专利名称：一种鉴定真伪大黄种子的方法
技术领域：
本发明涉及植物种子真伪的鉴别领域，特别涉及大黄种子真伪的鉴别。
背景技术：
大黄为蓼科植物掌叶大黄Iiheum palmatum L.、唐古特大黄Iiheumtanguticum Maxim, ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。具有泻热通肠， 凉血解毒，逐瘀通经的功效。用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌打损伤，外治水火烫伤；上消化道出血。掌叶大黄分布于甘肃东南部、青海、四川西部、云南西北部及西藏东部；唐古特大黄分布于甘肃、青海、四川及西藏东北部；药用大黄分布于陕西南部、河南西部、湖北西部、四川、云南等地。华北大黄或牛耳大黄是常见的两种伪品大黄，易与唐古特大黄等真品大黄混淆。近年来，由于对野生大黄资源的无计划采挖，导致野生大黄资源逐年减少，全国野生大黄资源已濒临枯竭。为满足市场对优质大黄日益增长的需求量，大黄人工种植规模不断扩大，而品质纯正的种子是药材栽培的前提，是提高药材产量和质量的根本保障。目前，我国药用大黄种子没有检验标准和质量标准，主要是通过形状、大小、颜色、 表皮、饰纹等性状进行鉴别，具有一定的局限性，且因真品和伪品大黄种子形态区别较小， 区分难度较大。亟需寻找一种简便、准确、可靠的方法鉴定真品和伪品大黄种子的方法。
发明内容
为了准确将真品和伪品大黄种子区别开，本发明提供了一种新的鉴别方法。本发明提供了一种鉴别真伪大黄种子的方法，它包括如下步骤(1)取待检种子，提取待检种子中的大黄酚和大黄素；(2)测定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量；(3)计算大黄酚含量/大黄素含量的比值；(4)根据步骤(3)计算的比值判断若比值大于1，判断该种子为真品大黄种子，若比值小于或者等于1，判断该种子为伪品大黄种子。所述真品大黄种子是指药典规定的掌叶大黄Iiheum palmatum L.、唐古特大黄 Rheum tanguticum Maxim, ex Balf.或药用大黄 Rheum officinaleBaill.的禾中子，伪品大黄种子为包括华北大黄种子和牛耳大黄种子的其他种子。其中，所述步骤(1)提取待测样品中的大黄酚和大黄素的方法为取待测样品粉末(过四号筛)，加入甲醇加热回流30 90min，甲醇与样品粉末 (过四号筛)的体积质量比为150 200，放冷，补充甲醇至原重量，摇勻，滤过，挥去溶剂， 加浓度为6 10%盐酸溶液，盐酸溶液与样品粉末(过四号筛)的体积质量比为300 350，超声处理1 3min，加三氯甲烷加热回流40 80min，三氯甲烷与样品粉末(过四号筛)的体积质量比为300 350，冷却，分取三氯甲烷层，减压回收溶剂。
其中，所述甲醇加热回流60min，甲醇与样品粉末(过四号筛)的体积质量比为 167，加8%盐酸溶液，盐酸与样品粉末(过四号筛)的体积质量比为333，超声处理aiiin，力口三氯甲烷加热回流60min，三氯甲烷与样品粉末(过四号筛)的体积质量比为333。其中，所述步骤O)中测定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量的方法为高效液相色谱法，其流动相为甲醇和0.5%高氯酸的混合溶液，且Vw V050^se= 85 15，且检测波长为254nm。优选地，所述流动相的流速为0. Sml/min。优选地，所述高效液相色谱法的柱温为40°C。其中，所述步骤中，若比值为1.043-2. 487，判断该种子为真品大黄种子，若比值为0. 019-0. 895，判断该种子为伪品大黄种子。本发明提供的方法可以简便、快速、准确地区别真品和伪品大黄种子，为大黄的人工大规模种植提供保障。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式仪器与试药仪器高效液相色谱仪岛沣高效液相色谱仪(含LC-20AT 二元泵，SPD-20A紫外 /可见光检测器，CTO-10ASVP柱温箱，LCsolution色谱工作站)，BP211D电子天平(感量 0. Olmg，德国 Sartorius 公司)，BS200S 电子天平(感量 0. OOlg，德国 Sartorius 公司)， KQ-300E超声清洗器(功率300W，容量10L)。试药大黄素(批号110756-200110，纯度>98%)、大黄酚(批号 110796-200716，纯度> 98% )均购自中国药品生物制品检定所。试剂甲醇、乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)、0. 5%高氯酸，0. 磷酸，水为重蒸水，为色谱流动相；甲醇(分析纯)。实施例1本发明大黄素和大黄酚的提取方法及高效液相色谱的检测条件1.大黄素、大黄酚对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品10. 85mg和大黄酚对照品10. 25mg对照品，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇勻，作为储备液。再精密吸取储备液Iml至5ml容量瓶中， 加甲醇稀释至刻度，摇勻，分别制成每Iml含大黄素86. Sug和大黄酚82ug;分别精密量取上述对照品溶液各anl，混勻，制成每Iml中含大黄素17. 36ug和大黄酚16. 40ug的对照品溶液。2.供试品溶液的制备方法研究2.1提取方法的选择取样品粉末(过四号筛)约0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml， 称定重量，分别进行加热回流30min或者超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过。分别精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液 IOml，超声处理2min，再加氯仿IOml，加热回流lh，放冷，置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液 10 μ 1进样，测定含量，结果见表1。表1提取方法选择结果
