专利名称：苯巴比妥快速检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测微量镇静类药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量苯巴比妥的试纸条。技术背景
现代养殖业为人类提供了丰富的肉、禽、奶、蛋等营养价值高的各种食品，改善了人类的饮食结构，提高了人类的物质生活和健康水平，为延长人类的寿命作出了贡献。与此同时，现代科学研究证明，养殖业中大量使用饲料添加剂，以及防病治病需要，大量使用抗生素、激素及其它合成药物，在促进动物生长、降低动物发病率与死亡率、提高饲料利用率的同时，也造成了动物性食品中药物残留和激素残留。另外由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，在养殖业中非法使用违禁药物、滥用抗菌药和饲料添加剂、不遵守休药期、配伍禁忌等有关规定的现象普遍存在，在我国情况亦为严重。滥用药物的直接后果是导致药物在动物性食品中的残留增加，并通过食物链的传递进入人体，对人类的生命健康构成威胁和危害。如癌症发病率增加，人类生育畸形比例增加，人体抗药性增强，青少年性早熟和某些食物中毒等现象，往往与动物性食品中药物、激素残留增加密切相关。苯巴比妥(Phenobarbital，简称PB)又名鲁米那，也叫迦地那，具有镇静、催眠、抗惊厥、抗癫痫等药效作用，临床上主要用于治疗焦虑、失眠、癫痫发作、运动障碍、高胆红素血症等疾病。PB具有很强的毒副作用，过量服用可抑制中枢神经系统，造成急性死亡；长期服用可导致眩晕困倦、运动失调、剥落性皮炎、肺功能不全、肝肾损害等副作用。另外还具有致畸作用，可引起胎儿腭裂和兔唇，影响智力发育。由于PB具有镇静、催眠等特殊的生物学功能，常被非法用于饲料添加剂，在肉猪饲料添加剂生产中应用更为严重，其药物残留严重危害着人们的身体健康和生命安全。因此各国政府都严禁PB用作饲料添加剂。2002年我国农业部、卫生部、国家药品监督管理局根据《饲料和饲料添加剂管理条例》、《兽药管理条例》、《药品管理法》的规定，联合发布公告，公布了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第1 7 6号)，苯巴比妥名列其中，要求对饲料生产、经营、使用和动物饮用水中非法使用违禁药物的违法行为严厉打击。但目前尚未建立国家检测标准，PB用作饲料添加剂的现象仍然存在，PB残留中毒事件时有发生，动物性食品中PB残留对人体的危害愈来愈引起人们的重视。目前用于精神类药品的监测方法主要是理化检测法，包括高效液相色普法 (HPLC),气-质联用法(GC/MS)，液-质联用法(LC/MS)等，这些方法检测苯巴比妥灵敏度高，特异性强，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，从样品预处理到得出检测结果至少需要2天时间；同时这种检测方法需要大型专门仪器设备和专业技术人员操作，无法进行现场检测，时效性差，难以推广。另外免疫学检测方法主要是酶联免疫吸附法 (ELISA)，以竞争性酶联反应为检测原理，反应显色后用酶标仪测OD值，OD值越低表示被检样品中苯巴比妥含量越高。检测过程约2 4小时，大大缩短了检测时间，降低了检测费用， 既可定性又可定量检测，但是出现假阳性或假阴性的概率较大。由于ELISA是一种敏感性很强的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。目前苯巴比妥免疫学检测方法在国内尚属空白，急待研究解决。
发明内容
本发明的目的研制出特异、灵敏、快速、简便的快速检测微量苯巴比妥的试纸条。本发明的技术方案是
该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为测试端吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG，或羊抗兔IgG抗体溶液印制的直线式对照印迹；
测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜；金标抗体纤维层用吸附苯巴比妥的金标抗体玻璃纤维棉，苯巴比妥金标抗体为胶体金标记的苯巴比妥单克隆抗体或多克隆抗体，偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液为苯巴比妥与载体蛋白偶联的复合物溶液；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜；
偶联苯巴比妥的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或鸡卵清白蛋白(0VA)，或为匙孔血蓝蛋白(KLH)，在纤维素膜层上设有直线式检测印迹和直线式对照印迹，两印迹平行排列组合为“ I I ”；
在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0. 5cm处；
吸水材料层用吸水滤纸，支撑层即不吸水薄片层，用不吸水的韧性材料；不吸水的韧性材料用硬质塑胶条，或不吸水的硬纸条。快速检测微量苯巴比妥的试纸条具有以下优点
