专利名称：一种快速检测痕量吡虫啉残留的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫化学检测领域，涉及一种快速检测微量氯化烟碱杀虫剂吡虫啉的酶联免疫检测试剂盒。二、技术背景
1978年在瑞士苏黎世举行的国际纯粹化学与应用化学协会(IUPAC)年会上，Soloway 等报道了一类称为硝基甲撑杀虫剂的新化合物，并指出这类化合物中杀虫活性最高的是硝基噻嗪(N i t h i a ζ i η e )，但由于硝基噻嗪分子中的2 -硝基亚甲基遇光易分解，致使 Nithiazine没有完全市场化，因此，其未能大范围服务于农业生产。20世纪80年代后期， 日本科学家以Nithiazine为先导结构，通过和硝基胍建立桥偶联，引入含氮原子的芳杂环甲基，作为2-硝基亚甲基-咪唑烷五元环或六元环系列的N-取代化合物，再通过杂环上官能团转换，获得了一系列结构衍生物，通过杀虫活性测定，发现活性最高的是硝基亚胺类化合物，该类化合物经过在世界各地的大田实验，发现其中的的吡虫啉(Imidacloprid，IMI) 在杀虫活性、光稳定性、低毒性和广泛使用性等方面表现突出，1991年英国布莱顿作物保护会议上IMI作为杀虫剂被首次介绍，当年即投入商业化生产。IMI是新型氯化烟碱类杀虫剂中的第一个品种，也是代表品种。目前已成功开发出的剂型包括可湿性粉剂(WP)、微胶囊剂 (GG)、乳油(EC)、可溶性液剂(SL)、可溶性粉剂(SP)五大系列，共计70余个产品。目前，含 IMI的杀虫剂产品已在120余个国家的140余种农作物上获得登记，其应用范围涉及粮食、 经济、果树、茶叶和蔬菜等60余种作物，防治对象涉及同翅目、鞘翅目和鳞翅目等7个目50 多种害虫。IMI以昆虫烟碱型乙酰胆碱受体(nAchR)为分子靶标，IMI与该受体结合，会造成因IMI刺激引起的神经冲动电传导受阻，导致昆虫异常兴奋、痉挛、身体摇晃至衰竭死亡等中毒症状。研究发现IMI对环境生物，如蜜蜂、家蚕均有极高的胃毒和触杀毒性，且其代谢产物去硝基吡虫啉(Desniero-Lnidacloprid，DN-IMI)对蜜蜂也表现为高毒。目前因IMI 使用不当，造成的大面积蜜蜂、家蚕中毒事件时有发生。IMI对水生生物(如鱼、虾、蝌蚪、青蛙)、土壤有益生物(如蚯蚓)虽属中等毒性，但在一定剂量范围内均显示出一定程度的遗传毒性，且其水解产物和光解产物与IMI原药有类似的生态效应。此外，IMI除对一些天敌生物表现出直接毒性外，对一些天敌生物还具有明显的亚致死效应。不仅会使其产卵量减少、 寿命缩短，而且其功能性反应参数也会显著改变，即明显降低其对寄主的搜索能力。尤其值得注意的是，国外学者近年来报道了 IMI在高等动物体内有明显的慢性蓄积毒性、对人类的遗传毒性和潜在的影响学习和影响记忆的效应。目前关于IMI残留的检测方法主要是仪器方法，包括高效液相色普法(HPLC)、气相色谱质普联用法(GC-MS)和液相色谱质普联用法(LC-MS)等，这些方法虽然表现出检出灵敏度高和特异性强等优势，但残留样本需要经过繁琐费时的预处理程序(样品提取和净化)；同时这类检测方法需要大型的专门检测仪器设备、专门的实验室和高水平的专业技术人员操作，无法进行现场检测，时效性差，难以推广。残留物的生物技术检测方法主要是酶抑制法(EIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)0 EIA技术主要是利用农药对胆碱酯酶活性有抑制作用的原理，酶与底物反应后， 通过比色法测定酶抑制率，来判定农药残留是否超标。但EIA的应用有很大的局限性，存在着只能用来检测有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类农药、假阳性或假阴性检测结果出现的概率比较大、难以从多残留样本中检测单一农药、不能定性、只能粗略定量等技术问题。以竞争性酶联反应为检测原理的ELISA检测技术在以上几方面则有明显优势，反应结束后用酶标分析仪测相应的OD值，OD值越低表示被检样本中的残留样品含量越高，且节省时间、费用低，定性和定量同时进行，基于单克隆抗体的ELISA几乎不会出现假阳性或假阴性现象。但由于ELISA是一种灵敏度很高的检测方法，不同的操作者往往会出现不同的检测结果，所以该方法常常造成人为的误检和漏检。因此，基于ELISA原理物化出来的标准化、程序化检测产品的研制开发就显得尤为必要。目前IMI残留免疫学检测试剂盒的开发在国内尚属空白，急待研究解决。
发明内容
本发明的目的研制并开发出特异性强、灵敏度高、操作便捷、经济实用的农产品中微量IMI残留快速检测试剂盒。本发明的技术方案是
本发明含有吡虫啉包被抗原AET-IMI-0VA包被并封闭好的96孔酶标反应板，用于研磨植物组织的石英砂，工作浓度的抗吡虫啉单克隆抗体，工作浓度的酶标记二抗GaMIgG-HRP， 底物缓冲液，反应终止液，洗涤缓冲液，工作浓度的阴性血清和用于制作标准曲线的系列浓度的吡虫啉标准溶液，其中酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠RaMIgG-HRP ； 偶联IMI人工半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA，或匙孔血蓝蛋白 KLH。本发明的有益效果是
