专利名称：利用液相色谱检测系统定量口蹄疫抗原中146s含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种定量口蹄疫抗原中146S含量的检测方法，特别涉及一种利用液相色谱检测系统定量蔗糖密度梯度离心样品中口蹄疫抗原146S含量的方法。属于生物检测领域。
背景技术：
在口蹄疫病毒样品中，存在4种大小不同的病毒粒子，最大的为完整病毒粒子，沉降系数为146S，稍小的一种颗粒为空衣壳，沉降系数为75S，还有一种为衣壳蛋白亚单位，沉降系数为12S，最小的一种为VIA抗原，沉降系数为3 4. 5S。在动物免疫中，与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是口蹄疫146S抗原，146S含有口蹄疫病毒所有的中和位点，是口蹄疫病毒的有效抗原成分。动物只有免疫足够的146S抗原才能有效的刺激机体的免疫系统，产生良好的体液免疫和细胞免疫。146S的含量是评价疫苗质量好坏的一个重要标准，目前已经报道的口蹄疫抗原定量检测技术主要有1.细胞半数感染量(TCID50)测定2.补体结合试验(CFT) 3. ELISA定量口蹄疫146S含量4.蛋白层析分析法5.荧光定量PCR进行疫苗中抗原含量的定量等。方法I是对病毒核酸进行检测，除测定完整病毒粒子外，还测定了 146S裂解产物的核酸，不能完全反映病毒的免疫原性，也不能测定灭活后病毒样品；方法2准确性、敏感性不好，且不能很好的区分146S和12S ;方法3需针对不同型的病毒分别筛选单克隆，成本较高周期较长，目前没有商品化的产品，仅限于学术研究；方法4，5成本较高，操作复杂，在实际生产中实用性较低。建立一种快速准确的146S抗原定量检测方法，对于提高疫苗的生产效率和质量控制具有重要意义。中国专利公开号CN101655452A，
公开日为2010年2月24日，发明创造名称为“蔗糖密度梯度紫外光定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法”，该申请案公开了一种利用蔗糖密度梯度离心紫外光定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法，其不足之处在于首先该发明的前期样品处理工艺复杂，而且没有充分去除样品中的杂蛋白和核酸，影响下一步定量的准确性；其次，计算公式所需参数繁杂，没有检测图谱辅以支持，而且国内外的连续流紫外光度计难以满足该公式的需求参数，应用受限。本发明的方法利用液相色谱检测系统在259nm处连续检测蔗糖密度梯度离心样品，146S含量计算公式简便；与现有授权专利比较，本方法采用硫酸鱼精蛋白先去除部分杂蛋白和核酸，又经PEG6000浓缩进一步去除绝大部分的杂蛋白和核酸，两者的结合极大的避免了杂蛋白和核酸在259nm处的紫外吸收对146S吸收峰的影响，而且经过硫酸鱼精蛋白处理后，去除了大部分的核酸，避免了因核酸粘稠病毒重悬不彻底造成的误差，进一步提高了 146S含量测定的准确性；使用精度和准确性较高的液相色谱检测系统，使得超速离心后样品的检测更加精确和快捷，根据朗博-比尔定律及定积分原理，得出计算公式，该公式需四个参数样品通过样品池的流速、检测系统样品池光程长度、146S吸收峰面积和上样量，样品池光程是既定已知的，样品通过样品池的流速和上样量都是可控的，146S吸收峰面积由色谱工作站自动生成。采用这种方法可以精确、快速地测定口蹄疫抗原样品中146S含量，可以用于监测生产过程中病毒抗原的含量，指导疫苗配制并间接评价疫苗效力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种口蹄疫抗原146S含量定量检测的方法，本发明的方法其特征在于包括以下步骤(I)病毒纯化向待测的口蹄疫病毒样品中加入硫酸鱼精蛋白，使加入的硫酸鱼精蛋白的终浓度为0. 5 2. Omg/ml,室温作用0. 5 2h, 5000 IOOOOrpm离心15min lh，分离得到上清液；所述的口蹄疫病毒为任何型或亚型的口蹄疫病毒毒株或其灭活毒株。 