊断的敏感性、特异性和准确率，利用一种特异性、敏感性强的诊断标志物制备诊断稳定性好、检测方便的用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的诊断试剂。本发明用于乳腺癌的早期诊断与鉴别诊断，更有利于乳腺癌患者的诊断和治疗，达到提高乳腺早期诊断敏感性和和准确性的目标。本发明的另外一个目的在于提供一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法。为实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种早期乳腺癌血清诊断试剂，所述诊断试剂以FTHl，或者FTHl联合hnRNPF为诊断标志物，可检测分离的待测血清中FTHl抗体，或者FTHl与hnRNPF的对应抗体，用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测。一种早期乳腺癌血清诊断试剂，包括FTHl ELISA板，FTHl ELISA板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的FTHl抗原或商业化购得的FTHl抗原包埋酶标板，4°C过夜，洗涤后5% BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合FTHl ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；FTHl ELISA板可由酶标仪于450 nm 波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，比值彡2. 0，判断为阳性， 比值< 2. 0，判断为阴性，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计笪弁。进一步，一种早期乳腺癌血清诊断试剂，还包括hnRNPF ELISA板，hnRNPF ELISA 板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的hnRNPF抗原或商业化购得的hnRNPF抗原包埋酶标板，4°C过夜，洗涤后5%BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合hnRNPF ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；hnRNPF ELISA板可由酶标仪于450 nm波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，结合FTHl ELISA 板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，进行判断，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05 计算，高于0. 05按实际OD值计算。一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法，包括以下步骤
(1)配液应用乳腺癌T7噬菌体特异表达FTHl抗原制成T7噬菌体液，或者直接商业化购买FTHl抗原液，或者直接商业化购买FTHl抗原粉制成FTHl抗原液；
(2)FTH1ELISA板的制备将T7噬菌体液或FTHl抗原液包被于酶标板，4°C过夜；经洗涤后，5% BSA/PBS室温封闭2小时；
(3)标本收集和处理抽待测外周血，分离待测血清；
(4)FTHl ELISA板的检测在酶标板的每孔中加入1 100稀释的待测血清室温孵育1 小时；洗涤后加入1:10 000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG，室温放置1小时；洗涤后加入显色剂A、B各1滴，37°C孵育15分钟，立即加入终止液；
(5)读板在酶标仪下450nm波长处读取OD值；
(6)根据OD值的阴性、阳性判断结果以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，比值彡2. 0，判断为阳性，比值< 2. 0，判断为阴性，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计算。进一步，一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法，还包括以下步骤
(1)配液应用乳腺癌T7噬菌体特异表达hnRNPF抗原制成T7噬菌体液，或者直接商业化购买hnRNPF抗原液，或者直接商业化购买hnRNPF抗原粉制成hnRNPF抗原液；
(2)hnRNPF ELISA板的制备将T7噬菌体液或hnRNPF抗原液包被于酶标板，4°C过夜；经洗涤后，5% BSA/PBS室温封闭2小时；(3)标本收集和处理抽待测外周血，分离待测血清；
(4)hnRNPF ELISA板的检测在酶标板的每孔中加入1 100稀释的待测血清室温孵育 1小时；洗涤后加入1:10 000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG，室温放置1小时；洗涤后加入显色剂A、B各1滴，37°C孵育15分钟，立即加入终止液；
(5)读板在酶标仪下450nm波长处读取OD值；
