专利名称：一种制备型多维液相色谱仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在线二维制备液相色谱体系，通过二位十通阀及软件将中高压系统有机结合。一维系统既可以是中低压系统，也可以是高压系统；当一维分离系统完成分离制备后，经过二位十通阀切换，可以进入到第二维色谱柱，进行第二维分离；可以有两根富集柱同时在线进行富集。本发明的优点是项目集合了最前沿的相关色谱技术并加以创新，实现高中低高压柱色谱与制备型RP-HPLC的全二维联用，以二位十通阀-色谱工作站-自动流份收集器的结合实现自动化操作。通过本系统，将省去成分分离过程中溶液浓缩、样品转移及薄层检测等人工操作，大大提高成分分离的效率。其创新点如下
背景技术：
天然来源成分的分离与制备一直是中药及天然药物研究过程中的一大瓶颈。由于 天然产物是复杂体系，通常一个样品中包含了几十甚至几百种组分，而各组分之间量的差别通常又很大。因此，为了达到成分分离的目的，往往要结合多种色谱填料，进行反复的柱色谱分离操作。这一过程是繁琐、漫长而枯燥的首先用柱色谱对天然产物提取物进行分离并对分离的流份进行分段收集，通过TLC检测确定所需合并的流份，浓缩后再根据情况进行进一步的色谱柱分离(有时可能需要多次重复上述过程)，最终，用制备型HPLC进行分离，色谱峰收集后进行浓缩，由于流动相一般含有相当比例的水，浓缩步骤也比较耗时。天然产物往往在冗长、繁多的柱色谱分离、溶剂浓缩和样品转移操作中受到损失或者结构发生变化，研究者不得不加大投料量以求获得理想的结果。因此，如何最大限度减少人工操作、实现自动化分离，以提高效率、突破传统方法所形成的瓶颈，显得迫在眉睫。多维液相色谱技术近10年来，分析型的色谱仪器获得了突飞猛进的发展，UPLC、HPLC-DAD_MS已经普及，MDLC(multidimensional liquid chromatography,多维液相色谱)的出现更为中药及天然产物成分的分析提供了更强有力的工具。MDLC是在高效液相色谱(HPLC)基础上发展起来的一项技术，它通过在技术上及设备上的改进，组合不同的分离模式构建多维系统，有效地解决了复杂体系样品的分析问题。与一维液相色谱系统相比，MDLC主要的优势在于提供了不同寻常的峰容量，这使得大多数目标化合物和可实现基线分离。多维液相柱色谱的实现主要通过改变一定条件下特定样品的选择性，并在不同色谱柱间的切换来实现。在构建多维液相色谱最关键的是固定相的选择以及如何将样品组分有效地导入第二维色谱柱中，即接口切换技术。接口切换技术是MDLC的核心技术之一。Jorgenson等人早在1990年在研究“中心切割”技术的基础上第一次实现了“全二维切割”，他们用两个定量管和一个八通阀实现了离子交换色谱(IE)和体积排阻色谱(SEC)的在线连接。自此，以四通阀、六通阀、八通阀、十通阀为代表的接口模式偶联的全二维或多维色谱模式纷纷被设计运用。现有MDLC技术的不足由于蛋白质组学的需要，MDLC技术得到快速发展，相关的技术方法也是为了适应蛋白质组学大分子分析目的而建立的。在中药研究上虽然有所应用，但也仅局限于样品的分析。然而，在多数情况下，仅仅满足分析需求是不够的，如在关注天然产物中的未知及微量成分的时候，在需要更多的单体用于活性测定的时候，就需要对天然产物组分进行分离和制备，现有的MDLC技术无法满足需求，主要体现在I、大容量样品、流动相与现有接口切换技术不兼容现有的MDLC接口切换技术能够满足分析的需求，却无法直接应用于成分的分离制备。这是由于分离制备操作过程中需要处理的更大样品量，接口要经过体积更大的流动相的缘故。分析操作时，通过降低一维色谱流速、减少二维色谱的进样量，由流动相所带来的溶剂效应基本可以忽略。但在制备色谱中，溶剂效应问题是必须要解决的，这对接口切换技术提出更高的要求。II、固定相选择的局限目前的MDLC更多采用的是SEC、RP、AC、IEC、HILIC之间的组合，这对大分子的分析更为有利。MDLC应用于中药成分分析时，常常以ODS(RP)作为二维，一维的色谱柱常常选·择IEC、HILIC，CN柱、NH2柱或其它类型的RP柱。IEC的使用范围有限，多用于含生物碱样品的分析；HILIC，CN柱、NH2柱等其它类型的RP柱与ODS柱之间的正交性较差，联用之后的峰容量提高有限。在天然产物成分研究中最常使用的色谱填料Sephadex LH20，聚酰胺(PA)，却没有得到应有的重视。Sephadex LH20兼具分子筛和分配的色谱作用，特别适合天然产物成分的分离；聚酰胺(PA)所独具的氢键作用力色谱行为使其在分离具有酚羟基或羰基的化合物时有特殊的效果。将Siiphadex LH20，聚酰胺的作用力特点与ODS的分配机理结合，能够获得更高的峰容量。
发明内容