在本发明的具体实施例中，所述的口蹄疫病毒毒株为牛Asia I/JSL/GSZY/06毒(Asia I/JQ株空衣壳疫苗对Asia I型FMDV两株不同毒株免疫效果的测定，李志勇等，首届中国兽药大会一一兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008))、牛0型0NXC/92毒(口蹄疫病毒0型-Asia I型二价灭活疫苗毒种种子批的建立(I)，徐春河等，中国畜牧兽医学会口蹄疫学分会第十一次学术研讨会会议论文)、猪0型0/ZK/93毒(猪口蹄疫0型灭活疫苗0ZK/93株与0ZK/93株+0S/99株免疫效果对比试验，徐新红等，饲料与畜牧 规模养猪2010，(9))购买自兰州兽医研究所；(2)PEG6000浓缩病毒按质量体积百分比计，向获得的上清液中加入NaCl，使NaCl的终浓度为2 6%，充分溶解后加入PEG6000，使PEG6000的终浓度为5 10%，2 8°C下搅拌混合I 16h，5000 IOOOOrpm离心I 2h，获得口蹄疫病毒沉淀，使用TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到病毒浓缩液；(3)蔗糖密度梯度超速离心制备质量体积比(g/ml)为15% 45% (即蔗糖浓度为15 45g/100ml)的均匀线性蔗糖梯度液，将步骤(2)得到的病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，6 10°C, 30000 40000rpm,离心2. 5 3. 5h,得到超速离心样品；(4)液相色谱检测系统检测将步骤(3)得到的超速离心样品连续通过液相色谱检测系统，对超速离心样品在波长259nm处的吸收值进行连续检测，得到超速离心样品在波长259nm处的吸收图谱；优选的，本发明所用液相色谱检测系统系统应使用准确性较高，光源稳定、波长精确度高的检测器，并配套有相应的自动分析软件(即色谱工作站)；恒流泵应使用压力稳定、精确度高、消除脉冲的稳压恒流泵。在本发明的一个具体实施例中，所使用液相色谱检测系统购自莱伯泰科公司，是由液相色谱检测器、色谱工作站和恒流泵组成，液相色谱检测器型号为UV600紫外-可见可变波长检测器，恒流泵型号为P600高压恒流泵。(5)计算146S含量根据液相色谱工作站所测得的146S在259nm处的吸收峰面积，由以下公式计算出146S的含量，C = FES/76ffb上述公式中，C为样品中146S含量；Fk为样品通过样品池的流速；S为液相色谱工作站在波长259nm处所检测样品中146S的吸收峰面积；W为加在梯度液上的病毒样品的体积山为流动样品池的光程长度。
根据本发明的一个优选实施例，步骤(I)中使加入的硫酸鱼精蛋白的终浓度为lmg/ml,室温作用Ih。根据本发明的一个优选实施例，步骤(I)中所述的离心转速为7000rpm，离心30mino根据本发明的一个优选实施例，步骤(2)中按质量体积百分比(g/ml)计，向获得的上清液中加入NaCl，使其终浓度为4% (即IOOml上清液中所加入的NaCl为4g)，充分溶解后加入PEG6000，使其终浓度为8% (即IOOml上清液中所加入的PEG6000为8g)，4°C搅拌混合2 6h，7000rpm离心lh，获得口蹄疫病毒沉淀。根据本发明的一个优选实施例，步骤(2)中所述的TEN缓冲 液为含有0. OlMTris,0. OlM EDTA,0.1M NaCl 的溶液，PH 为 7. 6 8. 0.根据本发明的一个优选实施例，用所述的TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到的体积为病毒样品体积1/100-1/50病毒浓缩液，更优选为用所述的TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到的体积为病毒样品体积1/100病毒浓缩液。所述的病毒样品体积是指步骤(I)中所述的待测口蹄疫病毒样品的体积。根据本发明的一个优选实施例，步骤(3)中所述的蔗糖密度梯度超速离心为8°C，35, OOOrpm,离心 3. 5h。本发明中，所用液相色谱检测系统为浓度型检测系统，通过液相色谱工作站所检测样品中的146S在259nm处的吸收峰面积，根据朗博-比尔定律及定积分原理，得出计算146S含量的公式。