专利名称：一种以聚联乙炔传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法
技术领域：
本发明涉及一种以聚联乙炔光化学传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法，属于药物分析技术领域。
背景技术：
细胞膜是重要的药物作用靶点，同时也是药物进入细胞的生理屏障，药物的活性和在人体内的转运与药物-膜亲和力密切相关，因此在新药研发初期对药物的细胞膜亲和力进行体外筛选是一项极其重要的研究内容。正辛醇/水是最早用于测定药物-膜亲和力的体外系统，该系统以有机溶剂-正辛醇模拟细胞膜，通过测定药物在正辛醇/水两相中分配系数(K。。t)来反映药物的膜亲和力。但细胞膜是各向异性的脂质双分子层结构，因此正辛醇/水分配系数与药物-膜亲和力的相关性并不理想，它无法准确模拟药物与细胞膜之间的某些相互作用，如静电力和空间效应。采用具有脂质双层结构的脂质体模型来模拟细胞膜与实际情况则更加接近。脂质体/水系统评价药物-膜亲和力需借助超速离心法或平衡透析法得到药物的脂质体/水分配系数(Km)，其关键步骤是将游离药物与和脂质体结合的药物分离，过程繁琐费力，使该法在药物-膜亲和力快速评价中的应用受到极大限制。近年来，出现了一些使用类脂膜模型来测定药物-膜亲和力的新技术。磷脂膜色谱法(IAM)和固定化脂质体色谱法(ILC)是较早用于测定药物-膜亲和力的方法，此类方法以磷脂单层(IAM)或脂质体(ILC)为色谱固定相，通过测定色谱保留时间获得药物在流动相和固定相之间的分配比，进而反映药物-膜亲和力的大小；但是色谱柱制备较为繁琐、 柱间的重现性较差，因而应用受到一定限制。国外也有研究者应用表面等离子共振传感技术(SPR)测定药物-膜亲和力，但是该技术设备要求先进，检测成本高昂，国内大部分药物研发机构难以承受。其他一些方法例如固定模担体技术(SSLM)和pH滴定法则由于分析过程较复杂，不适合用于药物-膜亲和力的快速筛选。因此，为提高我国的新药研发速度与规模，亟需一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。
发明内容
本发明针对现有药物-膜亲和力测定方法的不足与缺陷，将低成本的、基于光化学信号传导特性的聚联乙炔(PDA)囊泡传感检测技术用于药物-膜亲和力测定，为新药研发单位与机构提供一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。本发明所采用的聚联乙炔光化学传感器是一种具有变色性能的高分子材料，它是由联乙炔脂肪酸分子在紫外光照射下自聚合而成，其线性骨架的离域η电子在可见光区发生跃迁显蓝色。当聚联乙炔传感器表面活性分子发生分子识别反应时，聚联乙炔骨架受搅动引起构象变化，颜色从蓝色转变为红光，这种识别反应极为敏感，可以通过肉眼直接观察到。聚联乙炔传感器可以象其它传感器那样构成二维的薄膜传感器，而区别于其它光学传感器的突出特点是聚联乙炔是两性分子，在溶液中可自动形成具有双层膜结构的聚联乙炔囊泡，构成囊泡传感器，表面插入生物活性分子后形成的三维作用更接近于实际生理环境。本发明在联乙炔囊泡传感器中插入磷脂，从而构成类细胞膜的聚联乙炔/磷脂变色囊泡；通过测定囊泡与药物分子作用前后的变色程度，运用一定的模型和数学处理方法， 求算药物分子与变色囊泡的亲和力，从而实现建立一种简便、快捷、重现性好且检测成本低的药物-膜亲和力测定方法。具体地说本发明的技术方案如下聚联乙炔/磷脂变色囊泡的制备方法将磷脂与联乙炔结构单体(摩尔比为1 4 4 1)分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混勻，在4°C中静置12小时后取出，在紫外光灯(波长为220 ^Onm)下边搅拌边照射，即形成蓝色的嵌有磷脂分子的聚联乙炔/磷脂变色囊泡。聚联乙炔/磷脂变色囊泡变色响应的测定方法取囊泡混悬液，加入不同pH值的缓冲液，混勻后温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，分别计算药物加入前后的聚联乙炔/磷脂变色囊泡的蓝光分数PB = △^光/仏^光+々红光)，六^光是囊泡在蓝光吸收波长(620 660nm)处的吸收度，Atot是囊泡在红光吸收波长(520 560nm)处的吸收度；计算变色响应值CR，CR = (PB0-PB1)ZPB0X 100%, PB0是药物加入之前囊泡的蓝光分数，PB1是药物加入之后囊泡的蓝光分数；测定加入不同浓度的药物后聚联乙炔/磷脂变色囊泡的变色响应值CR，绘制药物浓度-变色响应值曲线。药物-膜亲和力常数的测定方法(1)线性拟合方法