虽然MDLC技术在分析色谱中得到了较成功的应用，但要将其应用于天然产物成分分离的制备色谱中，需要对现有系统加以改造创新，也还有很多技术问题需要解决。本项目将通过制备型MDLC的构建，借以突破天然产物成分研究中的瓶颈，改观目前成分分离技术水平低下、步骤繁琐、周期漫长的现状。I.项目集合了最前沿的相关色谱技术并加以创新，以流动相稀释-富集柱捕集接口为关键的技术突破，实现高中低压柱色谱与制备型RP-HPLC的全二维联用，以二位十通阀-色谱工作站-自动流份收集器的结合实现自动化操作。通过本系统，将省去成分分离过程中溶液浓缩、样品转移及薄层检测等人工操作，大大提高成分分离的效率。其创新点如下2.项目方案所设计的制备型MDLC仪器系统，该系统由高中低压柱ID色谱，制备型RP-HPLC的2D色谱系统构成。色谱柱间以基于二位十通阀的流动相稀释-富集柱捕集接口实现全二维切换。3.首次将MDLC应用于成分分离制备，现有的MDLC系统均只能满足分析的需求，却无法直接应用于成分的分离制备。这是由于分离制备操作要处理的样品量更大，所要经过的流动相体积更大的缘故。MDLC系统进行分析操作时，可以通过降低一维色谱流速、减少二维色谱的进样量等方式来消除由流动相所带来的溶剂效应。但在制备色谱中，溶剂效应问题是必须要解决的，这对接口切换技术提出更高的要求，我们为此专门设计的流动相稀释-富集柱捕集接口能够很好地解决上述问题，可以很好的用于成分分离制备。这项工作在国内外均属首次尝试。实施方式实施例I结合
图1，图2说明本发明的制备二维色谱分离系统。步骤I :二位十通阀在图I状态下，将分离待纯化的物质提取液由泵2泵入到一维柱色谱进行粗分。得到的化合物组分群经由出口 3进入到富集柱2，富集柱2将目标化合物富集。步骤2 :将二位十通阀切换到图2状态，泵I将洗脱液泵入到富集柱2中，将步骤I富集得到的化合物洗脱到二维色谱柱中进行精细分离，得到目标化合物。与此同时，泵2继续将一维柱色谱得到的组分经出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I将目标化合物富集。 反复进行步骤I及步骤2，整个过程始终保持一维柱色谱粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，与此同时，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二维色谱柱进行精细分离。
实施例粉碎的大黄药材500g，水提取3次，每次3000ml水，合并滤液，HP20树脂洗脱，得到待分类样品。待分离的样品的HPLC检测条件仪器型号Agilent 1100型HPLC，色谱柱=Cosmosil 卩八0-(18，4.6\250臟，洗脱条件5%^ 100% MeOH，lml. min-1，40min，检测波长254nm。HPLC分析图谱见图3样品的多维制备分离第一维中低压液相色谱参数中低压输液泵，流速lml. min- ;色谱柱Φ 2. 2cmX30cm,以粒径75 μ M的ODS填充；流动相30 % — 60 %的甲醇/水梯度洗脱，共洗脱700ml ;稀释液参数稀释液为水，流速为lml. min-1 (I I混合)。富集柱0DS，粒径5 μ Μ, Φ 2cmX 5cm(柱体积15· 7ml)。第二维制备型高效液相色谱参数流速8ml. min-1 ;色谱柱Cosmosil PAQ-C18,5 μ Μ, Φ2ο Χ 25cm(柱体积78.5ml);流动相20%— 80 %的甲醇/水梯度洗脱，50min ；254nm检测。多维液相图谱见图4。图4与图3相比，经过多维制备分离的样品，已经有效的将化合物组分群按照极性大小分离开，与普通的I维色谱相比，节约时间和使用的溶剂。
权利要求
1.一种制备型多维液相色谱仪，包括一维柱色谱，二维柱色谱，富集柱1，富集柱2，泵1，泵2，特征在于，泵2将待分离组分经过一维柱色谱粗分的化合物群组分不断的分配给富集柱I和富集柱2。当泵2将化合物组分群分配给富集柱I时，泵I将富集柱2富集到的有效组分洗脱到二维柱色谱进行精细分离。当泵2将化合物组分群分配给富集柱2时，泵I将富集柱I富集到的有效组分洗脱到二维柱色谱进行精细分离。
2.根据权利要求所述的制备型多维液相色谱系统，特征在于一维色谱柱可以使用高中低压色谱柱。
3.权利要求I所述的制备型多维液相色谱仪的使用方法，特征在于包括如下操作步骤 a)二位十通阀在图I状态下，将分离待纯化的物质提取液由泵2泵入到一维柱色谱进行粗分。得到的化合物组分群经由出口 3进入到富集柱2，富集柱2将目标化合物富集。
b)步骤2:将二位十通阀切换到图2状态，泵I将洗脱液泵入到富集柱2中，将步骤I富集得到的化合物洗脱到二维色谱柱中进行精细分离，得到目标化合物。与此同时，泵2继续将一维柱色谱得到的组分经出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I将目标化合物富集。
c)反复进行步骤I及步骤2，整个过程始终保持一维柱色谱粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，与此同时，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二维色谱柱进行精细分离。
全文摘要
本发明涉及一种多维液相色谱联用分离装置。项目方案所设计的制备型多维液相色谱仪器系统，该系统由高中低压柱1D色谱，制备型RP-HPLC的2D色谱系统构成。色谱柱间以基于二位十通阀的流动相稀释-富集柱捕集接口实现全二维切换。该系统集中高低压柱色谱大容量的样品处理能力，制备型RP-HPLC的高效分离能力于一体，实现高中低压柱色谱与制备型RP-HPLC的全二维联用，以二位十通阀-色谱工作站-自动流份收集器的结合实现自动化操作。通过本系统，将省去成分分离过程中溶液浓缩、样品转移及薄层检测等人工操作，大大提高成分分离的效率。
文档编号G01N30/08GK102961892SQ20111025630
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者李贺然, 丘鹰昆 申请人:李贺然, 丘鹰昆