专利名称：一种半定量检测人血清中gfap浓度的胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金试纸条，尤其涉及一种半定量检测人血清中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)浓度的胶体金试纸条。
背景技术：
流行病学调查研究表明，目前脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类疾病死亡的三大原因。与西方发达国家相比，我国脑血管病的发病率和死亡率明显高于心血管病。据估算，全国每年新发脑卒中患者约为200万人；每年死于脑卒中的患者约150万人；存活患者人数600万 700万；且70% 80%的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。其中脑出血是一种致死率和致残率均高的常见病、多发病，严重危害人类特别是老年人的健康，威胁病人的生命，严重影响病人生活质量。胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)是一种分子量为50 52KDa的酸性蛋白，属细胞骨骼蛋白，是星形细胞胞质内的特异性蛋白，标志蛋白。 GFAP在星形胶质细胞受到刺激引起反应时，其表达发生变化，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。研究发现GFAP和痴呆、多发性硬化及脑卒中有明显相关性。脑出血后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的GFAP通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。有研究表明脑出血患者发病6小时内血清GFAP水平即明显升高，而缺血性脑卒中患者6小时内血清GFAP水平与正常对照组无明显差异，因此认为GFAP是急性脑出血的生物学标志物。此外，还有研究表明，急性脑出血患者血清中的GFAP与脑出血体积之间有着密切的正相关关系，因此可以通过脑出血患者血清GFAP水平来判断患者的病情和预后。目前，临床诊断上对GFAP的检测主要是ELISA实验方法，该方法因其特异性、灵敏度高而在近二十年来被广泛应用，但同时该方法检测方法繁琐，所需检验时间较长(1 2 小时)，而且往往需要积攒到一定数量样品之后，才能进行检测，检测被延误，而胶体金法则具有很多优势，能够弥补其不足a)快速全部检测过程仅需5-10分钟，大大缩短了检测时间。b)简便不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。c)检测结果直观。检测结果直接用颜色显示，肉眼判断容易，不需要特别仪器设备，只需要试纸条，样品只要做非常简单的处理或不需要做前处理。d)可单份检测对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。e)稳定性好金标试剂稳定，不受温度等外界环境的影响，可长期保存。然而，检索结果表明，利用胶体金法检测检测人血清中GFAP浓度的文献还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种快速半定量检测人血清中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)浓度的胶体金试纸条。本发明所述半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，是在PVC板上粘附检测膜片、胶体金结合膜片和吸水纸层制成，其特征在于所述胶体金结合膜片上包被有胶体金标记的抗-GFAP抗体，所述检测膜片上设有检测线和质控线，其中检测线上固定有抗-GFAP捕获抗体，质控线上固定有兔抗鼠IgG ；所述试纸条自下而上依次为加样处、胶体金结合膜片、检测线、质控线、吸水纸。上述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条中，所述胶体金标记的抗-GFAP抗体及检测线上包被的抗-GFAP捕获抗体为能够识别不同表位的单克隆抗体。上述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条中，所述胶体金结合膜片由玻璃纤维素纸制得，所述检测膜片由硝酸纤维素膜制得。上述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条中，所述检测线可以设为多条且间隔设置，优选的实施方式是4条且间隔设置，检测线上固定的抗-GFAP捕获抗体的包被量代表了能够检出的GFAP浓度，自上而下依次为16ng/ml、8ng/ml3ng/ml、2ng/ml。