1.特异性强，灵敏度高。本发明试剂盒以强特异性和高亲和力的IMI-mAb为基础制备而成，具有较强的特异性和较高的灵敏度，其在8. 30 ΧΙΟ"6 mg/mL^5. 32X10_4 mg/mL的 IMI浓度范围内与对应的抑制率线性关系良好(R2=O. 997)，采用简易样本前处理程序，获得的残留检测样本中IMI的添加回收率均大于75.0% (CV < 10.0%)，方法的最低检测限为 8. OOXlO-6 mg/mL，且与结构类似的常用氯化烟碱杀虫剂无交叉反应(CR < 0. 05%)。本发明在保障农产品质量安全，保护消费者健康方面具有极其重要的意义。2.简便、快速。使用本发明试剂盒，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。只要将残留样本经过方法所述的简单预处理，在30分钟内即可判定检测结果。3.结果显示形象、直观、准确。本发明试剂盒以显色反应为定性和定量标准，通过与标准比色卡比对，根据显色反应作为检测结果阳性和阴性标记，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。4.节省费用。使用该试剂盒，无需另配仪器设备和其它试剂，可能随时随地进行检测，费用低廉，节省大量贵重仪器及设备费用。5.适用范围广，便于推广应用。该试剂盒操作简便，能满足不同层次人员需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、农产品加工、以及消费者个人等，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。具体实施例方式要制成快速检测微量IMI的检测试剂盒，首先要把IMI与载体蛋白有效偶联，通过按既的免疫程序免疫试验动物产生多克隆抗体，然后采用细胞融合技术制备其杂交瘤细胞，从而筛选和制备IMI-mAb，其次需制备小鼠IgG抗体，最后通过建立间接竞争ELISA模式，即可用于样品检测。1. IMI与载体蛋白偶联
首先以IMI原药和β -巯基丙酸为起始原料，在热碱作用下通过亲核取代反应，合成出 IMI人工半抗原，再采用碳二亚胺法(EDC)将IMI与载体蛋白进行偶联制备人工结合抗原。第一步缩合反应引入羧基，用40 mL DMSO在反应烧瓶中溶解9 g原药(经过重结晶提纯)，加入4 g Κ0Η。搅拌下将4 mL β-巯基丙酸缓慢滴加至反应烧瓶，于100 °C油浴下反应2 h，撤去油浴待产物自然冷却至室温后，用100 mL CH3CI2提取此混合液；然后用6 moL/L HCl调节萃取液pH为3，再加入100 mL乙酸乙酯萃取，最后减压浓缩、干燥得淡黄色固体，即为IMI人工半抗原。第二步利用碳二亚胺(EDC)作缩合剂，采用碳二亚胺法将IMI人工半抗原分子中的羧基与载体蛋白(BSA/0VA)分子中的氨基以酰胺键偶连，合成IMI免疫抗原和包被抗原。 将14. 7 mg/mL的IMI半抗原与20 mg/mL BSA的PBS溶液混合，室温下低速震荡过夜，再以 3000 rpm离心5 min，弃沉淀后先在上清液中加入2 mL NHS作保护剂，然后逐滴加入5 mg/ mL EDC水溶液，继续振荡5 h，再以3000 rpm离心5 min，上清液用PBS连续透析3 d，其间每隔8 h更换一次透析液，透析完毕后分装，即得免疫抗原(IMI-BSA)。再将BSA换为0VA， 采用与IMI-BSA合成相同的步骤合成包被抗原(IMI-0VA),供ELISA检测包被酶标板之用， IMI-BSA和IMI-OVA经真空冷冻干燥后，于一 20°C保存，备用。2.抗IMI单克隆抗体(IMI-mAb)的制备
单抗制备以80 μδ/只的IMI-BSA偶联物免疫8周龄BALB/c小鼠5次，每次免疫间隔时间3周，最后一次超强免疫后3天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；拉颈致死， 用75%酒精浸泡小鼠10 min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000 rpm离心10 min，收集脾细胞。将1 X IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10 1的比例混合，1000 rpm离心10 min弃上清，细胞沉淀物于37 °〇水浴中缓缓加入1. 0 mL 50%的PEG-4000作用1 min，然后缓缓加入无血清1640培养基15 mL,以终止PEG的作用，37 °C下水浴10 min, 1000 rpm离心10 min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔(150 μ 7孔)，置于37 °C 5%的CO2培养箱中培养。培养 10 14 d，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞染色体数目为96 102条，平均98. 6条，其分泌的单克隆抗体可特异地与IMI反应，亲和力常数达到101° 1012，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG^ IgG2a, IgG2b，针对IMI特异抗原决定簇的单克隆抗体。3.山羊抗小鼠IgG抗体的制备
