专利名称：适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法
技术领域：
本发明属于电化学生物传感器技术领域，特别是涉及一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法。
背景技术：
电化学生物传感器具有体积小、成本低、准确、灵敏、易操作、可现场检测等优点， 因此国内外对电化学生物传感器开展了广泛深入的研究。其中利用氧化还原蛋白或氧化还原酶与电极间的直接电子传递进行检测的第三代电化学生物传感器更是备受人们关注，是当前电化学生物传感器研究领域的热点。温度和pH值是影响氧化还原蛋白和氧化还原酶生物活性的重要因素，因此温度和pH值对相应电化学生物传感器的性能也有重要影响，当前电化学生物传感器多难以在高于室温的较高温度或强酸碱等苛刻条件下使用。目前提升蛋白或酶的耐高温或耐酸碱性能，大多采用较复杂的生物方法，如对蛋白或酶进行改性等，以提高其活性适应范围。如在文献(I)Talanta, 2009, 79 :1412-1417 中，Melek Ozkan等人通过复制耐热细菌热纤梭菌得到了热纤梭菌_乳酸脱氢酶，再利用聚吡咯和三磷酸甘油酸的聚合物，将酶固定到金电极表面上，用于在较高温度下检测人血清中的乳酸含量。这种改性后的乳酸脱氢酶在50°C时线性范围最宽，60°C时灵敏度最高，为 25°C时灵敏度的70倍以上。但是这种生物改性方法过程繁琐，对酶的要求苛刻，难以广泛应用。层状二维纳米材料具有可插层性、良好的生物相容性和化学稳定性，将其用于蛋白或酶的固定，构建化学修饰电极也受到电化学工作者的广泛关注。在文献(2) Adv. Funct. Mater, 2007,17 :1958-1965中，Ling Zhang等人将肌红蛋白插入二氧化钛纳米片层间构建蛋白质修饰电极并对其直接电化学行为进行了研究。该电极对过氧化氢具有良好的电催化活性，同时具有一定的热稳定性。但此方法提升蛋白质耐高温性能的效果有限，只是随着温度升高蛋白质活性减少幅度较小。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法，即含磷酸锆纳米片、氧化还原蛋白或氧化还原酶、脱氧核糖核酸，且适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其层层组装。本发明生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与复合生物活性物质层重复叠加构成， 其组成可描述为(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n。其中磷酸锆纳米片带负电，厚度为1 20nm，径向尺寸为300 1500nm ；复合生物活性物质带正电，由氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸复合而成，氧化还原蛋白或氧化还原酶为肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶中的一种，脱氧核糖核酸为市售脱氧核糖核酸，如鲱鱼精脱氧核糖核酸等，氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸的质量比为4 1 2 l;n为组装的(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的层数，取值范围为1 6。本发明制备生物敏感多层膜的方法是利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面，具体工艺步骤为将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到浓度为20 30g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液或聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中，15 30分钟后取出，用队吹干；将该电极浸入浓度为0. 5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶中，15 30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用N2吹干；再将该电极浸入浓度为2. 5 6. Og/L的复合生物活性物质水溶液中，10 30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n多层膜修饰电极。其中浓度为0. 5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶的制备方法为将&0C12 · SH2O, 质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液I ；将质量分数为85%的浓磷酸、质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为3000 5000转/分钟的胶体磨中，反应1 2分钟后悬浊液脱离胶体磨，按照两种溶液混合后的总体积计算，各反应物料浓度分别为&0C12 · SH2O浓度为0. 044 0. 22mol/L,磷酸浓度为2. 0 10mol/L,盐酸浓度为0. 50 2. Omol/L ；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液体积占聚四氟乙烯容器体积的40 80%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在180 240°C水热处理48 192小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗涤滤饼至滤液PH值为6 7，将滤饼在50 60°C空气气氛中干燥后得到层状α-磷酸锆颗粒；按照固/液比为0.5 2. 