提取方法大黄素(％ )大黄酚(％ )~
超声提取0. 1210. 129
加热回流0. 1340. 142实验结果表明，加热回流提取方法比超声提取的方法对其中有效成分的提取更完全，故选用加热回流提取方法。2. 2提取时间的选择取样品粉末(过四号筛)约0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml， 称定重量，分别加热回流30min、60min或者90min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇勻，滤过。分别精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8 %盐酸溶液IOml，超声处理aiiin，再加氯仿10ml，加热回流lh，放冷，置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液10μ 1进样，测定含量，结果见表2。表2不同提取时间选择结果
提取时间I大黄素(％) 大黄酚(％)~ 30min0. 1300. 141
60min0. 1580. 164
90min0. 1590. 166结果表明，加热回流60min时，大黄素和大黄酚的含量达到最高值，而90min的提取效果同60min无显著区别，故确定提取方法为加热回流提取60min。2. 3提取溶媒的选择取样品粉末(过四号筛)约0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇或者乙醇25ml，称定重量，加热回流提取lh，放冷，再称定重量，分别用甲醇和乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过。分别精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10ml， 超声处理2min，再加氯仿IOml，加热回流lh，放冷，置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，分别加甲醇和乙醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液10 μ 1进样，测定含量，结果见表3。表3提取溶媒选择结果
权利要求
1.一种鉴别真伪大黄种子的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)取待检种子，提取待检种子中的大黄酚和大黄素；(2)测定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量；(3)计算大黄酚含量/大黄素含量的比值；(4)根据步骤(3)计算的比值判断若比值大于1，判断该种子为真品大黄种子，若比值小于或者等于1，判断该种子为伪品大黄种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)提取待测样品中的大黄酚和大黄素的方法为取待测样品粉末，加入甲醇加热回流30 90min，甲醇与样品粉末的体积质量比为 150 200，放冷，补充甲醇至原重量，摇勻，滤过，挥去溶剂，加浓度为6 10%盐酸溶液， 盐酸溶液与样品粉末的体积质量比为300 350，超声处理1 3min，加三氯甲烷加热回流 40 80min，三氯甲烷与样品粉末的体积质量比为300 350，冷却，分取三氯甲烷层，减压回收溶剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述甲醇加热回流60min，甲醇与样品粉末的体积质量比为167，加8%盐酸溶液，盐酸与样品粉末的体积质量比为333，超声处理 2min，加三氯甲烷加热回流60min，三氯甲烷与样品粉末的体积质量比为333。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤O)中测定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量的方法为高效液相色谱法，其流动相为甲醇和0. 5%高氯酸的混合溶液，且 Vw 高麵=85 15，且检测波长为邪4歷。
5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述流动相的流速为0.Sml/min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法的柱温为40°C。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，若比值为1.043-2.487， 判断该种子为真品大黄种子，若比值为0. 019-0. 895，判断该种子为伪品大黄种子。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别真伪大黄种子的方法，它包括如下步骤(1)取待检种子，提取待检种子中的大黄酚和大黄素；(2)测定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量；(3)计算大黄酚含量/大黄素含量的比值；(4)根据步骤(3)计算的比值判断若比值大于1，判断该种子为真品大黄种子，若比值小于或者等于1，判断该种子为伪品大黄种子。本发明提供的方法可以快速、准确的鉴别待检大黄种子的真伪，为大黄人工大规模种植提供了保障。
文档编号G01N30/02GK102520077SQ20111033778
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者刘震东, 吕强, 张大永, 江云, 连晓晓, 陈孝雨, 马曲 申请人:四川九寨沟新荷花生态药材有限公司, 四川新荷花中药饮片股份有限公司, 四川新荷花川贝母生态药材有限公司