具体推导如下朗博-比尔定律A = Ebc,公式中，c是所测样品浓度，单位g/L ；A为吸光度；b是样品液层厚度，通常为样品池的厚度也即光程长度，单位cm ；E为吸光系数，单位L/ (g cm)，吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关，只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。推导出c=A/Eb，样品流经样品池一段时间A t时，流经样品池的样品体积V = Fk A t，其中Fk为样品流经样品池的流速；继而得出一段时间At流经样品池的146S的质量m = AFe A t/Eb,根据定积分原理，流经样品池的146S的总质量M=Jt2m = Jt2 AFrAt/EbM =Fr/Eb j a Adt在本方法中，口蹄疫146S抗原在259nm处的吸光系数E为76 ;根据定积分原理，146S在波长259nm下连续流经样品池所对应的每一时间点的吸光度值(A)的定积分之和，即为口蹄疫146S在波长259nm处连续流经样品池形成的吸收峰面积S，也即S=f = Adt ,
tl、t2分别为146S吸收峰开始和结束时间。继而推导出流经样品池的总的146S的质量M = SFE/76b如W为密度梯度超速离心上样量，单位ml，则计算出所测样品中口蹄疫146S的含量C = SFE/76Wb
上述公式中，C为样品中146S含量；S为液相色谱工作站在波长259nm处所检测样品中146S的吸收峰面积；FK为样品流经样品池的流速；b为流动样品池的光程长度；W为所检测病毒样品的上样量。相较于现有技术，本发明的优点在于1、采用硫酸鱼精蛋白先去除部分杂蛋白和核酸，又经PEG6000浓缩进一步去除绝大部分的杂蛋白和核酸，两者的结合极大的避免了杂蛋白和核酸在259nm处的紫外吸收对146S吸收峰的影响，而且经过硫酸鱼精蛋白处理后，去除了大部分的核酸，避免了因核酸粘稠病毒重悬不彻底造成的误差，进一步提高了 146S含量测定的准确性。2、液相色谱检测系统的使用使得超速离心后样品的检测更加精确和快捷，根据朗博-比尔定律及定积分原理，推导出146S含量的计算公式非常简单，只需四个参数样品通过样品池的流速、检测系统样品池光程长度、146S吸收峰面积和上样量。样品池光程是既定已知的，样品通过样品池的流速和上样量都是可控的，146S吸收峰面积由色谱工作站自动生成，采用这种方法可以快速测定146S含量。3、具有很好的重复性，批内及批间偏差不大；具有较高的灵敏度,对浓缩5 100倍病毒液都可测定；具有较好的适用性，既能测定活病毒的146S含量，又能测定灭活病毒的146S含量；具有广泛的通用性，适合于口蹄疫各种型和亚型病毒的检测。因此，本发明方法定量结果准确，重复性好，灵敏度高，而且方便、快捷，可用于各型口蹄疫抗原中146S含量的测定。通过定量口蹄疫抗原中146S的含量能够指导口蹄疫疫苗的配制，间接评价疫苗的效力，这对于提升我国口蹄疫疫苗质量具有重大指导意义。
图1为浓缩后口蹄疫病毒146S液相色谱系统检测图谱；图2为收集的纯146S液相色谱系统检测图谱；图3为不同浓缩倍数口蹄疫病毒液相色谱系统检测图谱；曲线从上至下依次为浓缩100倍，80倍，40倍，20倍，10倍，5倍的浓缩病毒液；图4为同一浓缩倍数病毒液批内及批间重复液相色谱系统检测图谱。曲线红色、蓝色为批内重复，曲线黑色为不同批间重复。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1样品中146S抗原含量的定量检测1、材料1.1 检测样品牛 Asia I/JSL/GSZY/06 毒、牛 0 型 0NXC/92 毒、猪 0 型 0/ZK/93-08毒购买自兰州兽医研究所。1. 2仪器和试剂液相色谱检测系统购自莱伯泰科公司，蔗糖、硫酸鱼精蛋白购自sigma 公司，PEG6000 购自 AMRESCO 公司。
