专利名称：用饱和染料进行核酸解链分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链核酸结合染料和在双链核酸结合染料的存在下进行核酸分析的方法。
背景技术：
分析DNA序列变异的方法可以大体分为两类1)对已知序列变体的基因分型和2) 对未知变体的扫描。现有多种对已知序列变体进行基因分型的方法，并可以采用使用荧光探针的单一步骤、同质的、闭管的方法(Lay MJ等，Clin. Chem 1997;43:2262-7)。相反，大部分针对未知变体的扫描技术要求PCR之后的凝胶电泳或柱分离。这些技术包括单链构象多态性(Orita 0 等，Proc Natl Acad Sci USA 1989 ;86 :2766_70)、异源双链分子迁移 (Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999 ;20 :1177_85)、变性梯度凝胶电泳(Abrams ES等， Genomics 1990 ;7 :463_75)、温度梯度凝胶电泳(Wartell RM 等，J Chromatogr A 1998 ； 806 169-85)、酶或化学切割法(Taylor GR 等，Genet Anal 1999;14:181-6)以及 DNA 测序。通过测序识别新的突变也要求PCR之后的多个步骤，也就是循环测序和凝胶电泳。变性高效液相色谱(Xiao W等，Hum Mutat 2001 ；17 :439_74)涉及将PCR产物注入层析柱。最近，用于突变扫描的同质荧光方法已有报道。SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, Oregon)是一种在实时PCR中经常用于监测产物形成(ffittwer CT等， BioTechniques 1997 ;22 130-8)和解链温度(Ririe KM 等，Anal. Biochem 1997 ；245 154-60)的双链特异性DNA染料。通过使用SYBR Green I的解链曲线分析，已经在167bp 以内的产物中检测到杂合子单一碱基改变的存在(Lipsky RH等，Clin Chem 2001 ；47 635-44)。然而，扩增后在解链分析之前，对PCR产物进行了纯化并添加了高浓度的SYBR Green I。所述方法中用以检测的SYBR Green I浓度抑制PCR反应(Wittwer CT等， BioTechniques 1997 ;22 :130_1，134-8)；因而，该染料在扩增后添加。希望能有一种能用于检测遗传变异(包括杂合子单个碱基改变)的存在并能在PCR之前加入的染料。单核苷酸多态性(SNP)是目前为止在人类和其它物种中间观察到的最常见的遗传变异。在这些多态性中，个体之间仅有单个碱基的变化。所述改变可能引起蛋白质中一个氨基酸的改变、改变转录速度、影响mRNA剪接、或对细胞过程没有明显作用。有时在所述改变沉默(例如，在其编码的氨基酸没有改变的情况下)的情况下，SNP基因分型可能仍具有价值，如果所述改变与由另一个遗传改变引起的独特表现型相连(关联的)。现有多种SNP基因分型的方法。大部分采用PCR或其它扩增技术以扩增感兴趣的模板。可以使用包括凝胶电泳、质谱和荧光在内的同步或后续分析技术。均相 (homogeneous)并且不需要在扩增开始后添加试剂或为了分析而对反应物手工取样的荧光技术是具有吸引力的。示范性的均相技术使用寡核苷酸引物来定位感兴趣的区域以及荧光标记或染料用于产生信号。通过使用对DNA变性温度稳定的热稳定酶，示例性的基于PCR 的方法是完全闭管的，这样在加热开始以后，不需要进行添加。对于SNP基因分型可以采用几种闭管的、同质的荧光PCR方法。这些方法包括使用有两个相互作用的发光基团的FRET寡核苷酸探针(邻近杂交探针，TaqMan探针， Molecular Beacons, Scorpions)、仅有一个荧光基团的单一寡核苷酸探针(G-淬灭探针， Crockett, A. 0.禾口 C. T. ffittwer, Anal. Biochem. 2001 ；290 :89_97 以及 SimpleProbes，Idaho Technology)、以及使用双链DNA染料而不是共价荧光标记的寡核苷酸探针的技术。由于不需要标记的寡核苷酸探针，可以降低设计时间和检测成本，所述染料技术是具有吸引力的。已经公开了两种使用双链DNA染料的SNP分型技术。可将存在双链DNA染料情况下的等位基因特异性扩增用于实时PCR基因分型(Germer S等，Genome Research 2000 ； 10 :258-266)。在Germer的参考文献的方法中，在存在一条共有反向引物的情况下，两条 3’_碱基存在差异的等位基因特异性引物差异扩增一条或另一条等位基因。虽然不需要荧光标记的寡核苷酸，基因分型要求3条引物以及针对每种基因型的两个反应池。