专利名称：一种利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用浮萍评价重金属生物毒性的方法。
背景技术：
浮萍(Lemna minor Lirm)是一种高等水生维管束植物，早在20世纪50年代，国外的毒理学家就提出应用浮萍进行毒理试验以监测水环境质量，并建立了标准试验方法。欧洲标准(BS EN ISO 20079:2006)介绍了以浮萍叶片数的变化作为监测指标，试验过程中每天记录生长指标叶片数，通过叶片数计算生长速率抑制率从而得出EC50( R=(InXt2-InXtl) /T2-T1, Xtn代表Tn天时所测指标值，R代表生长速度，Ir= (Rc-Rt)/RcX 100% (Ir生长抑制率，Rc对照组生长率，Rt处理组生长率)，以受试水样的浓度对数对抑制率作图，求出 EC50)。欧洲标准介绍的方法试验周期为7天，相对来说试验周期较长。试验设的对照培养有两种选择采用蒸馏水和营养液。对于用蒸馏水作对照，由于试验周期较长且浮萍生长需要营养，因此对照组的日生长速率值偏低，而且表现不一致，同时会出现营养缺乏导致的叶片发黄现象等，在此情况下，对照组浮萍不能正常生长因此影响了对照试验的准确性；选用营养液作为对照时，为了保证各处理的一致性，各处理组相应的也要添加等量的营养液， 营养液的添加可能会破坏受试水样的组分，营养成分的存在也可能影响毒性测试结果的准确性，使EC50值受到影响。浮萍通常情况下是以出芽生殖为主，这种生殖方式类似于酵母的出芽生殖。正常生长状态下浮萍的叶状体通常含有2飞片叶子(frond)。当浮萍受到逆境胁迫或营养胁迫时是不能够完成出芽生殖的。在逆境胁迫下不仅浮萍的出芽生殖受到影响，叶状体也会受到影响，表现之一是叶状体分离，形成单叶，形成的单叶不能够增殖。发明人在研究过程中通过观察发现叶状体的分离对不同重金属污染表现敏感，并经过试验发现在铜、铁、锌、铬这四种重金属的处理下，短时间内，浮萍便表现出了叶状体分离现象。通过观测浮萍叶状体分离速度，来判断污水毒性的强弱。此方法旨在调整试验周期，可将试验周期缩短为约 1天，解决长周期试验所带来的对照组的结果不确定问题，建立运用浮萍快速监测污水的方法，使得污水的生物监测更简便、快速和准确。
发明内容
本发明的目的是通过寻找一种新的试验方法和指标，简化试验过程，建立一种比现有方法更快速便捷的试验方法，即提供一种利用浮萍叶状体分离对重金属进行生物毒性评价的方法。本发明运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过培养过程中叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价。本发明具体试验操作如下
3a.挑选浮萍并将其根剪成lmnT2mm后于受试水样中培养；
b.240C 25°C连续光照条件下培养，光照条件为85 ;35ιιΕ/πι2/ν、40(Γ700ηπι ；
c.试验过程记录记录首次出现叶状体分离的时间及单叶片数，随后间隔时间记录每株浮萍的单叶片数；
d.毒性评价根据步骤C所记录的单叶片数评价受试水样的毒性，若出现单叶片，即说明水样受到污染，叶状体分离现象越迅速，则水样受污染程度越严重。优选地，步骤a中挑选的浮萍每株含有两个或三个叶状体，一共挑选10株 15株； 步骤b中培养时间为1天，步骤c中记录时间为15min、30min、lh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、 24h ；步骤b中光照温度为。更优选地，步骤c每次记录浮萍的形态变化，包括根分离、叶片发黄情况，以进一步判断水样毒性。采用本方法检测水样毒性时，浮萍对Fe、Cu、Cr的毒性反应在20min时就能观察至IJ，而Si的反应时间为4小时。且对Cu的检测尤为灵敏，在0. 00064mmol/L的Cu存在下就可观察到毒性效应，此时培养时间为池。本方法的优点在于浮萍对某些重金属(铜、铁等)毒性反应敏感，反应时间较短，从而缩短试验的时间，节约成本，简化操作。由于浮萍叶状体对重金属具有如此敏感的生理生态反应，且观测直接，可以作为水生生物监测污水毒理效应系统的有效补充方法。本发明主要在于监测技术和指标上的创新，浮萍的这种对于含有重金属的污水特定的毒理反应弥补了传统监测指标(叶片数)的缺陷。本发明的优点还在于叶片分离是浮萍对重金属离子毒性的生理反应，该反应直观迅速，不用通过试验手段测量，在试验观察上不存在系统误差，以此来表征污水毒性具有参考价值，反应了污水的急性毒性。急性毒性是指机体(人或试验动物)一次(或M小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。急性毒性试验也可为慢性毒性试验设计提供参考，如污水浓度系列的配置从而达到优化慢性毒性试验的目的。本发明还有以下有益效果
