专利名称：一种水中微囊藻毒素的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水中微囊藻毒素的检测方法，属于微囊藻毒素检测技术领域。
技术背景
环境污染造成的水体富营养化所引起的有害蓝藻水华的频繁发生，已成为国内外普遍关注的环境问题。微囊藻毒素(MCs)为有害的蓝藻水华释放的一类具有强烈促癌作用的肝毒素，已发现60多种异构体。微囊藻毒素性质稳定，煮沸后不失活，不挥发，抗PH变化， 溶于水、甲醇和丙酮。微囊藻毒素对生物体损害主要表现为肝脏毒性和神经毒性，对肾、肾上腺、肺及胃等也有不同程度的损伤。蓝藻水华及其毒素已列为微生物和有机污染物的检测项目，并已有国家推荐水中微囊藻毒素的安全浓度为1.0yg/L。我国的“生活饮用水卫生规范”和“城市供水水质标准”中都规定MC-LR的最高含量为1. 0 μ g/L。
对于微囊藻毒素的检测方法主要有传统的小鼠腹腔注射生物分析法、酶联免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析方法，但这些方法都存在操作复杂，费时且不能鉴定MC的种类等缺点，而常用的高效液相色谱法(HPLC)，样品耗样量大且污染环境。毛细管电泳、质谱联用技术(CE-MS)虽然所需样品少、分离效率高，还可以通过分子量信息确认MCs的种类，但是这种方法需要昂贵的设备，专业的技能，高的成本而且费时。因此迫切需要发明一种快速，灵敏的微囊藻毒素的检测方法。发明内容
本发明的目的是提供一种水中微囊藻毒素的检测方法，该方法可快速，灵敏的检测水中的藻毒素。
本发明提供的一种水中微囊藻毒素的检测方法，包括如下步骤
(1)将微囊藻毒素的单克隆抗体连接到磁性纳米颗粒上并分散于水或磷酸盐缓冲溶液，得到连接有所述微囊藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒(MAb-MPs)溶液；
(2)将拉曼探针分子吸附于银纳米颗粒上并用二氧化硅进行包覆得到包覆有二氧化硅层的银纳米颗粒，然后将所述微囊藻毒素连接到所述包覆有二氧化硅层的银纳米颗粒上并分散于水或磷酸盐缓冲溶液得到连接有所述微囊藻毒素的拉曼探针分子(MC-SERS Tags)溶液；
(3)将至少3种不同浓度所述微囊藻毒素的标准水溶液与所述连接有微囊藻毒素的拉曼探针分子溶液混合得到孵育液A ；将所述孵育液A与所述连接有微囊藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒溶液混合并进行反应得到磁性免疫复合物A ；测定所述磁性免疫复合物A的拉曼光谱，得到拉曼光谱的峰强与所述微囊藻毒素的标准水溶液之间的标准曲线.一入 ，
(4)将含有微囊藻毒素的待测水溶液与所述连接有微囊藻毒素的拉曼探针分子溶液混合得到孵育液B，所述待测水溶液与步骤( 中所述标准水溶液的体积相同；将所述孵育液B与所述连接有藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒溶液混合并进行反应得到磁性3免疫复合物B，所述反应时间与步骤(3)中所述反应时间相同；测定所述磁性免疫复合物B 的拉曼光谱，然后根据所述拉曼光谱的峰强与所述微囊藻毒素的标准水溶液之间的标准曲线即得待测水溶液中微囊藻毒素的浓度。
上述的检测方法中，所述拉曼探针分子的结构式如式(a)所示，其中，R选自H、 NH2、烷基、烷氧基、COOH和OH等，所述烷基具体可为碳原子数为1 5的烷基，所述烷氧基具体可为碳原子数为1 5的烷氧基，
权利要求
