专利名称：一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及检测试剂盒的制作方法
一种标记3, 3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及检测试剂合 Sl技术领域
一种标记3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的方法及检测试剂盒，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域，用于对妊娠妇女血清中3，3’ -T2S含量的检测。
背景技术：
先天性甲状腺功能减低症，简称先天性甲减，是由于胚胎期和出生前在某些病因的作用下引起的甲状腺轴的发生、发育和功能代谢出现异常，引起甲状腺功能减低，严重地影响到中枢神经系统和体格等的发育。
目前胎儿期的甲减筛查还是个世界性难题。对此，国内外一些学者对胎儿甲状腺功能的检测做了不少研究。
已有大量实验显示3，3'-T2S与胎儿甲状腺激素代谢有密切关系，3，3'-T2S是胎儿甲状腺激素的代谢物，经胎盘溢出到母体一侧，造成母体血中其浓度升高，因此，孕妇血清和尿中的3，3’ -T2S浓度可以反映胎儿甲状腺激素的水平，间接反映胎儿甲状腺功能状态。 目前3，3’ -T2S WRIA检测方法十分繁琐、复杂和耗时，RIA进行标记时标记物为1251，由于标记时会形成的T2S、T3S与T4S,因此分离纯化的过程繁琐及复杂，且放射性碘的半衰期较短，标记物放置后因衰变使放射性降低，因而需要经常制备标记物，另外放射性核素对环境保护及工作人员健康都带来不利影响；RIA操作时，整个检测的反应时间达48小时，而且方法很难自动化，等等，这些限制了 3，3’-T2S检测的应用，从而限制了其在胎儿和新生儿甲状腺功能筛查中的价值。
光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680 nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200 nm)。如果发光微粒在200 nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520nm - 620nm)。相反，如果在200 nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA 均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。发明内容
本发明的目的在于提供一种标记3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的方法及检测试剂盒，用于对妊娠妇女血清中3，3’ -T2S含量的检测。
本发明的技术方案发光微粒标记3，3’-T2S的方法在离心管中加入Img发光微粒，加入12. 5 μ 质量浓度 1% Tween-20,0. 05 mg 3，3，-T2S, ΙΟμ 的 25mg/mL 硼氢化氰钠溶液，用 ρΗ6· 0、0· IM 的 2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到20(^L，37°C避光振荡反应48小时，加入ΙΟμ ρΗ 5. 0、0. 3Μ的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时，离心纯化， 洗去未反应的试剂后，分离得到包被有3，3’ -T2S抗原的发光微粒，即为用发光微粒标记的 3，3’ -T2S，稀释后备用。
一种3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的检测试剂盒，由白色不透明微孔板1，3，3’ -T2S标准品2，包被有3，3’ -T2S的发光微粒3，兔抗3，3’ -T2S抗体冻干品4，生物素化羊抗兔抗体冻干品5，和包被有链霉亲和素的感光微粒6组成。
3，3，-T2S 标准品 2 的配制3, 3，-T2S 标准品浓度分别为0 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/mL，1000 pg/mL, 5000 pg/mL，从 3，3，_T2S 纯品中稀释得到，稀释液为 30% 乙醇溶液。
用所述的检测试剂盒检测3，3’ -T2S的方法，取包被有3，3’ -T2S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3，3’ -T2S标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗3，3’ -T2S抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着在避光处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的 3，3 —T2S q 早.ο
所述的检测3，3’ -T2S的方法，操作为取20μ 包被有3，3'-T2S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3'-T2S 标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3'-T2S抗体；继续加入20μ 生物素化羊抗兔抗体，37°C孵育15分钟；避光处加175PL包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育15分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的 3，3 —T2S q 早.ο
本发明的有益效果该标记方法结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
图1 :3，3’ -T2S检测试剂盒组成示意图。1、白色不透明微孔板，2、3，3’ -T2S标准品，3、包被有3，3’ -T2S抗原的发光微粒，4、兔抗3，3’ -T2S抗体冻干品，5、生物素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被有链霉亲和素的感光微粒。
图2 3, 3，-T2S- LICLIA 反应示意图。
图 3 3, 3' -T2S- LICLIA 标准曲线图。
具体实施方式
实施例1 发光微粒标记到3，3’ -T2S并制备试剂盒及检测妊娠妇女血清样品将发光微粒标记到3，3’ -T2S 在离心管中加入Img发光微粒，加入12. 5μ 1% Tween-20,0. 05mg 3，3，-T2S, ΙΟμ 的 25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用0. 1M、ρΗ6· 0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到20(^L，37°C避光振荡反应48小时。加入ΙΟμ 0. 3 M ρΗ 5. 0的羧甲氧基胺半盐酸盐 (CMO)溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时后离心，洗去未反应的试剂后，分离得到，3’ -T2S抗原的发光微粒，稀释后备用。