(6)根据OD值的阴性、阳性判断结果以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，结合FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，进行判断，阴性对照OD值低于0. 05 作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计算。进一步，所述第(6)步中根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD 值的比值，结合FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，是指 hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值或者FTHl ELISA板待测血清 OD值/阴性对照平均OD值的比值，任一比值彡2.0，即判断为阳性。从而明显提高乳腺癌诊断效果。本方法的理论依据现有研究发现(侯振江，张宗英.乳腺癌肿瘤标志物研究进展[J].医学综述2008，14(2): 224-226)在多种癌症的早期阶段、症状尚未出现，甚至病理学检测都不能发现变化时，癌症患者血液中就有了针对癌症的抗体。由于抗体更早出现在血清中，采用该技术方案可以达到更早期诊断的效果。本研究首先将噬菌体文库与正常对照组血清中的抗体结合，弃掉结合的噬菌体， 即剔除非特异性噬菌体。剩下的噬菌体再与乳腺癌患者的血清中的抗体结合，能特异结合的噬菌体被收集并被扩增。此为一轮正负亲和筛选，如此反复四轮，使能与乳腺癌特异性抗体结合的噬菌体将得到足够程度的富集。本发明人通过分离和研究健康女性血清和乳腺癌患者血清，经乳腺癌T7噬菌体文库处理，选择到与乳腺癌高度相关的高特异性和敏感性的特异噬菌体克隆，再对这些特异性克隆噬菌体作PCR扩增、测序，经全基因组表达谱中筛选比对，找到可用于乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物，最终研制出可便于临床应用的早期乳腺癌血清诊断试剂。本发明用于乳腺癌的早期诊断与鉴别诊断，提高乳腺癌早期诊断的敏感性、特异性和准确率，更有利于乳腺癌患者的诊断和治疗。以此解决乳腺癌现有肿瘤标志物不理想问题，达到提高乳腺早期诊断敏感性和和准确性的目标。该乳腺癌诊断标志物(hnRNPF :heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F, FTHl ferritin heavy chain 1)是从全基因组表达谱中筛选得到，选择时具有最大的全面性，即最大的代表性。该乳腺癌诊断标志物(hnRNPF、FTHl)经乳腺癌患者病灶组织、癌旁组织、正常对照组验证，是乳腺癌特异性标志物。该乳腺癌诊断标志物(hnRNPF、FTHl)不但在乳腺癌病灶组织特异性高表达，而且患者血清中也同步高表达，经验证，血清中该标志物高表达对乳腺癌的诊断具有较现有其他指标更高的准确性。该乳腺癌血清标志物是一种抗体，而如前述检测血清中相应抗体可达到更早期的诊断效果，这与以往报道和应用的抗原诊断标志物有完全不同的理念和效果。即本发明不但筛选到新的乳腺癌血清标志物，并且是用其抗体为检测对象的一种新方案。
本技术方案公开的乳腺癌诊断标志物具有较高的敏感性、特异性和准确率，因此据此制作的诊断试剂所需的待检血清非常少，再加上目前抗体检测技术成熟，可以极微量的情况下检测到其存在，弥补了抗原或者其他现有的诊断标志物在微量情况难检测到的不足，加上抗体更早出现在血清中，从达到早期诊断之目的。本发明开发的试剂，通过乳腺癌、乳腺良性肿瘤、其他癌症(非乳腺癌)患者及正常人血清应用的验证，具体见具体实施方式
部分。以下结合附图对本发明做进一步详细说明。
图1为噬菌体淘洗乳腺癌特异表达蛋白的过程。图2为插入乳腺癌特异基因的噬菌。图3为乳腺癌噬菌体展示肽库。A为原始库，B为扩增库。图4为部分噬菌体PCR扩增产物琼脂糖电泳图。M: DL 2000 Marker ;1 16随机克隆的插入片段PCR结果。图 5 为 hnRNPF mRNA 禾口 FTHl mRNA 的 RT-PCR 部分扩增产物电泳图。A :hnRNPF mRNA部分扩增产物电泳图，B :FTH1 mRNA部分扩增产物电泳图；M :DL2000 mark，1、2、3、4为乳腺癌病灶组织，5、6为乳腺癌旁组织，7、8为乳腺良性肿瘤组织，9为阴性对照用去离子水代替底物。图6为hnRNPF mRNA和FTHl mRNA在不同组织中的表达。图7为两指标在乳腺癌患者术前血清与健康女性血清中的表达差异分析。图8为两指标在血清及癌灶组织中的表达比较。图9为hnRNPF、FTH与CA15-3单项或联合诊断乳腺癌的ROC曲线。图10为ROC曲线下面积及95%可信区间。图11为两指标早期诊断乳腺癌的价值。图12为两指标与乳腺癌临床分期的关系。图13为两指标与乳腺癌病理分型的关系。图14为两指标与乳腺癌转移的关系。图15为hnRNPF抗体血清检测ELISA酶标板照片。图16为FTHl抗体血清检测ELISA酶标板照片。
具体实施例方式—、本发明所用标本来源、试剂耗材和主要仪器 1、标本来源
经本人及其家属同意，乳腺癌新鲜组织共40例，取自于医院乳腺和甲状腺外科2009年 5月至2010年5月手术的患者，病灶及癌旁组织切下后迅速转移到液氮罐，-80°C超低温冰箱保存备用；乳腺癌患者血清标本共273例，按照临床分期、病理分型及转移分组；同时取M例正常女性和40例患有其他肿瘤的女性患者血清样本作为对照组，-80°C超低温冰箱保存备用。具体临床资料见表1。表1乳腺癌患者、他癌症患者和正常对照人群的主要临床病理资料
权利要求
1.一种早期乳腺癌血清诊断试剂，其特征在于所述诊断试剂以FTH1，或者FTHl联合 hnRNPF为诊断标志物，可检测分离的待测血清中FTHl抗体，或者FTHl与hnRNPF的对应抗体，用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测。
2.一种早期乳腺癌血清诊断试剂，其特征在于包括FTHl ELISA板，该FTHl ELISA板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的FTHl抗原或商业化购得的FTHl抗原包埋酶标板， 4°C过夜，洗涤后5% BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合FTHl ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；FTHl ELISA板可由酶标仪于450 nm波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，比值> 2. 0，判断为阳性，比值< 2. 0，判断为阴性，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD 值计算。