1、以叶片分离数为试验指标无需复杂的试验步骤和试验仪器，节约试验成本；
2、减少人为主观因素，使客观性增强，减少试验的系统误差；
3、此观测指标对重金属反应敏感，并且反应稳定；
4、试验周期约为一天，大大缩短了现有方法的试验周期，缩减时间成本；
5、摒除了现有方法存在对照可能影响试验结果的准确性，因此提高了试验阴性对照的可靠性。
图1为CuSO4处理下叶片分离情况； 图2为FeSO4处理下叶片分离情况；
图3为SiSO4处理下叶片分离情况； 图4为K2Cr2O7处理下叶片分离情况。
具体实施方式
试验材料浮萍(Lemna minor Lirm)、培养皿、培养箱、含重金属污水样品；时间 2010. 6 2010. 12 ；温度25°C。试验过程
1.C存培养(stock culture)
将浮萍接种于 STEINBERG medium 中 25°C连续光照(85 135uE/m2/s乂40(T700nm))条件下培养以用于水质检测，STEINBERG medium配方如下 STEINBERG medium 配方(pH 5. 3 5. 7)
权利要求
1.一种利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过培养过程中叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价。
2.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于具体试验操作如下a.挑选浮萍并将其根剪成lmnT2mm后于受试水样中培养；b.240C 25°C连续光照条件下培养，光照条件为85 ;35ιιΕ/πι2/ν、40(Γ700ηπι ；c.试验过程记录记录首次出现叶状体分离的时间及单叶片数，随后间隔时间记录每株浮萍的单叶片数；d.毒性评价根据步骤C所记录的单叶片数评价受试水样的毒性，若出现单叶片，即说明水样受到污染，叶状体分离现象越迅速，则水样受污染程度越严重。
3.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤 a中挑选的浮萍每株含有两个或三个叶状体，一共挑选10株 15株。
4.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤 b中培养时间为1天，步骤c中记录时间为15min、30min、lh、ai、4h、Mi、8h、10h、12h、Mh。
5.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤 b中光照温度为M°C。
6.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤 c每次记录浮萍的形态变化，包括根分离、叶片发黄情况，以进一步判断水样毒性。
7.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于所述重金属为Fe、Cu、Zn、Cr。
8.如权利要求7所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于所述重金属为Cu，最低检出限为0. 00064mmoml/L。
9.如权利要求8所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于当培养池或以后才出现叶状体分离时，可判断受试水样的Cu浓度小于或等于最低检出限。
10.如权利要求7所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于浮萍对Fe、Cu、Cr的毒性反应在20min时就能观察到，而Si的反应时间为4小时。
全文摘要
本发明公开了一种利用浮萍叶状体分离对重金属进行生物毒性评价的方法。运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价。本方法的优点在于浮萍对某些重金属(铜、铁等)毒性反应敏感，反应时间较短，从而缩短试验的时间，节约成本，简化操作。由于浮萍叶状体对重金属具有如此敏感的生理生态反应，且观测直接，可以作为水生生物监测污水毒理效应系统的有效补充方法。
文档编号G01N33/18GK102507889SQ20111034918
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者丁芝海, 辛国荣, 郑政伟, 郭旭英 申请人:中山大学