专利名称：预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂，特别是提供了一种混合细菌感染引起的严重脓毒血症及感染性休克预后，预防和治疗的新方法·。
背景技术：
细菌感染引起的脓毒血症至今仍然是危害人类健康的急性综合症，脓毒血症目前是美国排位第10的主要死亡原因，在中国脓毒血症的发病率和死亡率也不容乐观。全球每年至少有1800万例脓毒症发生，占世界总人口的O. 3%，我国估计为300万例/年计算。保守预测我国严重脓毒症和脓毒性休克病人为174万病人。革兰氏阴性以及阳性细菌引起的脓毒血症主要原因是由于细菌或细菌毒素侵入血流引起。健康者在病原菌入侵后，一般仅表现为短暂的菌血症，细菌可被人体的免疫防御系统迅速消灭，并不引起明显症状；但各种免疫防御功能缺陷者(包括局部和全身屏障功能的丧失)，都易诱发脓毒血症。放射治疗、广谱抗菌素、细胞毒类药物的应用，以及各种大手术致严重的开放性创伤等都是脓毒血症的重要诱因。单一微生物感染是指微生物培养中可以检出一个孤立的微生物体；多种微生物感染是指微生物培养中可以检出超过一个的微生物体，即多个微生物体。与单一微生物感染相比较，多种微生物感染引起的脓毒血症伴有较高并发症风险，较长的病程以及较高死亡率。细菌感染引起的脓毒血症以及浓毒性休克的诊断、预防治疗工作仍然面临许多挑战，监测血流中的微量细菌和细菌毒素都是可行的诊断方法但存在严重缺点，而且缺乏统一的标准。近20多年，发现一些可以应用于诊断的分子靶点的人血清分子可以应用于细菌感染的诊断，例如 B 型尿肽(B-type natriuretic peptide)、降血 I丐素原(Procalcitonin)、细菌聚脂多糖结合蛋白(LBP)、细菌渗透性增强蛋白(BPI)、可溶性⑶14(s⑶14)、Endocan等。其中降血钙素原(Procalcitonin)已被广泛应用于脓毒血症、严重脓毒血症、浓毒性休克的分类以及诊断，但它们都不能准确、有效预测浓毒性休克的发生。目前感染免疫学研究认为，引起脓毒血症以及浓毒性休克的病源分子主要是革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、细菌核酸(DNA)、糖肽(PGN)以及磷脂壁酸(LTA);又发现细菌的单链DNA(ssDNA)可以保护个体，降低混合细菌感染的死亡率。革兰氏阴性菌感染往往伴随其它细菌的感染。多种抗原的病理协同作用还有待进一步研究，其原理有待揭示。因此，本领域迫切需要发现新的病理机制、开发的新的、有效地对严重脓毒血症以及浓毒性休克进行预后、预防和治疗的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供预防、诊断、治疗、预后混合细菌感染以及多种微生物感染相关疾病的方法和试剂。在本发明的第一方面，提供含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(CRISPLD2)及其编码基因的用途，用于制备预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的药物。在一个优选例中，所述的药物用于阻断脂多糖(LPS)与靶细胞受体结合；或抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症因子(如肿瘤坏死因子)释放。在另一优选例中，所述的药物用于从源头上控制脂多糖(LPS)诱导的一系列病理反应，以及修饰单链DNA的免疫调控功能。在另一优选例中，所述的含LC⑶和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2通过结合细菌单链DNA(ssDNA)和/或脂多糖(LPS)预防、缓解或治疗脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。在本发明的另一方面，提供含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的脓毒血症、严重脓毒症以及感染性休克是格兰氏阴性细菌及多种微生物感染引起的脓毒血症、严重脓毒症以及感染性休克。在另一优选例中，所述的细菌感染是格兰氏阴性细菌及多种微生物感染，可以包含格兰氏阳性细菌。在另一优选例中，所述的细菌感染是混合细菌感染。在另一优选例中，所述的混合细菌感染以及多种微生物感染包括内源性格兰氏阴性和阳性细菌混合感染或外源性格兰氏阴性感染。在另一优选例中，所述的细菌选自(但不限于)大肠杆菌，葡萄球菌，沙门氏菌，克雷伯氏菌，不动杆菌。在本发明的另一方面，提供特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂的用途，用于制备诊断或预后细菌感染脓毒血症、严重脓毒血症以及感染性休克的试剂盒。在另一优选例中，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂选自(但不限于)特异性扩增含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的引物；特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的探针；或特异性结合含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体或配体。在另一优选例中，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体，如多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种用于诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症以及感染性休克的试剂盒，它包括容器，以及位于容器中的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂；较佳地，为用于检测CRISPLD2血清浓度的试剂，如多克隆抗体。