相色谱检测系统是由液相色谱检测器、色谱工作站和恒流泵组成，液相色谱检测器型号为UV600紫外-可见可变波长检测器，恒流泵型号为P600高压恒流泵。液相色谱检测器光源为氘灯，光谱带宽为8nm，波长精度为±0. 2nm，波长准确度为±1. Onm ;测量显示范围为-1 4AU ;基线噪声为±0. 5X10-5AU(甲醇，非空池)，基线漂移为1.0X10-4AU/h(甲醇，非空池)。恒流泵为双柱塞串联，隔膜式脉冲阻尼器与电子脉动抑制技术同时控制压力脉动保障最低的基线噪音，压力脉动< 1.0%，流量准确度为±1.0% (1.0ml/min，水，室温)，流速范围为0. OOl 9. 999ml/min。色谱工作站高度自动化设计，遵循GLP、GMP、21CFR实验室规范要求，保证所要求的数据追踪能力和数据完整性；工作站具有强大的数据处理功能，方便易操作，由符合AIA(美国分析学会)标准的CDF文件读入采样数据，自动判峰、计算面积，并可在多张谱图间做加减运算或重合显示。2、方法(I)病毒纯化取大生产中悬浮培养的病毒抗原样品①为牛Asial/JSL/GSZY/06活毒，样品②为牛O型0NXC/92活毒，样品③为猪O型0/ZK/93-08活毒，样品④为牛AsiaI/JSL/GSZY/06灭活毒，样品⑤为牛O型0NXC/92灭活毒，样品⑥为猪O型0/ZK/93-08灭活毒。灭活毒样品的制备可按现有常规方法制备得到，本实施例中采用3mM的BEI (BEA在经过0. 2N的氢氧化钠的作用下环化成BEI。BEA购自sigma公司。)30°C灭活28小时进行灭活处理。各病毒样品(即病毒原液)中分别加入硫酸鱼精蛋白，使得加入的硫酸鱼精蛋白在样品溶液中的终浓度为lmg/ml，室温搅拌混合lh，7000rpm离心30min，分离得到上清液。(2)PEG6000浓缩病毒按质量体积百分比(g/ml)计算，向获得的各样品上清液中分别加入NaCl，使其终浓度为4%，充分溶解后加入PEG6000，使其终浓度为8%，4°C搅拌混合2h，7000rpm离心lh，获得口蹄疫病毒沉淀，用TEN缓冲液(0. OlM Tris, 0. OlM EDTA，0.1MNaCl,PH 7.6)重悬至原病毒样品体积的1/100,0. 45 y m针式滤器过滤,置于4°C冰箱备用。(3)蔗糖密度梯度超速离心在Ilml超速离心管中制备15% 45% (W/V)均匀线性蔗糖梯度液10ml，取Iml上述浓缩液加至制备好的15% 45% (W/V)均匀线性蔗糖梯度液顶部，8°C，35，OOOrpm,离心3. 5h后，获得超速离心样品① ⑥。(4)液相色谱检测系统检测将步骤(3)得到的超速离心样品① ⑥分别连续通过液相色谱检测系统，对超速离心样品在波长259nm处的吸收值进行连续检测，分别得到超速离心样品① ⑥在波长259nm处的吸收图谱；(5) 146S含量的计算根据本发明推导出的146S的含量计算公式进行计算，C = FES/76ffb上述公式中，C为样品中146S含量；Fk为样品通过样品池的流速；S为液相色谱工作站在波长259nm处所检测样品中146S的吸收峰面积；W为加在梯度液上的病毒样品的体积山为流动样品池的光程长度。3、灵敏度及重复性检测按上述方法将样品①牛Asia I/JSL/GSZY/06毒分别浓缩至100倍，80倍，40倍，20倍，10倍，5倍，重复步骤(3)、(4)、(5)，进行146S含量的计算。4、结果4.1抗原纯化前后蛋白及DNA含量比较取大生产中悬浮培养的病毒抗原样品①为牛Asia I/JSL活毒,样品②为牛O型0NXC/92活毒，样品③为猪O型0/ZK/93-08活毒，样品④为牛Asial/JSL/GSZY/06灭活毒，样品⑤为牛O型0NXC/92灭活毒，样品⑥为猪O型0/ZK/93-08灭活毒。各样品中加入硫Ife鱼精蛋白，使得加入的硫Ife鱼精蛋白在样品溶液中的终浓度为lmg/ml,室温揽祥混合Ih,7000rpm离心30min，分离得到上清液，向获得的上清液中加入NaCl使其终浓度为4%，充分溶解后加入PEG6000，使其终浓度为8%，4°C搅拌混合2h，7000rpm离心lh，获得口蹄疫病毒沉淀，用TEN缓冲液重悬至原病毒样品体积的1/100,0. 45 U m针式滤器过滤，样品① ⑥纯化前后蛋白、DNA平均去除率比较见表I，样品①②③处理前后病毒滴度比较见表2。表I样品① ⑥纯化浓缩前后蛋白、DNA平均去除率比较
权利要求