此外，需要监测每个循环荧光信号的实时PCR仪。另一种基于染料的方法不需要实时监测，每种SNP基因型仅需要一个反应池，并使用解链分析(Germer S等，Genome Research 1999;9:72-79)。在这种方法中，如前面的 Germer方法一样，也使用了需要3条引物的等位基因特异性扩增。此外，所述引物中的一条含GC-发夹尾部，以提高一个扩增子的解链温度，使得在一个反应池中通过解链温度进行区分成为可能。PCR扩增后检测荧光，而不需要实时采集。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种仅需要标准PCR混合物，包括试剂、引物、以及在 PCR前简单添加的本公开的“饱和”双链(ds)DNA结合染料或新型dsDNA结合染料的方法。 为了本发明的目的，“饱和”染料是指该染料以为不存在染料情况下由PCR通常产生的双链DNA量(例如约10纳克/微升)提供最大荧光信号的浓度存在时，不会明显抑制PCR 反应。虽然所述染料通过其饱和浓度时与PCR的相容性进行鉴别，需要理解的是所述染料能以低得多的浓度使用。扩增过程中或扩增之后，所述染料可以与使用标记引物情况下类似的方式通过解链曲线分析用于区分异源双链分子和同源双链分子(Gimdry CN，等，Clin Chem. 2003 Mar ；49 (3) 396-406)。异源双链分子和同源双链分子的鉴别可以用于包括突变扫描和基因分型在内的多种分析。术语“扫描”是指将一个核酸片段与一个参照核酸片段比较以检测序列上任何差异的存在的过程。表示存在序列差异的阳性结果不一定反映序列变异的确切性质或其在核酸片段上的位置。术语“基因分型”包括检测和确定已知的核酸序列变异，这些变异包括但不限于SNP、碱基缺失、碱基插入、序列重复、重排、倒置、碱基甲基化、短串联重复数；以及在两倍体基因组的情况下，基因组是否是序列变异的纯合子或杂合子，以及一条DNA链上两个或更多序列变异的顺/反位置关系(单体型分析)。任选地， 可在解链曲线分析之前的任何时间将一种或多种未标记探针加入该混合物。术语“未标记探针”指未共价连接于染料并且设计为能完全或部分杂交于靶序列的寡核苷酸或多核苷酸。该混合物中存在的染料不能结合未标记探针或与未标记探针解离，尤其是当探针与靶序列杂交和解链时。本文所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括天然或修饰的单体或连接(包括能够通过碱基配对相互作用特异性结合靶多核苷酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、肽核酸核苷等)的低聚物和聚合物。任选地，可用一个或多个非荧光部分修饰未标记的探针，这些非荧光部分例如但不限于非荧光小沟结合物、生物素、间隔区、接头、磷酸、碱基类似物、非天然碱基等。在PCR混合物中提供未标记探针的实施方式中，需要未标记探针与结合靶序列的结合不像能抑制扩增的那么紧密。本发明的另一个方面，鉴别了多种双链DNA结合染料。本发明的双链DNA结合染料能在扩增中或扩增后以对于DNA的充分饱和量存在，同时对PCR的抑制最小化。例如，在最大PCR相容浓度下，双链DNA结合染料具有至少为50%的饱和百分比。在其它实施方式中， 所述饱和百分比至少为80%，更具体的至少为90%。在还有其它实施方式中，所述饱和百分比至少99%。需要理解的是，所述饱和百分比是与饱和浓度(也就是在存在预先确定的双链DNA量的情况下提供可能的最高荧光强度的浓度)的相同染料的荧光相比的荧光百分比。举例来说，预先确定的双链DNA量是100纳克/10微升，这是典型的PCR末期到达平台期时产生的DNA量。需要进一步理解到染料制剂可能包含抑制扩增的杂质。这样的杂质应该在确定饱和百分比之前去除。也需要理解的是，饱和百分比荧光强度的测量在与检测结合双链DNA的染料良好匹配的波长处进行，而且如果可能的话，不在能检测到来自游离染料或在高染料_碱基对比率下可能形成的染料结合的二级形式(例如，染料与双链DNA-染料复合物结合或与单链核酸结合)的高本底荧光的波长处检测。在本发明的还有另一个方面，双链DNA结合染料在最大PCR相容浓度下具有大于 50%的饱和度，而且具有可能与常规实时PCR仪不兼容的激发/发射光谱。用于实时PCR 分析的“常规”仪器具有介于约450-490纳米的激发波长和介于约510-530纳米的发射检测波长。已经发现某些“蓝色”染料与这些系统兼容，虽然其激发/发射光谱可能有所不同。这样，在本发明的这个方面，提供了一种在PCR过程中或PCR之后使用常规实时PCR仪和双链DNA结合染料分析的方法，其中双链DNA结合染料正如在存在双链DNA的PCR缓冲液中测得的具有介于410-465纳米，尤其是介于430-460纳米的最大激发波长，并具有介于 450-500纳米，尤其是介于455-485纳米的最大发射波长。适当的仪器可以使用上述激发/ 检测区间，或可以按照染料的激发/发射峰值进行改进。