在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，包括步骤提高需要的哺乳动物对象的血清中含LCCD结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的浓度。在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，该方法包括给予细菌感染者含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、显示了 ELISA检测的标准曲线。·图2、显示了重组CRISPLD2的鉴定结果。其中，A、10% SDS-PAGE胶分离纯化重组CRISPLD2分子，考马斯蓝鉴定；B、抗CRISPLD2抗体免疫印迹；C、抗c-myc-标记抗体免疫印迹。各泳道如下1，4和6为培养基中的CRISPLD2 ；2为分子量标准；3和5为对照培养基。图3、应用BIAcore技术测定的分子相互作用；CRISPLD2与LPS和单链DNA(OND)
结合。其中，A、E.col i LPS(E. col1-LPS)与 CRISPLD2 结合解离的传感图。B、金黄色葡萄球菌(S. aureus) LTA (Aureus-LTA)与CRISPLD2结合解离的传感图。C、E-coli糖脂(PGN)与CRISPLD2结合解离的传感图。D、人工合成细菌单链GPC-DNA (0DN2006)与CRISPLD2结合解离的传感图。E、人工合成细菌单链CPG-DNA (0DN2006 (Ctr))与CRISPLD2结合解离的传感图。F、人工合成双链RNA(PolyI = C)与CRISPLD2结合解离的传感图。图4、盲肠结扎手术和穿刺诱导混合细菌感染脓毒血症以及低剂量LPS腹腔注射后血清CRISPLD2浓度的时间动力学曲线。A为大鼠盲肠结扎手术和穿刺诱导低度及中度混合细菌感染后血清CRISPLD2浓度变化。B为低剂量LPS腹腔注射后小鼠血清CRISPLD2浓度变化。图5、重组CRISPLD2阻断LPS与靶细胞受体结合，抑制靶细胞炎症因子释放。其中，A-B :重组CERISPLD2蛋白阻断大肠杆菌LPS及沙门氏菌(S. minnesota ；S. m) LPS与靶细胞受体结合。其中，MFI是荧光强度的中值。C-D :重组CERISPLD2蛋白阻断大肠杆菌LPS诱导的炎症因子释放。图6、重组人CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死，血清CRISPLD2浓度与E. col1-LPS致死剂量相关性分析。A、重组人类CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死。B、小鼠血清CRISPLD2浓度与E. col1-LPS致死剂量正相关。图7、抗菌素长时间治疗引起小鼠血清CRISPLD2浓度下降，小鼠对内毒素休克的敏感性增加。其中，
A、长时间服用万古霉素加新霉素导致小鼠血清CRISPLD2浓度下降。B、长时间服用万古霉素加新霉素增加了小鼠对内毒素休克的敏感性。图8、CRISPLD2血清浓度关与LPS诱导的内毒素休克的易感性呈正相关。合并三例类似图7抗菌素长时间治疗的实验数据绘图并统计分析A、CRISPLD2血清浓度关与LPS诱导的内毒素休克的存活率呈正相关(小鼠腹腔(1. P.)注射亚致死剂量的大肠杆菌LPS O. 2mg)。B、显示血清CRISPLD2水平正态分布曲线，提示了相应的内毒素休克的易感性变化与CRISPLD2水平的关系。纵坐标是血清CRISPLD2水平；横纵坐标是存活率或小鼠计数。 C、显示抗内毒素血清IgG抗体水平与存活率没有相关性。图9、重组CRISPLD2蛋白静脉注射或内源性激活上调血清CRISPLD2水平保护混合细菌感染小鼠免于浓毒性休克。图10、脓毒血症病人CRISPLD2-低/降钙素原(Procalcitonie)-高的血清样本频率更敏感地反映脓毒血症的严重程度及死亡率。APACHE II指数4-14为轻度脓毒血症病人；15-23为严重脓毒血症病人；23-39为严重脓毒血症乃至浓毒性休克高发病人。病例30，标本数180。
具体实施例方式本发明人经过深入而广泛的研究，首次证明了一种天然免疫调节蛋白一含LCXD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2 (cyste ine-rich secretoryprote in LCCLdomain containing 2，CRISPLD2)可结合细菌的单链DNA和LPS，其血清浓度与细菌感染或细菌感染相关疾病(如严重脓毒血症以及浓毒性休克)的发生密切相关。一方面，以CRISPLD2蛋白作为靶分子，可检测个体血清CRISPLD2浓度，预测个体对细菌感染(如浓毒性休克)的敏感性，并通过跟踪血清水平CRISPLD2预后细菌感染引起的严重脓毒血症以及浓毒性休克。另一方面，通过提高血清中CRISPLD2蛋白的浓度，可以预防和治疗细菌感染弓I起严重脓毒血症以及浓毒性休克。在此基础上完成了本发明。一种 CRISPLD2 的 cDNA 序列可参见登录号 NM_031476(长度 4607bp)或 SEQ ID NO:1，其基因组序列可参见登录号NC_000016. 9，其氨基酸序列可参见序列号NP_113664或SEQID NO 2o在本发明中，术语“CRISPLD2蛋白”、“CRISPLD2多肽”、“含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2”或“人严重脓毒血症以及浓毒性休克相关蛋白CRISPLD2”可互换使用，都指具有人严重胺毒血症以及浓毒性休克相关蛋白CRISPLD2氣基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的CRISPLD2蛋白。