权利要求
1.一种以聚联乙炔光化学传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法，其特征在于将联乙炔分子聚合成聚联乙炔双分子层，插入磷脂，从而构成类细胞膜的聚联乙炔/磷脂变色囊泡。
2.如权利要求1所述的一种能用于测定药物-膜亲和力的聚联乙炔/磷脂变色囊泡， 其特征在于所述的聚联乙炔双分子层由联乙炔结构单体(H3C-(CH2)m · C ^ C-C ^ C-(CH2) n-C00H)聚合而成，其中m = 0 10，η = 17 30 ；所述的磷脂为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂或鞘磷脂。
3.如权利要求1所述的一种能用于测定药物-膜亲和力的聚联乙炔/磷脂变色囊泡的制备方法，其特征在于将磷脂与联乙炔结构单体分别溶于有机溶剂中，混合后在温水浴中减压旋蒸除去有机溶剂，然后加入适量去离子水，超声使其混勻，在4°C中静置12小时后取出，在紫外光灯下边搅拌边照射，即形成蓝色的聚联乙炔/磷脂变色囊泡混悬液。
4.如权利要求3所述的一种能用于测定药物-膜亲和力的聚联乙炔/磷脂变色囊泡的制备方法，其特征在于所述的磷脂与联乙炔结构单体的摩尔比为1 4 4 1，紫外光照射波长为220 ^Onm。
5.一种药物-膜亲和力的评价体系，包括以下步骤(1)制备聚联乙炔/磷脂变色囊泡；(2)取囊泡混悬液，加入不同PH值的缓冲液，混勻后温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，计算药物加入之前的囊泡蓝光分数PBtl =tot)，是囊泡在蓝光吸收波长处的吸收度，Atot是囊泡在红光吸收波长处的吸收度；(3)取囊泡混悬液，加入不同PH值的缓冲液，再加入一定量已知浓度的药物，混勻后温孵，然后分别在蓝光吸收波长处和红光吸收波长处测定其吸收度，计算药物加入之后的囊泡蓝光分数TO1 =+AtotKAffi^是囊泡在蓝光吸收波长处的吸收度，Atot是囊泡在红光吸收波长处的吸收度；(4)计算变色响应值CR，CR= (PB0-PB1)/PB0 X 100%, PB0是药物加入之前囊泡的蓝光分数，PB1是药物加入之后囊泡的蓝光分数。(5)测定加入不同浓度的药物后囊泡的变色响应值CR，绘制药物浓度-变色响应值曲线.一入 ，(6)运用受体-变色响应的亲和力模型，采用一定的数学处理方法，对药物浓度-变色响应值曲线进行拟合，求算药物与囊泡的亲和力Kb，从而实现建立本发明所述的药物-膜亲和力评价体系。
6.根据权利要求5所述药物-膜亲和力的评价体系，其特征在于(2)、(3)所述的蓝光吸收波长范围在620 660nm，红光吸收波长范围在520 560nm，pH值范围在7. O 8. 5。
7.根据权利要求5所述药物-膜亲和力的评价体系，其特征在于(6)所述的受体-变色响应的亲和力模型为CR [PR]CRmax [R]t[R]T代表囊泡上磷脂总浓度，[PR]代表药物与磷脂结合物的浓度，CR代表囊泡加入药物后的变色响应，CRfflax代表囊泡上磷脂全部与药物结合后的变色响应。
8.根据权利要求5所述药物-膜亲和力的评价体系，其特征在于(6)所述的数学处理方法包括(1)线性拟合方法
全文摘要
本发明公开一种以聚联乙炔传感器为基础的药物-膜亲和力测定方法。本发明在联乙炔囊泡传感器中插入磷脂，从而构成类生物膜的聚联乙炔/磷脂变色囊泡；通过测定变色囊泡与药物分子作用前后的变色程度，运用一定的模型和数学处理方法，求算药物分子与变色囊泡的亲和力。本发明具有简便、快速、重现性好等特点，分析所需的条件不高，在一般的实验室中只要利用普通的可见分光光度计即可实现，且可与高通量的微孔板模式兼容，适合药物-膜亲和力的高通量筛选。
文档编号G01N21/35GK102435572SQ201110279408
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者郑枫, 陈夷花 申请人:中国药科大学