⑴特异性强，灵敏度高。本发明试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对单克隆抗体的特异性及亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较强的特异性和较高的灵敏度，可检测到1 IOppb的微量苯巴比妥。本发明在保障食品安全，保护消费者健康方面具有极其重要的意义。⑵简便、快速。使用本发明试纸条，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。只要将试纸条插入被检样品10 20秒钟，5分钟内即可判定检测结果。⑶结果显示形象、直观、准确。本发明试纸条以显示棕红色“ I ”和“ I I ”印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“ I ”印迹为阳性，表示被检样品中含有苯巴比妥；显示两条棕红色“ I I ”印迹为阴性，表示被检样品中不含苯巴比妥。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。⑷节省费用。使用快速检测试纸条，无需另配仪器设备和其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。ω适用范围广，便于推广应用。快速检测试纸条操作简便，能满足不同层次人员需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等， 具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
图1为苯巴比妥快速检测试纸条结构示意图。图2为苯巴比妥快速检测试纸条俯视结构示意图。
具体实施例方式
要制成快速检测微量苯巴比妥试纸条，首先要制备偶联苯巴比妥载体蛋白和苯巴比妥金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维。其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔 IgG)抗体，用于制备对照印迹。( 1)苯巴比妥与载体蛋白偶联
采用重氮化法或戊二醛法，将苯巴比妥与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。第一步硝化反应引入硝基，取lmmole PB，加入5mmole HN0jP5mmole 混酸溶液，55°C密闭条件下反应lh，加入4倍ddw，5000rpm离心5min，取沉淀物干燥备用，产物为对硝基苯巴比妥(pNPB)；
第二步还原反应引入氨基，取lmmole pNPB溶解于IOml lmol/L HCl中，加入Si粉 3mmole，65°C密闭条件下反应40min，用ddw洗涤三次，5000rpm离心5min，沉淀物溶解于 IOml 二甲基甲酰胺(DMF)，再加入IOOml ddw，5000rpm离心lOmin，取沉淀物干燥备用，产物为对氨基苯巴比妥(PAPB)；
第三步重氮化反应偶联，取50mg pAPB溶于Iml lmol/L NaOH溶液中，加入IOOmg NaNO2,冰浴条件下用lmol/L HCl调pH为1，密闭，避光，4°C搅拌反应他。然后加入预冷的 20mg BSA或OVA或KLH 0. 01mol/L的PBS溶液，4°C搅拌反应过夜。反应液用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25过柱纯化，制得人工结合抗原BSA-pAPB或OVA-pAPB或KLH-pAPB，冻干，一 20°C保存备用。(2)抗苯巴比妥单克隆抗体或多克隆抗体的制备
单抗制备以 IOOPg/只的苯巴比妥载体蛋白偶联物免疫8周龄BALB/c小鼠 3 4次，每次免疫间隔时间3 5周，最后一次超强免疫后3 4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；拉颈致死，用75%酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，IOOOrpm离心lOmin，收集脾细胞。将IX IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，IOOOrpm离心IOmin弃上清，细胞沉淀物于37°C 水浴中缓缓加入0. 7 1. Oml的50%PEG4000作用lmin，然后缓缓加入无血清1640培养基 15ml,以终止PEG的作用，37°C水浴5 10 min, IOOOrpm离心IOmin弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔(100μ1 200μ1/孔)，置于37°C 5%C02 培养箱中培养。培养10 14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、 细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞染色体数目为96 102条，平均98. 6条，其分泌的单克隆抗体可特异地与苯巴比妥反应，亲和力常数达到101° 1012，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG1UgG2aUgG2b, 针对苯巴比妥特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体玻璃纤维棉。多抗制备用苯巴比妥载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为200μβ 500μδ /次，背部皮下分4 6点注射。首免，用无菌PBS溶解苯巴比妥载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解苯巴比妥载体蛋白偶联物，与等量FIA 混合，充分乳化，首免后2 3周进行，连续免疫4 5次，每次间隔2 3周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到IO5以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取1份高免血清加2份PBS (ρΗ7. 2)混勻，加等体积饱和硫酸铵溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清，以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (pH7. 