0g/L的比例将层状α-磷酸锆颗粒加入到体积分数为0. 2 0. 4%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌8 20 小时，所得澄清溶胶即为剥离的磷酸锆纳米片溶胶，浓度为0. 5 2. 0g/L。浓度为2. 5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液的制备方法为将肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶等氧化还原蛋白或氧化还原酶中的一种用去离子水配制成浓度为2 4g/L的水溶液，按氧化还原蛋白或氧化还原酶脱氧核糖核酸的质量比为 4 1 2 1比例与脱氧核糖核酸混合，搅拌8 12小时，得到浓度为2. 5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液。本发明生物敏感多层膜的组装过程可采用日本岛津UV-2501PC型紫外-可见分光光度计进行监测，不同组装层数的(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸) 多层膜的紫外-可见测试结果如图1所示。多层膜中肌红蛋白的Soret吸收带出现在408. 5nm处， 与肌红蛋白溶液的吸收带位置十分接近，并且该吸收带强度随组装层数的增加线性增长， 表明多层膜的组装过程是连续均勻的。本发明的实施效果可以从本发明生物敏感多层膜修饰电极制作的电化学生物传感器看出。将本发明生物敏感多层膜修饰的玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/ AgCl电极为参比电极，组成电化学生物传感器。将该电化学生物传感器的三电极体系置于 0. lmol/L pH = 6. 5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，采用上海辰华仪器公司CHI660B型电化学工作站对其进行电化学性能的表征。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰玻碳电极的电化学循环伏安测试结果如图2所示，随着组装层数的增加，循环伏安曲线中氧化峰与还原峰强度增大，当组装层数超过2层时，峰强基本保持不变。
将(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构筑电化学传感器，以HA为底物进行催化活性检测检测。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L pH = 6. 5PBS 中，在 20 90°C温度区间内， 温度对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极活性的影响如图3所示。从图中可以看出随着温度的升高，电极活性均保持在较高的水平在90°C仍保持了 30°C时92% 的活性，而在40 60°C温度范围内，活性均高于30°C时的活性。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极在0.lmol/L pH = 6. 5PBS中， 在不同温度下催化还原不同浓度H2O2的催化电流-浓度曲线如图4所示。修饰电极在30°C 催化H2O2的灵敏度为0. 0314A · L/(mol · cm2)，相关系数为0. 9994 ；修饰电极在40°C催化 H2O2的灵敏度为0. 0357A-L/(mol · cm2)，相关系数为0. 9992 ；修饰电极在90°C催化H2O2的灵敏度为0.0247A*L/(mol*Cm2)，相关系数为0.9994。这说明本发明(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰电极在高温条件下对H2A具有灵敏的响应和高效的催化能力，可应用于高温下对H2A的检测。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L PBS 中，在 pH 值为 2. 0 7. 0 的范围内，pH 值对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极活性的影响如图5所示。从图中可以看出随着底液酸度的增加，电极活性均保持在较高的水平在pH = 2. 0时仍保持了最适pH = 6. 5时86%的活性，而在pH = 3 4的条件下，活性均高于pH = 6. 5时的活性。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极在pH= 3. 0和pH = 6. 5的 0. lmol/LPBS中催化还原不同浓度H2A的循环伏安曲线以及相应的催化电流-浓度曲线如图6 9所示。修饰电极在pH = 3. 0的底液中催化H2A的线性范围为0. 5 221 μ mol/L, 相关系数为0. 9992 ；修饰电极在pH = 6. 5的底液中催化H2A的线性范围为1 121 μ mol/ L，相关系数为0.9991。这说明本发明(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰电极在强酸条件下对H2A具有灵敏的响应和高效的催化能力，可应用于强酸条件下对H2A的检测。本发明的特点及效果在于本发明将脱氧核糖核酸与氧化还原蛋白或氧化还原酶复合，借助脱氧核糖核酸的耐高温和耐酸性能提高了复合生物活性物质的耐高温和耐酸性能；将复合生物活性物质与磷酸锆纳米片层层组装，可以利用磷酸锆纳米片形成限域空间， 避免脱氧核糖核酸及氧化还原蛋白或氧化还原酶的流失，而且磷酸锆纳米片具有的热稳定性、酸稳定性可以进一步提高复合生物活性物质的耐高温和耐酸性能。因此本发明生物敏感多层复合膜适用于高温和强酸环境，利用本发明生物敏感多层复合膜构建的电化学生物传感器可以在高温及强酸条件下对底物进行检测，并具有灵敏的信号响应、较宽的线性范围及良好的操作稳定性。