检测本发明的“蓝色”染料以及检测如荧光素和SYBR Green I等常规染料的适当区间可以包括440-470纳米的激发波长和 500-560纳米的检测波长。注意到，虽然许多这些染料适合用于标准的实时PCR仪器和解链仪器操作，但调整光学器件以更好地匹配这些染料的激发/发射光谱可进一步提高它们用于定量或定性扩增分析的灵敏度。在本发明又一方面，通过在一种或多种未标记探针和双链结合染料的存在下进行解链曲线分析进行扫描或基因分型。可在扩增期间或之后、或没有扩增的情况下进行解链曲线分析。染料可以是本公开的饱和染料或新型染料。虽然这里所提供的实例是针对解链曲线分析的，需要理解的是，本发明的染料可以用于多种包括核酸定量、起始浓度测定、对存在一种核酸的检测、用标记探针的复合检测以及其它基于PCR的方法在内的实时定量PCR分析。此外，虽然提及的是PCR，其它扩增方法可以与本发明的染料相容。这样的合适的方法包括链置换扩增(SDA)、依赖于核酸序列的扩增(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、Qi3复制酶介导的扩增、等温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)、转录介导的扩增(TMA)等。也可采用不对称PCR。因此，当使用术语PCR的时侯，需要理解为包括PCR的变型和其它可供选择的扩增方法。相对于一条链更有利于扩增另一条链的扩增方法尤其适用于采用未标记探针的解链曲线分析。而且，虽然参照扩增，但应理解可对未经扩增的核酸样品进行本发明的解链曲线分析。此外，需要理解双链DNA结合染料包括嵌入剂以及其它与核酸结合的染料，只要所述染料差异结合双链和单链核酸，或产生基于双链核酸数量的差异信号。因此，在本发明的一个实施方式中，提出了新型染料。新型染料可以是或不是饱和染料，可在扩增期间或之后使用这种新型染料，或者可在进行或未进行扩增的情况下进行解链曲线分析期间使用这种新型染料。例如，该新型染料具有下式式中部分0代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；X是氧、硫、硒、碲或选自C (CH3)2或NR1的部分，式中R1是氢或Cp6烷基；R2选自Cp6烷基、C3_8环烷基、芳基、芳基(C"烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；t = 0 或 1 ；
权利要求
1. 一种PCR反应混合物，含有(a)靶核酸；
2.如权利要求1所述的PCR反应混合物，其特征在于，所述dsDNA结合染料具有至少 50%的百分比饱和度。
3.如权利要求1所述的PCR反应混合物，其特征在于，所述混合物还含有设计用于扩增所述靶核酸的第二部分以产生第二扩增子的第二对寡核苷酸引物。
4.一种核酸分析方法，所述方法包括如下步骤将靶核酸与饱和dsDNA结合染料和设计以杂交靶核酸一部分的未标记探针混合，形成混合物，使未标记探针能够杂交靶核酸以形成探针/靶标双链体，在加热混合物时通过测定dsDNA结合染料的荧光产生探针/靶标双链体的解链曲线，以及分析解链曲线的形状。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分析解链曲线的形状的步骤包括产生一导数解链曲线。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分析解链曲线的形状的步骤还包括通过分析所述导数解链曲线上一个或多个解链峰的形状和位置进行基因分型。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增所述靶核酸的步骤，其中，所述扩增步骤在产生解链曲线前进行。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增步骤包括通过聚合酶链式反应进行扩增。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应是不对称聚合酶链式反应。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述未标记探针与所述靶核酸混合，接着扩增所述靶核酸。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在扩增所述靶核酸前先加入所述未标记探针和dsDNA结合染料。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，对所述未标记探针的3’端封端，以阻止扩增期间的延伸。
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述未标记探针至少长14个核苷酸。
14.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合物含有第二未标记探针，所述分析步骤包括在所述靶核酸的两个基因座进行基因分型。