妊娠妇女血清的制备取妊娠妇女血清加入2倍体积95%的乙醇，-20°C过夜后， 40C 3000r/min离心20min，取其上清备用。
试剂的配制标准 3，3，-T2S 试剂的配制标准 3，3，-T2S 0 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/ mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL，从3，3，-T2S纯品中稀释得到，稀释液为30%乙醇溶液。
试剂盒的组成(1)、白色不透明微孔板(12条X8孔，可以拆分为单孔)。
(2) ,6X3, 3，-T2S#准液，1. OmL/瓶，3，3，_T2S标准液浓度为0 pg/mL，10 pg/mL， 100 pg/mL,500 pg/mL,1000 pg/mL,5000 pg/mL。
(3) U X包被有3，3’ -T2S的发光微粒2mL。
(4)、1 X兔抗3，3’ -T2S抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。
(5)、1 X生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。 (6)、1X包被有链霉亲和素的感光微粒20mL。
测定时注意事项1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C )。
2、使用之后立即将所有试剂放回2_8°C。
3、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。
具体检测步骤如下取20μ 包被有3，3'-T2S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3'-T2S 标准或经处理后妊娠妇女血清到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3’_T2S抗体；继续加入20μ 生物素化羊抗兔抗体，37°C孵育15分钟；避光处加175PL包被有链霉亲和素的感光微粒， 37°C暗处孵育15分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的 3，3，-T2S含量。结果见表1，由标准曲线求得该例血样1所含3，3，-T2S浓度为796pg/mL, 血样2所含3，3，-T2S浓度为1851pg/mL。
表
权利要求
1.发光微粒标记3，3’-T2S的方法，3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物简称3，3’ -T2S, 其特征在于在离心管中加入Img发光微粒，加入12. 5μ 质量浓度1% Tween-20,0. 05mg 3，3，-T2S，和肌的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用ρΗ6. 0、0· IM的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到20(^L，37°C避光振荡反应48小时，加入ΙΟμ ρΗ 5. 0、0. 3Μ的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有3，3’ -T2S的发光微粒，即为用发光微粒标记的3，3’ -T2S,稀释后备用。
2.—种3，3’ -T2S的检测试剂盒，其特征在于应用了权利要求1所述方法制备的包被有3，3’ -T2S的发光微粒，该检测试剂盒由白色不透明微孔板(1)，3，3’ -T2S标准品(2)，包被有3，3’ -T2S的发光微粒(3)，兔抗3，3’ -T2S抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5 )，和包被有链霉亲和素的感光微粒(6 )组成。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于3，3’-T2S标准品(2)的配制 3，3，-T2S 标准品浓度分别为0 pg/mL, 10 pg/mL，100 pg/mL, 500 pg/mL，1000 pg/mL, 5000 pg/mL，从3，3’ -T2S纯品中稀释得到，稀释液为30%乙醇溶液。
4.一种用权利要求2所述的检测试剂盒检测3，3’ -T2S的方法，其特征在于取包被有 3，3’ -T2S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3，3’ -T2S标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗3，3’ -T2S抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着在避光处加入包被有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的3，3’ -T2S含量。
5.根据权利要求4所述的检测3，3’-T2S的方法，其特征在于操作为取20μ 包被有 3，3’ -T2S的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3’ -T2S标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3'-T2S抗体；继续加入20μ 生物素化羊抗兔抗体，37°C 孵育15分钟；避光处加175μ 包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育15分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的3，3’ -T2S含量。
全文摘要
一种标记3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物(3,3’-T2S)的方法及检测试剂盒，属于光激化学发光免疫分析技术领域。本发明首先采用3,3’-T2S与发光微粒偶联，将发光微粒标记到3,3’-T2S上。再由白色不透明微孔板，3,3’-T2S标准品，包被有3,3’-T2S的发光微粒，兔抗3,3’-T2S抗体冻干品，生物素化羊抗兔抗体冻干品和包被有链霉亲和素的感光微粒组成检测试剂盒。发光微粒上的3,3’-T2S与3,3’-T2S竞争连接到3,3’-T2S抗体，再与生物素化羊抗兔抗体及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，光信号强度与样品中3,3’-T2S浓度成反比，对照标准曲线测得样品中3,3’-T2S的含量。该3,3’-T2S检测试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
文档编号G01N33/532GK102507919SQ201110349709
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者俞惠新, 包建东, 吴兴镛, 周彬, 张珏, 张艺, 王柯, 黄飚 申请人:江苏省原子医学研究所