图1是不同组装层数(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜的紫外-可见光谱图。其中，横坐标-波长，单位为纳米(nm)；纵坐标-吸光度，无单位。图2是不同组装层数(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰的玻碳电极的循环伏安曲线。其中，横坐标-电压，单位为伏特(V)，相对于Ag/AgCl电极；纵坐标-电流，单位为微安(μ A)。图3是在含有20 μ mol/L H2O2的0. lmol/L pH = 6. 5PBS中，温度对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2修饰电极活性的影响曲线。其中，横坐标-温度，单位为摄氏度CC )；纵坐标-活性百分数，单位为百分数(％ )。图4是(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2修饰的玻碳电极在0. Imol/ LpH = 6. 5PBS中，在不同温度下催化电流与H2A浓度的关系曲线。其中，横坐标_过氧化氢的浓度，单位为微摩尔/升(μ mol/L)；纵坐标-电流，单位为微安(μΑ)。图5是在含有20 μ mol/L H2O2的0. lmol/L PBS中，pH值对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2修饰电极活性的影响曲线。其中横坐标-PH值，无单位；纵坐标-活性百分数，单位为百分数(％)。图6是(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极在含有浓度分别为(a)0，(b)0.5, (c)l, (d)3，(e)7, (f) 13, (g)21，(h)31，(i)51，(j)81，(k)121， (1)171和(m) 221 μ mol/L的H2O2的0. lmol/L pH = 3. OPBS中的循环伏安曲线。其中，横坐标-电压，单位为伏特(V)，相对于Ag/AgCl电极；纵坐标-电流，单位为微安(μ A)。图7是(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极在 0. lmol/L pH = 3. OPBS中，催化电流与H2O2浓度的关系曲线。其中，横坐标-过氧化氢的浓度，单位为微摩尔/升(μ mol/L)；纵坐标-电流，单位为微安(μ A)。图8是(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极在含有浓度分别为(a)0，(b)l，(c) 3，(d)7，(e)13, (f)21, (g)31，(h)51，⑴ 81 和(j)121ymol/ L的H2O2的0. lmol/L pH = 6. 5PBS中的循环伏安曲线。其中，横坐标-电压，单位为伏特 (V)，相对于AgAgCl电极；纵坐标-电流，单位为微安(μ A)。图9是(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极在 0. Imol/LpH = 6. 5PBS中，催化电流与H2O2浓度的关系曲线。其中，横坐标_过氧化氢的浓度，单位为微摩尔/升(μ mol/L)；纵坐标-电流，单位为微安(μ A)。
具体实施例方式实施例1 Α.磷酸锆纳米片溶胶的制备将3. 4g的&0C12 ·8Η20、IOmL质量分数为36%的浓盐酸加入到IOmL去离子水中配成溶液I ；将86mL质量分数为85%的浓磷酸、5mL质量分数为36%的浓盐酸加入到90mL去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为3000转/分钟的胶体磨中，反应2分钟后悬浊液迅速脱离胶体磨；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液占聚四氟乙烯容器体积的40%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在180°C水热处理192小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗涤滤饼至滤液PH值为6，将滤饼在50°C空气气氛中干燥后得到α-磷酸锆颗粒； 将0. Ig α-磷酸锆加入到50mL体积分数为0. 4%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温搅拌 20小时后得到澄清的磷酸锆纳米片溶胶。B.复合生物活性物质水溶液的制备将肌红蛋白溶于去离子水配制成浓度为4g/ L的溶液，然后取2mg鲱鱼精脱氧核糖核酸与ImL上述肌红蛋白水溶液混合，搅拌12小时， 得到复合生物活性物质水溶液。
C.(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)n多层膜修饰玻碳电极的制备 将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到30g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液中 15分钟后取出，用队吹干；将该处理后的电极浸入肌红蛋白-脱氧核糖核酸复合生物活性物质水溶液中15分钟后取出，用去离子水冲洗干净，用N2吹干；再将该电极浸入到浓度为 2. Og/L的磷酸锆纳米片水溶液中15分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层 (磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片 /复合生物活性物质)n(n = 1，2，3，4，5，6)多层膜修饰电极。