本发明所述半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条在制备检测试剂盒中的应用，其中所述半定量检测人血清中GFAP浓度的试剂盒包括以下组分1) 10条单人份检测卡；检测卡由试纸条外壳与试纸条构成，试纸条由胶体金膜片 (喷有由抗-GFAP单克隆抗体标记的胶体金)、检测膜片(检测线包被有抗-GFAP捕获单克隆抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体)、吸水纸、衬膜片构成；2)说明书一份；3)标准比色卡一张。应用上述试剂盒半定量检测人血清中GFAP浓度的方法，步骤如下(1)将检测卡放置在干净的水平台面上，水平放置并作好标记。(2)用移液器吸取120 μ 1样本，垂直滴加在加样处。(3)等待检测线处紫红色条带出现，用目测参考标准比色卡进行半定量判读。本发明所述胶体金检测试纸条进行半定量检测人血清中GFAP浓度的原理是用胶体金标记抗-GFAP单克隆抗体，将该胶体金标记物包被在胶体金结合膜片上；在检测膜片的检测线上包被一定量的抗-GFAP捕获单克隆抗体。当待检血清加到胶体金结合膜片后，血清中的GFAP与胶体金上的抗-GFAP抗体结合，该胶体金标记复合物泳动到检测线时， GFAP蛋白会被检测线上的抗-GFAP捕获单克隆抗体所捕获，胶体金聚集在检测线上而显色；如果待测血清中的GFAP浓度低不足以完全结合检测线上的的抗GFAP捕获抗体时，检测线聚集的胶体金数量少或者未聚集胶体金，就会显色浅或者不显色。显色条带越多，条带颜色越深，说明待测血清中的GFAP蛋白浓度越高，因此可以根据条带的多少判定待测血清中 GFAP的含量。当显示5条带时，说明滴加的一定体积的血清中的GFAP量使检测膜片上抗体的结合位点饱和，这时，需要对血清进行稀释，再进行检测，而待测血清中GFAP的浓度在检测线所代表的浓度乘以稀释倍数即为所测得的浓度，即实现了对待测血清进行半定量检测。本发明实现了便捷、快速、经济、简单的半定量检测血清中GFAP浓度的目的。本发明进一步优选在检测膜片上设置多条检测检测线。胶体金膜片上的距离由近到远，检测线显示阳性时所代表的GFAP浓度依次增加。可根据检测线显色的多少和位置， 判断待测血清中GFAP的浓度范围。本发明包被在胶体金膜片上的抗体及固定在检测线上的抗GFAP捕获抗体均为单克隆抗体，以尽量减少检测过程中的交叉反应的干扰，以提高试纸条检测的准确性。本发明进一步优化在检测膜片上设置质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgGJt为监测试纸条有效性及试剂污染的依据。本发明检测试纸条将膜反应体系贴附在尺寸相应的PVC板条上，节约成本，而又不影响检测结果。综上，本发明对血清中GFAP进行检测时，可以简便快速、准确有效的对GFAP进行半定量检测，具有高特异性、高灵敏度、操作快速简便、费用低廉、不需要任何仪器、省时省力等特点。
图1本发明胶体金试纸条膜反应层反应体系结构示意图；其中1 吸水纸；2 质控线；3 检测线；3a 检测浓度为16ng/ml ；3b 检测浓度为 8ng/ml ；3c 检测浓度为^g/ml ；3d 检测浓度为2ng/ml ；4 胶体金结合膜片；5 加样处。图加本发明检测结果解读示意图——表示GFAP浓度小于2ng/ml ；图2b本发明检测结果解读示意图——表示GFAP浓度在于2ng/ml ^g/ml ；图2c本发明检测结果解读示意图——表示GFAP浓度在于^g/ml 8ng/ml ；图2d本发明检测结果解读示意图——表示GFAP浓度在于8ng/ml 16ng/ml ；图加本发明检测结果解读示意图——表示GFAP浓度大于16ng/ml，应稀释后再检测。
具体实施例方式实施例1步骤一检测膜片的制备用PBS缓冲液将抗-GFAP捕获单克隆抗体稀释到四个不同的浓度，由高到低分别用点膜仪点在硝酸纤维素膜上，每条线点20 μ 1，线宽1 1. 5mm，线间距5mm。其被量代表能够检出2ng/ml3ng/ml、8ng/ml、16ng/ml。同样方法，在检测线后用点膜仪点上200 μ g/ ml的羊抗鼠IgG作为质控线，线宽1 1. 5mm，距最近检测线8mm。用含BSA的PBS缓冲液进行封闭2小时，室温阴干，4°C保存。步骤二胶体金结合膜片的制备1)抗-GFAP 抗体单克隆抗体购自 Santa Cruz Biotechnology。2)抗-GFAP抗体-胶体金复合物的制备采用柠檬酸三钠还原法制备直径为20nm胶体金。