专利名称：一种高通量筛选药物的核磁共振方法
一种高通量筛选药物的核磁共振方法技术领域
本发明属于高通量药物筛选技术领域，更具体涉及一种高通量筛选药物的核磁共振方法，适用于与靶标生物大分子相互作用的潜在药物的高灵敏，高通量筛选。
背景技术：
一、分子间相互作用与药物筛选的关系
目前借助于靶标蛋白质等生物大分子来寻找新的药物是新药开发的潮流。由于很多的药物分子是通过与生物体内的大分子如蛋白质，RNA等结合起来来发挥作用的，因此， 利用具有重要生物功能的大分子作为靶标，寻找与靶标分子具有一定亲和力的特异性结合的药物就成为一种重要的药物筛选手段。
以标靶大分子为目标进行药物筛选是一种高通量药物筛选技术，它可以同时对多种可能的样品进行检测，灵敏快速的采集实验数据，并以计算机对获得的实验数据进行分析处理。高通量药物筛选是提高药物开发效率的重要途径，筛选中常用的分析检测技术有， 光学分析、色谱分析、热分析、电化学分析、质谱、核磁共振等分析检测技术。其中基于核磁共振的分析检测技术具有非常重要的特点，如可直接获取作用位点和结合常数等信息，并提供潜在药物分子的结构和构象信息等，以便于设计新的药物分子，因此核磁共振技术在药物筛选中得到了越来越广泛的应用。
二、基于核磁共振的药物筛选技术
NMR技术是一种快速、高效的药物筛选工具，在研究蛋白质-配基相互作用方面具有特殊优势，可以快速准确在原子和分子水平上获取靶标分子和药物之间的相互作用强弱和位点信息，并指导以结构解析为基础的药物设计。
目前应用于药物筛选的核磁共振方法按照观测目标的不同主要分为两大类1、以生物大分子为观测目标的药物筛选技术；2、以小分子配体为观测目标的药物筛选技术。
通过观测靶标大分子来进行药物筛选的技术有SAR-By NMR (SAR Structure-Activity Relationships)技术，NMR-SOLVE(Structurally Oriented Library Valency Engineering)技术等，主要是通过解析生物大分子结构和获取作用位点信息，然后根据可能的作用机制，设计新的药物。而以小分子为观测目标的NMR药物筛选技术通常可以对多种潜在的药物小分子进行分析，实现结合态药物小分子物质的选择性检测，并同时实现药物分子的识别，结构和构象等信息的获取，因此是目前使用广泛的高通量药物筛选技术之一。
三、基于核磁共振的药物高通量筛选技术
以配体小分子信号为观测目标的NMR药物筛选技术主要依靠激发生物大分子信号，然后通过交换或者极化转移等效应，以检测结合的配体分子。常用的技术有转移 NOE(trNOE Transfer NuclearOverhauser Effect)，NOE 泵(NOE(Nuclear Overhauser Effect) pumping)或者反向 NOE 泵(Reverse NOE pumping)，饱和转移差谱(STD Saturation Transfer Difference)，水记录谱(waterLOGSY :Water_Ligand Observed viaGradientSpectroscopY)等。其中转移NOE和NOE泵技术主要都是通过观测小分子和大分子之间的转移NOE效应(大分子有无信号传递到小分子)来判断小分子是否结合到大分子上。但是这两种技术所检测到的谱线通常包涵有一定的非结合的其它小分子信号，因此分析较为困难。饱和转移差谱和水记录谱技术主要通过选择性脉冲实现大分子的选择性检测，然后通过交换，或者转移NOE效应实现结合态小分子的选择性检测，非结合小分子信号无法检测或者符号和结合态分子相反，因此谱线简单，重叠较少，易于分析，在高通量药物筛选中有一定的优势，应用广泛。
|艮 t “Characterization of Iigand binding by saturationtransfer difference NMR spectroscopy，，[Mayer M，Meyer B.，Angew. Chem. Int. Edit.，38， 1784-1788. (1999) ”，饱和转移差谱实验通过选择性饱和大分子的部分质子信号，饱和的这部分磁化通过蛋白内部1H-^之间的自旋扩散传递到整个蛋白，使得蛋白质整个质子的磁化得到饱和，蛋白质子的磁化饱和效应同时影响了结合在其上的小分子配体，由于结合态配体与游离态配体之间的存在着化学交换，游离态配体的磁化也被部分饱和。和没有饱和的参照实验结果(所有信号均没有变化)进行比较，所得到差谱的就仅是由于饱和效应信号发生了变化的小分子配体的信号。