用日本岛津UV-2501PC型紫外-可见分光光度计对多层膜的组装过程进行监测，测试结果如图1所示，多层膜中肌红蛋白的Soret吸收带出现在408. 5nm处，与肌红蛋白溶液的吸收带位置十分接近，并且该吸收带强度随组装层数的增加线性增长，表明多层膜的组装过程是连续均勻的。将本发明制备的(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n(n= 1，2，3，4，5，6)多层膜修饰电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成电化学生物传感器。将该电化学生物传感器的三电极体系置于0. lmol/L pH = 6. 5的磷酸盐缓冲溶液(PBS) 中进行电化学性能表征，循环伏安测试结果如图2所示，随着组装层数的增加，循环伏安曲线中氧化峰与还原峰强度增大，当组装层数超过2层时，峰强基本保持不变，因此下面的测试均采用组装两层的(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2膜。将(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2膜修饰玻碳电极作为工作电极， 钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构筑电化学传感器，以H2A为底物进行催化活性检测检测。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L pH = 6. 5PBS 中，在 20 90°C温度区间内， 温度对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极活性的影响如图3所示。从图中可以看出随着温度的升高，电极活性均保持在较高的水平在90°C仍保持了 30°C时92% 的活性，而在40 60°C温度范围内，活性均高于30°C时的活性。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极在0.lmol/L pH = 6. 5PBS中， 在不同温度下催化还原不同浓度H2O2的催化电流-浓度曲线如图4所示。修饰电极在30°C 催化H2O2的灵敏度为0. 0314A · L/(mol · cm2)，相关系数为0. 9994 ；修饰电极在40°C催化 H2O2的灵敏度为0. 0357A-L/(mol · cm2)，相关系数为0. 9992 ；修饰电极在90°C催化H2O2的灵敏度为0. 0247A · L/(mol · cm2)，相关系数为0. 9994。这说明本发明生物敏感多层膜修饰电极在高温条件下对H2A具有高效的催化能力、灵敏的响应和较宽的线性范围，可应用于高温下对H2A等底物的检测。对同一批制备的5支电极，其催化20 μ mol/L H2O2的响应电流的相对标准偏差为 1.7%，表明生物敏感多层膜修饰电极具有良好的重现性，层层组装法制备生物敏感多层膜的过程稳定可靠。实施例2 A.磷酸锆纳米片溶胶的制备将13. 6g的&0C12 · 8H20、20mL质量分数为38%的浓盐酸加入到20mL去离子水中配成溶液I ；将130mL质量分数为85%的浓磷酸、IOmL质量分数为38%的浓盐酸加入到20mL去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为5000转/分钟的胶体磨中，反应1分钟后悬浊液迅速脱离胶体磨；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液占聚四氟乙烯容器体积的80%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在水热处理48小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤， 用去离子水洗涤滤饼至滤液PH值为7，将滤饼在60°C空气气氛中干燥后得到α-磷酸锆颗粒；将0.化0-磷酸锆加入到200!^体积分数为0.2%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温搅拌8小时后得到澄清的磷酸锆纳米片溶胶。B.复合生物活性物质水溶液的制备将肌红蛋白溶于去离子水配制成浓度为2g/ L的溶液，然后取0. 5mg鲱鱼精脱氧核糖核酸与ImL上述肌红蛋白水溶液混合，搅拌8小时， 得到复合生物活性物质水溶液。C.(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极的制备 将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到20g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液中 30分钟后取出，用队吹干；将该处理后的电极浸入肌红蛋白-脱氧核糖核酸复合生物活性物质水溶液中30分钟后取出，用去离子水冲洗干净，用队吹干；再将该电极浸入到浓度为 0. 5g/L的磷酸锆纳米片水溶液中30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层 (磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/ 复合生物活性物质)2膜修饰电极。将(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2膜修饰玻碳电极作为工作电极， 钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，构筑电化学传感器，以H2A为底物进行催化活性检测检测。在含有20ymol/L H2O2 的 0. lmol/L PBS 中，在 pH 值为 2. 0 7. 0 的范围内，pH 值对(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极活性的影响如图5所示。