1.一种利用液相色谱检测系统定量测定口蹄疫抗原中146S含量的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)病毒纯化向待测的口蹄疫病毒样品中加入硫Ife鱼精蛋白，使加入的硫Ife鱼精蛋白的终浓度为O. 5 2. Omg/ml,室温作用O. 5 2h, 5000 IOOOOrpm离心15min Ih,分离得到上清液； (2)PEG6000浓缩病毒按质量体积百分比计，向获得的上清液中加入NaCl，使NaCl的终浓度为2 6%，充分溶解后加入PEG6000，使PEG6000的终浓度为5 10%，2 8°C下搅拌混合I 16h，5000 IOOOOrpm离心I 2h，获得口蹄疫病毒沉淀，使用TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到病毒浓缩液； (3)蔗糖密度梯度超速离心制备质量体积比为15% 45%的均匀线性蔗糖梯度液，将步骤(2)得到的病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，6 10°C，30000 40000rpm，离心2. 5 3. 5h，得到超速离心样品； (4)液相色谱检测系统检测将步骤(3)得到的超速离心样品连续通过液相色谱检测系统，对超速离心样品在波长259nm处的吸收值进行连续检测，得到超速离心样品在波长259nm处的吸收图谱； (5)计算146S含量根据液相色谱工作站所测得的146S在259nm处的吸收峰面积，由以下公式计算出146S的含量， C = FES/76ffb 上述公式中，C为样品中146S含量；FK为样品通过样品池的流速；S为液相色谱工作站在波长259nm处所检测样品中146S的吸收峰面积；W为加在梯度液上的病毒样品的体积；b为流动样品池的光程长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中使加入的硫酸鱼精蛋白的终浓度为lmg/ml,室温作用Ih。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(I)中所述的离心转速为7000rpm，离心 30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中按质量体积百分比计，向获得的上清液中加入NaCl使其终浓度为4%，充分溶解后加入PEG6000使其终浓度为8%，4°C搅拌混合2 6h，7000rpm离心lh，获得口蹄疫病毒沉淀。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的TEN缓冲液为含有O.OlMTris, O. OlM EDTA，0.1M NaCl 的溶液，PH 为 7. 6 8. O。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于用所述的TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到体积为病毒样品体积1/100 1/50的病毒浓缩液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤(2)中用所述的TEN缓冲液重悬病毒沉淀，得到的体积为原病毒液体积1/100的病毒浓缩液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的蔗糖密度梯度超速离心为 8V，35，OOOrpm,离心 3. 5h。
全文摘要
本发明公开了一种利用液相色谱检测系统定量口蹄疫抗原146S含量的方法，包括首先用硫酸鱼精蛋白纯化病毒，然后用PEG6000浓缩病毒，浓缩后的病毒进行蔗糖密度梯度超速离心，使用液相色谱检测系统检测离心后样品在波长259nm处的吸收峰，最后根据公式C＝FRS/76Wb计算出146S的含量。本发明方法可用于各型口蹄疫抗原146S含量的测定，通过定量口蹄疫抗原中146S的含量能够指导口蹄疫疫苗的配制，间接评价疫苗的效力，这对于提升我国口蹄疫疫苗质量具有重大指导意义。
文档编号G01N30/74GK102998378SQ201110275160
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者倪春霞, 徐树兰, 李少英, 赵炳武, 辛俊宝, 张澍, 王钦富, 武华 申请人:内蒙古必威安泰生物科技有限公司