以饱和硫酸铵提取IMI-BSA阴性小鼠血清IgG，即取1份小鼠血清加2份PBS(pH=7. 2) 混勻，加等体积饱和硫酸铵溶液混勻，置4°C冰箱12 h，4 3000 rpm离心15 min，弃上清， 再以适量PBS (pH=7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4 °C条件下2 h， 4 °C >3000 rpm离心15 min，弃上清，以适量PBS (pH=7. 2)溶解沉淀，置4 ！条件下用PBS(pH=7.2)透析48 h，中间换液8次，4 °C >12000 rpm离心15 min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以80 Pg/kg体重的小鼠血清IgG经皮下和肌肉注射健康山羊5次， 末次注射10天后，以ELISA测定其血清效价达到1 :2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗小鼠IgG抗体，用于IMI快速检测试剂盒装配。4.本试剂盒检测反应原理
当待测样品溶液加入经包被且经封闭的聚苯乙烯酶标反应板之后，待测溶液与包被抗原(IMI-OVA)竞争性地与IMI-mAb结合，当达到反应平衡后，加入工作浓度的酶标记抗抗体 (GaMIgG-HRP)，反应25 min后，再加入酶反应的底物溶液，通过显色反应的深浅程度判定残留样品中待测抗原的含量是否超标。5.待测样品溶液的制备及检测操作步骤测试器具为8X 12孔聚苯乙烯酶标反应板。 检测试剂盒包含用于比色的标准比色卡。检测样品制备检测多汁液的蔬菜、水果等农产品样品，可用检测试剂盒配置的石英砂将待检样本粗研，加入提取液稀释制成1 :2 1 :10的待测样品悬液；检测干燥类谷物等农产品，需要用检测试剂盒配置的石英砂将待检样本细研，再加入提取液稀释制成1 2 1 10的待测样品悬液。操作方法将待检样品液加入包被好的聚苯乙烯酶标反应板，反应15 min后洗板，再加入工作浓度的RaMIgG-HRP，反应25 min后洗板，然后在酶标反应板中加入酶底物缓冲液，显然以反应10 min后，与标准比色卡比对，判定检测结果。结果判定(a)阳性——如果显色程度低于标准比色卡上的对应值，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有超标量的IMI ;(b)阴性——如果显色程度高于标准比色卡上的对应值，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中所含IMI不超标或不含有该待检农药。以下表格为本试剂盒基本配置。
权利要求
1.一种快速检测痕量吡虫啉残留的试剂盒，其特征是含有吡虫啉包被抗原 AET-IMI-0VA包被并封闭好的96孔酶标反应板，用于研磨植物组织的石英砂，工作浓度的抗吡虫啉单克隆抗体，工作浓度的酶标记二抗GaMIgG-HRP，底物缓冲液，反应终止液，洗涤缓冲液，工作浓度的阴性血清和用于制作标准曲线的系列浓度的吡虫啉标准溶液，其中酶标记二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠RaMIgG-HRP ；偶联IMI人工半抗原的载体蛋白溶液为IMI人工半抗原与载体蛋白偶联的复合物溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是偶联IMI人工半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA，或匙孔血蓝蛋白KLH。
全文摘要
本发明涉及一种农产品中微量吡虫啉残留的酶联免疫检测试剂盒。它含有包被纯化的抗吡虫啉单克隆抗体、过氧化物酶标记的RaMIgG-HRP、酶反应的底物溶液、反应终止液和残留样本预处理材料等。该试剂盒在8.30×10-6mg/mL~5.32×10-4mg/mL的吡虫啉浓度范围内与对应的抗体抑制率线性关系良好，采用简易样本前处理程序，获得的残留检测样本中吡虫啉的添加回收率平均大于87.0%(CV＜10.0%)，方法的最低检测限为8.00×10-6mg/mL，且与结构类似的常用氯化烟碱杀虫剂无交叉反应。该试剂盒为农产品中的残留吡虫啉研究提供了有效的检测手段。抗吡虫啉抗体为单克隆抗体，偶联吡虫啉的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA或鸡卵清白蛋白OVA或匙孔血蓝蛋白KLH。本发明的试剂盒具有特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，易于推广应用。
文档编号G01N33/558GK102507930SQ201110347619
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者张海棠, 王自良, 石洪波 申请人:石洪波