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的CRISPLD2蛋白或多肽”是指CRISPLD2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CRISPLD2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明还包括CRISPLD2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然CRISPLD2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“CRISPLD2蛋白”指具有CRISPLD2蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。该术语还包括具有与CRISPLD2蛋白相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CRISPLD2蛋白的活性片段和活性衍生物。通常，这些变异形式包括CRISPLD2蛋白的LCXD和R3H结构域。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与CRISPLD2DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CRISPLD2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含CRISPLD2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 CRISPLD2多肽的可溶性片段。通常，这些变异形式包括CRISPLD2蛋白的LCXD和R3H结构域。发明还提供CRISPLD2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然CRISPLD2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β'Υ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。通常，这些类似物包括CRISPLD2蛋白的LCXD和R3H结构域。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“CRISPLD2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
权利要求
1.含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物用于阻断脂多糖与靶细胞受体结合；或抑制脂多糖诱导的炎症因子释放。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2通过结合细菌单链DNA和/或脂多糖预防、缓解或治疗脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。
4.含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂或试剂盒。
5.特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂的用途，用于制备诊断或预后细菌感染脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂盒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂选自特异性扩增含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的引物；特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的探针；或特异性结合含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体或配体。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体。
8.一种用于诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂盒，其特征在于，它包括容器，以及位于容器中的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体。
10.一种预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，其特征在于，该方法包括给予细菌感染者含LCXD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2。
全文摘要
本发明涉及预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂。首次证明含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(CRISPLD2)可结合细菌的LPS和单链DNA，其血清浓度与细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克密切相关。以CRISPLD2蛋白为靶分子，检测个体血清CRISPLD2浓度，预测个体对细菌感染的敏感性，并通过跟踪CRISPLD2血清水平预后细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克。且，通过提高血清中CRISPLD2蛋白的浓度，可预防和治疗细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克。
文档编号G01N33/569GK102988956SQ20111027906
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者王志勤, 江宏铨, 张新, M·K·霍夫曼 申请人:上海人类基因组研究中心, 上海南方基因科技有限公司