1.一种水中微囊藻毒素的检测方法，包括如下步骤(1)将微囊藻毒素的单克隆抗体连接到磁性纳米颗粒上并分散于水或磷酸盐缓冲溶液中，得到连接有所述微囊藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒溶液；(2)将拉曼探针分子吸附于银纳米颗粒上并用二氧化硅进行包覆得到包覆有二氧化硅层的银纳米颗粒，然后将所述微囊藻毒素连接到所述包覆有二氧化硅层的银纳米颗粒上并分散于水或所述磷酸盐缓冲溶液中得到连接有所述微囊藻毒素的拉曼探针分子溶液；(3)将至少3种不同浓度的所述微囊藻毒素的标准水溶液与所述连接有微囊藻毒素的拉曼探针分子溶液混合得到孵育液A ；将所述孵育液A与所述连接有微囊藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒溶液混合并进行反应得到磁性免疫复合物A ；测定所述磁性免疫复合物A的拉曼光谱，得到拉曼光谱的峰强与所述藻毒素的标准水溶液之间的标准曲线；(4)将含有微囊藻毒素的待测水溶液与所述连接有微囊藻毒素的拉曼探针分子溶液混合得到孵育液B，所述待测水溶液与步骤( 中所述标准水溶液的体积相同；将所述孵育液 B与所述连接有微囊藻毒素的单克隆抗体的磁性纳米颗粒溶液混合并进行反应得到磁性免疫复合物B，所述反应时间与步骤(3)中所述反应时间相同；测定所述磁性免疫复合物B的拉曼光谱，然后根据所述拉曼光谱的峰强与所述微囊藻毒素的标准水溶液之间的标准曲线即得待测水溶液中微囊藻毒素的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述拉曼探针分子的结构式如式(a) 所示，其中，R选自H、NH2、烷基、烷氧基、COOH或0H，(a)。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述磁性纳米颗粒为氧化铁、金属合金、铁氧体、氧化铬或氮化铁；所述磁性纳米颗粒度的粒径为IOOnm 10 μ um。
4.根据权利要求1-3中任一所述的检测方法，其特征在于所述银纳米颗粒的粒径为 Inm 200nm ；所述二氧化硅层的厚度为Inm 30nm。
5.根据权利要求1-4中任一所述的检测方法，其特征在于所述微囊藻毒素的标准水溶液的质量体积浓度为0 50 μ g/L。
6.根据权利要求1-5中任一所述的检测方法，其特征在于步骤(3)中在测定所述磁性免疫复合物A的拉曼光谱之前，还包括用所述磷酸盐缓冲溶液洗涤所述磁性免疫复合物 A的步骤。
7.根据权利要求1-6中任一所述的检测方法，其特征在于步骤⑷中在测定所述磁性免疫复合物B的拉曼光谱之前，还包括用所述磷酸盐缓冲溶液洗涤所述磁性免疫复合物 B的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一所述的检测方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲溶液的组成如下=NaCl 8. 00g, KCl 0. 20g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · H2O 1. 56g 和蒸溜水 1000ml。
全文摘要
本发明公开了一种水中微囊藻毒素的检测方法。所述方法包括如下步骤(1)制备连接有微囊藻毒素的单克隆抗体的磁颗粒；(2)制备连接有微囊藻毒素分子的拉曼探针，所述拉曼探针是通过银纳米颗粒对小分子的拉曼增强制得的；(3)在所确定的最佳反应条件下绘制微囊藻毒素的标准检测曲线；(4)通过测样品拉曼光谱特定峰的峰强对比标准曲线确定待测样品的浓度。所述检测过程结合了激光拉曼增强和竞争免疫，同时在检测过程中应用了磁分离，与传统的检测方法相比，大大缩短了检测时间。本发明所提供的检测方法还可用于水中其他种类藻毒素分子以及小分子的检测，为水中污染物提供了一条快速、方便的检测途径。
文档编号G01N21/65GK102507942SQ20111034390
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者张兴华, 李津茹, 江龙 申请人:中国科学院化学研究所