从图中可以看出随着底液酸度的增加，电极活性均保持在较高的水平在pH = 2. 0时仍保持了最适pH = 6. 5时86%的活性，而在pH = 3 4的条件下，活性均高于pH = 6. 5时的活性。(磷酸锆纳米片/肌红蛋白-脱氧核糖核酸)2电极在pH= 3. 0和pH = 6. 5的 0. lmol/LPBS中催化还原不同浓度H2A的循环伏安曲线以及相应的催化电流-浓度曲线如图6 9所示。修饰电极在pH = 3. 0的底液中催化H2A的线性范围为0. 5 221 μ mol/L, 相关系数为0. 9992 ；修饰电极在pH = 6. 5的底液中催化H2A的线性范围为1 121 μ mol/ L，相关系数为0. 9991。这说明本发明生物敏感多层膜修饰电极在强酸条件下对H2O2具有高效的催化能力、灵敏的响应和较宽的线性范围，可应用于强酸条件下对H2A等底物的检测。对同一批制备的5支电极，其催化20 μ mol/L的H2A的响应电流的相对标准偏差为1. 5%，表明本发明生物敏感多层膜修饰电极具有良好的重现性，层层组装法制备生物敏感多层膜的过程稳定可靠。实施例3 A.磷酸锆纳米片溶胶的制备将6. 8g的&0C12 · 8H20、5mL质量分数为36%的浓盐酸加入到40mL去离子水中配成溶液I ；将30mL质量分数为85%的浓磷酸、5mL质量分数为36%的浓盐酸加入到120mL去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为4000转/分钟的胶体磨中，反应1分钟后悬浊液迅速脱离胶体磨；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液占聚四氟乙烯容器体积的60%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在200°C水热处理96小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗涤滤饼至滤液PH值为6，将滤饼在55°C空气气氛中干燥后得到α -磷酸锆颗粒；将0. Iga -磷酸锆加入到IOOmL体积分数为0. 3%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温搅拌15小时后得到澄清的磷酸锆纳米片溶胶。B.复合生物活性物质水溶液的制备将血红蛋白溶于去离子水配制成浓度为3g/ L的溶液，然后取Img鲱鱼精脱氧核糖核酸与ImL上述血红蛋白水溶液混合，搅拌10小时， 得到复合生物活性物质水溶液。C.(磷酸锆纳米片/血红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极的制备将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到20g/L的聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中 20分钟后取出，用队吹干；将该处理后的电极浸入血红蛋白-脱氧核糖核酸复合生物活性物质水溶液中20分钟后取出，用去离子水冲洗干净，用N2吹干；再将该电极浸入到浓度为 1. Og/L的磷酸锆纳米片水溶液中20分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层 (磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/ 复合生物活性物质)2膜修饰电极。将本发明(磷酸锆纳米片/血红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成电化学生物传感器进行电化学性能测试，结果表明血红蛋白在多层膜中实现了良好的直接电化学行为，并且具有良好的耐高温及耐酸性的能力，(磷酸锆纳米片/血红蛋白-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极在高温及强酸条件下对H2A具有高效的催化能力、灵敏的响应和较宽的线性范围， 可应用于高温或强酸条件下对H2A等底物的检测。对同一批制备的5支电极，其催化20 μ mol/L的H2A的响应电流的相对标准偏差为1. 8%，表明本发明生物敏感多层膜修饰电极具有良好的重现性，层层组装法制备生物敏感多层膜的过程稳定可靠。实施例4 A.磷酸锆纳米片溶胶的制备方法同实施例3。B.复合生物活性物质水溶液的制备将辣根过氧化物酶溶于去离子水配制成浓度为4g/L的溶液，然后取2mg鲱鱼精脱氧核糖核酸与ImL上述辣根过氧化物酶水溶液混合，搅拌10小时，得到复合生物活性物质水溶液。C.(磷酸锆纳米片/辣根过氧化物酶-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰玻碳电极的制备将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到30g/L的聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中20分钟后取出，用队吹干；将该处理后的电极浸入辣根过氧化物酶-脱氧核糖核酸复合生物活性物质水溶液中20分钟后取出，用去离子水冲洗干净，用队吹干；再将该电极浸入到浓度为1. Og/L的磷酸锆纳米片水溶液中20分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用N2吹干，完成一层(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)2膜修饰电极。将本发明(磷酸锆纳米片/辣根过氧化物酶-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极作为工作电极，钼丝为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，组成电化学生物传感器进行电化学性能测试，结果表明辣根过氧化物酶在多层膜中实现了良好的直接电化学行为， 并且具有良好的耐高温及耐酸性的能力，(磷酸锆纳米片/辣根过氧化物酶-脱氧核糖核酸)2多层膜修饰的玻碳电极在高温及强酸条件下对H2A具有高效的催化能力、灵敏的响应和较宽的线性范围，可应用于高温或强酸条件下对H2A等底物的检测。对同一批制备的5支电极，其催化20 μ mol/L的H2A的响应电流的相对标准偏差为1. 6%，表明本发明生物敏感多层膜修饰电极具有良好的重现性，层层组装法制备生物敏感多层膜的过程稳定可靠。