用纯化水将1 %氯金酸稀释成 0.01%，在磁力搅拌器上加热搅拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入&11 柠檬酸三钠， 继续煮沸至液体呈红色时加热停止，冷却至室温，加水至原体积。胶体金标记GFAP抗体。在磁力搅拌器上用0. IM的碳酸钾缓冲液调胶体金至 PH9. 0，按照1 3 μ g/ml胶体金加入抗-GFAP单克隆抗体，继续搅拌lOmin，加入BSA作为稳定剂，至终浓度为1%，静置1小时。将上述溶液4°C下，3000r/min低速离心40min，小心吸取上清，弃去沉淀；上清再以12000r/min 4°C高速离心30min，弃上清，用0. 01M、pH7. 2 的PBS缓冲液(内含BSA、0. 04叠氮化钠)溶解沉淀至原体积，充分稳定后过夜。再以 12000r/min 4°C高速离心30min，弃上清，用0. 01M、ρΗ7· 2的PBS缓冲液(内含1% BSA、0. 04叠氮化钠)溶解沉淀至原体积的1/5，4°C储存备用。3)胶体金-抗GFAP抗体复合物使用0. IM pH9. 0的碳酸钾缓冲液稀释至设定浓度，用喷涂设备涂至玻璃纤维素纸上，然后真空干燥，即得胶体金结合膜片。4)试纸条的组装在PVC板上由下而上依次粘附检测膜片、胶体金结合膜片，最上一层是吸水层，由 3 5层滤纸组成，外面用胶带封住，成为手持部分。将以上组装好的材料切成3mm宽的小条，即制得本发明所述半定量检测人血清中 GFAP浓度的胶体金试纸条。实施例2半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条的应用(1)用试纸条检测人血清中GFAP浓度用移液器吸取120 μ 1血清样本，垂直滴加在胶体金试纸条的加样处。开始计时， 等待红色条带出现，10分钟内与标准比色卡比对，超过20分钟，结果无效。(2)结果解释本胶体金试纸条中自上而下所涉及的四个浓度梯度标志线(即检测线)为16ng/ ml、8ng/ml3ng/ml、2ng/ml。检测结果解释如下当仅出现质控线一条线时，说明GFAP浓度小于2ng/ml。当出现含质控线的二条线时，说明GFAP浓度在2ng/ml ^g/ml。当出现含质控线的三条线时，说明GFAP浓度在^g/ml 8ng/ml。当出现含质控线的四条线时，说明GFAP浓度在8ng/ml 16ng/ml。当出现含质控线的五条线时，说明GFAP浓度大于16ng/ml，应稀释后再测量。
权利要求
1.一种半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，是在PVC板上粘附检测膜片、 胶体金结合膜片和吸水纸层制成，其特征在于所述胶体金结合膜片上包被有胶体金标记的抗-GFAP抗体，所述检测膜片上设有检测线和质控线，其中检测线上固定有抗-GFAP捕获抗体，质控线上固定有兔抗鼠IgG;所述试纸条自下而上依次为加样处、胶体金结合膜片、 检测线、质控线、吸水纸。
2.如权利要求1所述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，其特征在于， 所述胶体金标记的抗-GFAP抗体及检测线上包被的抗-GFAP捕获抗体为能够识别不同表位的单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，其特征在于， 所述胶体金结合膜片由玻璃纤维素纸制得，所述检测膜片由硝酸纤维素膜制得。
4.如权利要求1所述的半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，其特征在于， 所述检测线为4条且间隔设置，检测线上固定的抗-GFAP捕获抗体的包被量代表能够检出的GFAP的浓度，自上而下依次为16ng/ml、8ng/ml3ng/ml、aig/ml。
全文摘要
本发明公开了一种半定量检测人血清中GFAP浓度的胶体金试纸条，是在PVC板上粘附检测膜片、胶体金结合膜片和吸水纸层制成，其中所述胶体金结合膜片上包被有胶体金标记的抗-GFAP抗体，所述检测膜片上设有检测线和质控线，检测线上固定有抗-GFAP捕获抗体，质控线上固定有兔抗鼠IgG；所述试纸条自下而上依次为加样处、胶体金结合膜片、检测线、质控线、吸水纸。本发明试纸条对GFAP进行半定量检测，具有高特异性、高灵敏度、高准确性，操作快速简便、费用低廉、不需要任何仪器、省时省力等优势，应用前景良好。
文档编号G01N33/577GK102353787SQ201110295520
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者丁兴龙, 张增丽, 朱之炜, 李夫东, 江长林, 王佳颖, 王恒, 王红, 郑祖惠, 韩娟 申请人:山东莱博生物科技有限公司