2)透析48 72h，中间换液数次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，得纯化的抗苯巴比妥多克隆抗体，一 20°C冻存， 用于制备金标抗体玻璃纤维棉。(3)苯巴比妥金标抗体和金标抗体玻璃纤维棉的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，即在沸腾的200ml 0. 01 0. 02%氯金酸溶液中加入新鲜配制的1 %柠檬酸钠8ml，获得直径约15nm的胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3调 pH值至8. 5 9. 5，置2 8°C保存备用。以1 :2000的标记比将待标记的苯巴比妥单克隆抗体或多克隆抗体加入PH8. 5 9. 5的金溶胶中，标记IOmin后，加入20 %的PEG10000至终浓度为0. 05%,4°C>1500 3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000rpm 离心lh，弃上清，获初步纯化的金标抗体蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S - 400柱层析进行分离纯化，获得苯巴比妥胶体金标记抗体。将1 :100 1 :500稀释的胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，4°C低温真空干燥，制备苯巴比妥金标抗体玻璃纤维棉。(4)羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体的制备
以饱和硫酸铵提取苯巴比妥阴性小鼠血清IgG(或阴性兔血清IgG)，即取1份小鼠血清 (或兔血清)加2份PBS (pH7. 2)混勻，加等体积饱和硫酸铵溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、 2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度 33%，置41冰箱》1，41、2500印111离心15min，弃上清，以适量PBS(pH7. 2)溶解沉淀，置4°C 冰箱内用PBS (ρΗ7· 2)透析48h，中间换液3次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以 lOOPg/kg体重的小鼠血清(或兔血清)IgG经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次，末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1 2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于苯巴比妥快速检测试纸条对照印迹的制备。(5)苯巴比妥快速检测试纸条检测反应原理
当苯巴比妥快速检测试纸条测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测苯巴比妥及金标抗体玻璃纤维棉中的金标抗体一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入手柄端吸水滤纸。在扩散过程中，待测苯巴比妥可与金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上苯巴比妥的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联苯巴比妥载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体则可与金标抗体结合，形成棕红色对照印
迹带“ I ”，即一条棕红色带“ I ”印迹为阳性表示。反之样品溶液中无苯巴比妥则不能阻止金标抗体与纤维素膜上偶联苯巴比妥载体蛋白的检测印迹结合，显示棕红色检测印迹带“ I ”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示棕红色对照印迹带“ I ”，形成两条棕红色带“ I I ”为阴性表示。如果纤维素膜上没有棕红色带显示， 则表明试纸条已失效。实施例一、参见图1和图2。图中1为支撑层，用硬质塑胶条制成，2为测试端吸附纤维层，用玻璃纤维棉制成，3为苯巴比妥金标抗体纤维层，根据上述具体实施方式
(3)所述的制备方法，制备吸附有抗苯巴比妥单克隆抗体金标抗体玻璃纤维棉，4为纤维素膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，5为手柄端的吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号2、3、4、5 各层从左至右粘贴固定在塑胶薄片条1上，彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上，6为隐形检测印迹带，偶联苯巴比妥载体蛋白溶液为牛血清白蛋白(BSA)，在纤维素膜上印迹制成检测“ I ”，7为隐形对照印迹带，用羊抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上印迹制成“ I ”，两条印迹带平行排列形成组合印迹带“ I I”。8 — 1为覆盖在纤维层2和金标抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，8 — 2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端其它颜色保护膜(如黄色)，9为测试样品标记线，即在纤维层2与金标抗体纤维层3交界处，对应的白色保护膜偏向纤维层2 —侧约0. 5cm处印制的标记线，在标记线右侧保护膜上印有箭头及max字样。待测样品溶液的制备及检测操作步骤