权利要求
1.一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜，其特征在于该生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与复合生物活性物质层重复叠加构成，其组成为(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n，其中磷酸锆纳米片带负电，复合生物活性物质带正电，η为组装的(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)膜的层数，取值范围为1 6。
2.如权利要求1所述的生物敏感多层膜，其特征在于，所述磷酸锆纳米片厚度为1 20nm，径向尺寸为300 1500nm。
3.如权利要求1所述的生物敏感多层膜，其特征在于，所述的复合生物活性物质由氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸复合而成；氧化还原蛋白或氧化还原酶为肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶中的一种；脱氧核糖核酸为鲱鱼精脱氧核糖核酸；氧化还原蛋白或氧化还原酶与脱氧核糖核酸的质量比为4 1 2 1。
4.一种制备如权利要求1 3所述的生物敏感多层膜的方法，利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面，其特征在于 工艺步骤为将玻碳电极清洗干净，然后用队吹干；将该电极浸入到浓度为20 30g/L的聚苯乙烯硫酸钠水溶液或聚苯乙烯基磺酸钠水溶液中，15 30分钟后取出，用队吹干；将该电极浸入浓度为0. 5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶中，15 30分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净， 用N2吹干；再将该电极浸入浓度为2. 5 6. Og/L的复合生物活性物质水溶液中，10 30 分钟后取出，用蒸馏水冲洗干净，用队吹干，完成一层(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质) 膜的制备；重复以上步骤，制备出(磷酸锆纳米片/复合生物活性物质)n多层膜修饰电极。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述浓度为0.5 2. Og/L的磷酸锆纳米片溶胶的制备方法为将&0C12 · 8H20、质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液I ；将质量分数为85%的浓磷酸、质量分数为36 38%的浓盐酸加入到去离子水中配成溶液II ；将溶液I与溶液II在室温下同时加入到转速为3000 5000转/分钟的胶体磨中，反应1 2分钟后悬浊液脱离胶体磨。按照两种溶液混合后的总体积计算，各反应物料浓度分别为JrOCl2 ·8Η20浓度为0. 044 0. 22mol/L，磷酸浓度为2. 0 IOmol/ L，盐酸浓度为0. 50 2. Omol/L ；将所得悬浊液转移到聚四氟乙烯容器中，悬浊液体积占聚四氟乙烯容器体积的40 80%，将聚四氟乙烯容器密封于水热反应釜中，在180 240°C 水热处理48 192小时，将水热釜自然冷却至室温，开釜抽滤，用去离子水洗涤滤饼至滤液 PH值为6 7，将滤饼在50 60°C空气气氛中干燥后得到层状α -磷酸锆颗粒；按照固/ 液比为0. 5 2. 0g/L的比例将层状α -磷酸锆颗粒加入到体积分数为0. 2 0. 4%的四甲基氢氧化铵水溶液中，室温下搅拌8 20小时，所得澄清溶胶即为剥离的磷酸锆纳米片溶胶，浓度为0.5 2. 0g/L。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述浓度为2.5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液的制备方法为将肌红蛋白、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶等氧化还原蛋白或氧化还原酶中的一种用去离子水配制成浓度为2 4g/L的水溶液，按氧化还原蛋白或氧化还原酶脱氧核糖核酸的质量比为41 21比例与脱氧核糖核酸混合，搅拌8 12小时，得到浓度为2. 5 6. 0g/L的复合生物活性物质水溶液。
全文摘要
一种适用于高温和强酸环境的生物敏感多层膜及其制备方法，属于电化学生物传感器技术领域。该生物敏感多层膜由磷酸锆纳米片层与氧化还原蛋白或氧化还原酶-脱氧核糖核酸形成的复合生物活性物质层重复叠加构成。制备方法是先制备出磷酸锆纳米片和复合生物活性物质，然后利用带相反电荷的磷酸锆纳米片和复合生物活性物质间的静电作用，依次层层组装到玻碳电极表面。优点在于，利用层层组装方法制备生物敏感多层膜，不受需固载的生物活性物质分子大小的限制；这种生物敏感多层膜修饰电极将脱氧核糖核酸的生物相容性与磷酸锆纳米片的稳定性相结合，在高温和强酸条件下具有灵敏的信号响应、较宽的线性范围及良好的操作稳定性。
文档编号G01N27/327GK102507687SQ20111030554
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者杨文胜, 海波 申请人:北京化工大学