15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述混合物含有第二靶核酸和设计用于与所述第二靶核酸至少部分杂交的第二未标记探针，所述分析步骤包括对所述靶核酸上的第一基因座进行基因分型，和对所述第二靶核酸上的第二基因座进行基因分型。
16.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸的所述部分含有单核苷酸多态性。
17.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述dsDNA结合染料具有至少50%的百分比饱和度。
18.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述染料选自G5、H5、I5、K5、L5、S5、D6、 E6、P6、R6、Y6、Z6、F7、N7、07、P7、Q7、R7、S7、T7、U7、V7、W7、X7、Z7、C8、E8、G8、K8、L8、M8、 N8、08、P8、T8、V8、W8、X8、Z8、A9、C9、G9、19、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、09、 P9、Q9、R9、A10、V10、F11 和 Hll。
19.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述染料选自P0-PR0 -1、BO-PROtm-I、 SYTO 43, SYTO 44, SYTO 45, SYTOX Blue、P0P0 -3、B0B0 -3、LO-PROtm-U JO-PROtm-U YO-PRO -1、TO-PRO -1、SYTO 9、SYTO 11、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 2 3、T0T0 -3、YOYO _3、GelStar 和 EvaGreen 。
20.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸和所述未标记探针在溶液中是游离的，两者都不固定在表面上。
21.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括一内标，其中，所述解链曲线基于该内标的Tm而偏移。
22.一种用于分型靶核酸的试剂盒，包括设计用于与所述靶核酸上至少一个等位基因的一部分互补性杂交的3’端封端的未标记探针，和饱和dsDNA结合染料。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有热温度聚合酶和设计用于扩增所述靶核酸的寡核苷酸引物。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸引物含有第一引物和第二引物，所述第一引物的摩尔量高于所述第二引物的摩尔量。
25.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述未标记探针的3’端被封端。
26.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述dsDNA结合染料具有至少50%的百分比饱和度。
27.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述dsDNA结合染料具有至少90%的百分比饱和度。
28.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述染料选自N7、R7、X7、T8、07、P8、 P7、Q7、T7、V7、W8、Z8、Z7、X8、G9、C9、A9、M9、N9、19、19Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、09、 P9、V10、F11 和 Hll。
29.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述染料具有下式
全文摘要
用饱和染料进行核酸解链分析。本发明提供了核酸分析方法，其中将靶核酸与dsDNA结合染料混合形成混合物。任选地，该混合物中包含未标记探针。通过在加热该混合物时测定dsDNA结合染料的荧光，产生靶核酸的解链曲线。也提供了用于核酸分析的染料和染料的制备方法。
文档编号G01N21/64GK102367477SQ201110321820
公开日2012年3月7日 申请日期2005年4月20日 优先权日2004年4月20日
发明者C·T·威特沃, C·威尔默-佩尼, J·A·霍尔登, L·周, V·E·杜乔勒斯 申请人:爱达荷州技术股份有限公司, 犹他大学研究基金会