3.如权利要求2所述的一种早期乳腺癌血清诊断试剂，其特征在于还包括hnRNPF ELISA板，该hnRNPF ELISA板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的hnRNPF抗原或商业化购得的hnRNPF抗原包埋酶标板，4°C过夜，洗涤后5% BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合hnRNPF ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；hnRNPF ELISA板可由酶标仪于450 nm波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD 值的比值，结合FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，进行判断，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计算。
4.一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法，其特征在于包括以下步骤(1)配液应用乳腺癌T7噬菌体特异表达FTHl抗原制成T7噬菌体液，或者直接商业化购买FTHl抗原液，或者直接商业化购买FTHl抗原粉制成FTHl抗原液；(2)FTH1ELISA板的制备将T7噬菌体液或FTHl抗原液包被于酶标板，4°C过夜；经洗涤后，5% BSA/PBS室温封闭2小时；(3)标本收集和处理抽待测外周血，分离待测血清；(4)FTHl ELISA板的检测在酶标板的每孔中加入1 100稀释的待测血清室温孵育1 小时；洗涤后加入1:10 000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG，室温放置1小时；洗涤后加入显色剂A、B各1滴，37°C孵育15分钟，立即加入终止液；(5)读板在酶标仪下450nm波长处读取OD值；(6)根据OD值的阴性、阳性判断结果以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，比值彡2. 0，判断为阳性，比值< 2. 0，判断为阴性，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计算。
5.如权利要求4所述的一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法，其特征在于还包括以下步骤(1)配液应用乳腺癌T7噬菌体特异表达hnRNPF抗原制成T7噬菌体液，或者直接商业化购买hnRNPF抗原液，或者直接商业化购买hnRNPF抗原粉制成hnRNPF抗原液；(2)hnRNPF ELISA板的制备将T7噬菌体液或hnRNPF抗原液包被于酶标板，4°C过夜；经洗涤后，5% BSA/PBS室温封闭2小时；(3)标本收集和处理抽待测外周血，分离待测血清；(4)hnRNPF ELISA板的检测在酶标板的每孔中加入1 100稀释的待测血清室温孵育 1小时；洗涤后加入1:10 000稀释的HRP偶联的山羊抗人IgG，室温放置1小时；洗涤后加入显色剂A、B各1滴，37°C孵育15分钟，立即加入终止液；(5)读板在酶标仪下450nm波长处读取OD值；(6)根据OD值的阴性、阳性判断结果以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，结合FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，进行判断，阴性对照OD值低于0. 05 作0. 05计算，高于0. 05按实际OD值计算。
6.如权利要求5所述的一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法，其特征在于所述第(6)步中根据hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，结合FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，是指hnRNPF ELISA 板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值或者FTHl ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，任一比值彡2. 0，即判断为阳性。
全文摘要
本发明公开一种早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法，所述诊断试剂采用的肿瘤标志物为FTH1，或者FTH1联合hnRNPF，检测待测血清中FTH1抗体，或者FTH1与hnRNPF的对应抗体，用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测；本发明开发的试剂，通过乳腺癌、乳腺良性肿瘤、其他癌症(非乳腺癌)患者及正常人血清应用的验证。本发明用于乳腺癌的早期诊断与鉴别诊断，旨在提高乳腺癌早期诊断的敏感性、特异性和准确率，更有利于乳腺癌患者的诊断和治疗。以此解决乳腺癌现有肿瘤标志物不理想问题，达到提高乳腺早期诊断敏感性和准确性的目标。
文档编号G01N33/574GK102393458SQ201110246380
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月24日 优先权日2011年8月24日
发明者李志国, 董学君 申请人:绍兴市人民医院