检测样品制备检测肉样，可将样品剪碎、磨细，以生理盐水稀释制成 1 :2 1 :10 待测样品悬液；检测奶样，可直接用生理盐水将奶样稀释制成1 :2 1 :5待测样品
悬液；检测血样，则提取血清并用生理盐水将其稀释制成1 :2 1 :10待测样品；检测尿样， 可直接取尿液作为待测样品。操作方法将苯巴比妥快速检测试纸条样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约10 20秒钟取出检测试纸条，水平放置，在5 10分钟观察判定检测结果。结果判定(a)阳性如果在纤维素膜上显示有一条棕红色印迹带“ I ”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有苯巴比妥；(b)阴性如果在纤维素膜上显示有两条棕红色印迹带“I I”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含苯巴比妥；(C)失效如果在纤维素膜上没有棕红色带显示，则表明试纸条已失效。实施例二、苯巴比妥快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于支撑层1用不吸水的硬纸条制成，测试端吸附纤维层2用尼龙膜，苯巴比妥金标抗体纤维层3 吸附有抗苯巴比妥多克隆抗体，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形对照印迹带7用羊抗兔 IgG抗体溶液在纤维素膜上制备而成。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不重述。实施例三、苯巴比妥快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，隐形检测印迹带6中偶联苯巴比妥载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，隐形对照印迹带7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上制备而成。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不重述。实施例四、苯巴比妥快速检测试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于测试端吸附纤维层2用聚酯膜，隐形检测印迹带6中偶联苯巴比妥载体蛋白溶液为为匙孔血蓝蛋白(KLH)。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不重述。
权利要求
1.苯巴比妥快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，其特征是吸附层从测试端依次为测试端吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG，或羊抗兔IgG抗体溶液印制的直线式对照印迹。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酯膜。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是金标抗体纤维层用吸附苯巴比妥的金标抗体玻璃纤维棉，苯巴比妥金标抗体为胶体金标记的苯巴比妥单克隆抗体或多克隆抗体， 偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液为苯巴比妥与载体蛋白偶联的复合物溶液。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是偶联苯巴比妥的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或鸡卵清白蛋白(0VA)，或为匙孔血蓝蛋白(KLH)，在纤维素膜层上设有直线式检测印迹和直线式对照印迹，两印迹平行排列组合为“ I丨”。
6.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0. 5cm处。
7.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是吸水材料层用吸水滤纸，支撑层即不吸水薄片层，用不吸水的韧性材料。
8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征是不吸水的韧性材料用硬质塑胶条，或不吸水的硬纸条。
全文摘要
苯巴比妥快速检测试纸条，涉及一种快速检测微量镇静类药物的器具，特别是涉及一种快速检测微量苯巴比妥的试纸条。它含有底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为测试端吸附纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的直线式对照印迹。苯巴比妥金标抗体为胶体金标记的苯巴比妥单克隆抗体或多克隆抗体，偶联苯巴比妥的载体蛋白溶液为苯巴比妥与载体蛋白偶联的复合物溶液。偶联苯巴比妥的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或鸡卵清白蛋白(OVA)，或为匙孔血蓝蛋白(KLH)。本发明的试纸条具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。
文档编号G01N33/577GK102353786SQ20111025750
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者张海棠, 王自良, 石洪波 申请人:石洪波