f艮据文献“Identification of compounds with binding affinity toproteins via magnetization transfer from bulk water" Dalvit C. . Pevarello P. , Tato, Μ., Veronesi M. ， Vulpetti A. and Sundstrom M. ， J. Biomol. NMR, 18,65-68 (2000)，，，7^^ 谱(waterLOGSY)技术主要是通过选择性激发生物样品的溶剂-水的信号来获取结合态小分子(潜在药物)的信息水的磁化可通过交换或者极化转移传递到生物大分子的N H上， 进而通过自旋扩散效应传递到整个大分子各个质子上，大分子的磁化再通过转移NOE等效应传递到与之结合的配体分子上。因而能够选择性检测结合于靶标大分子上的潜在药物分子。
以上两种方法，具有所需蛋白量少，无需同位素标记，适用于特大分子量的目标靶体的配体选择，以及同时针对多种小分子物质进行筛选等优点而被广泛采用。特别是 waterLOGSY技术，由于溶剂水的磁化远远大于溶质分子的，如溶质分子的质子浓度通常为 mM或以下，而溶剂水的质子浓度可达110M，由于waterLOGSY是通过极化转移将溶剂水的信号传递给溶质，因此该技术的检测灵敏度非常高，可检测到μ M浓度的靶标蛋白质可能结合的配体分子信息。
总而言之，在以上所介绍的基于NMR的药物高通量筛选实验中，无论何种实验，均需要采用选择性激发或者检测技术来获取结合态配体分子的信息。如NOE泵实验需要结合扩散加权技术以在极化转移之前消除游离小分子的信号；STD和waterLOGSY需要采用选择性脉冲来实现大分子或者溶剂水分子的选择性激发。由于扩散加权等技术主要依靠的是分子大小的差别所引发信号的信号衰减速率的不同来进行谱编辑，因此其选择效果通常与起始浓度以及分子量大小存在一定的相关(分子量越大，通常体积越大)，因此NOE泵实验的选择性通常较差，谱线简化不彻底。而在基于选择性脉冲的STD或者waterLOGSY实验中，选择性脉冲的设置非常重要，如STD等需要根据谱线的具体位置设置选择性脉冲的形状，激发频率，激发带宽，以及相应的功率等。由于选择性脉冲的功率以及时间设置较为复杂，因此在具体实验过程中，操作者需要针对具体样品的特点来设置实验，调整和优化实验参数，特别是需要调整选择性脉冲的频率和激发宽度，以避免由于选择性较差造成其他信号的不必要激发，实现选择性检测。不当的选择性操作往往引发错误的实验结果。因此此类选择性实验往往操作复杂，具有较高的技巧性，在提供给企业用户使用的时候有着比较大的困难。发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量筛选药物的核磁共振方法，方法易行，实验设置操作简便，实验检测的准确性和灵敏度高，所需生物大分子量少，灵活性强，能够同时完成对多种潜在配体药物的筛选，因此该方法有效的提高了药物筛选的准确性和效率，大幅降低了筛选成本，为高通量药物筛选注入新的活力。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
一种高通量筛选药物的核磁共振方法，其步骤是
(a)配置靶标生物大分子和待筛选的多种(10-50)药物或配体分子的混合水溶液。靶标生物大分子为可溶于水的蛋白质，DNA或RNA等分子，其浓度为μπι以上。由于NMR 检测的主要是待筛选分子的信号，所以带筛选分子的浓度保持较高为好，建议浓度为mM范围。配置时将靶标生物大分子和待筛选分子先后加入水溶液中混合均勻。为了保持生物分子活性，溶液中需加入适当的盐(mM浓度)以保持一定的ρΗ(0或2或4或7或9或11或 12或14)，离子浓度等，使生物分子结构稳定。
(b)将该混合溶液装入NMR样品管，放入谱仪中，采用本发明所述的配体药物分子选择性检测的核磁共振技术，选择性检测与靶标蛋白质结合的配体分子的信号。
(c)完成配体分子的确认。
本发明所述的配体药物分子选择性检测的核磁共振技术主要包括以下操作
(1)通过辐射阻尼效应建立溶剂水的选择性扰动。
(2)通过交换和极化转移等效应(文献 Measurement ofchemical exchange rate constant with solvent protons usingradiation damping,Jin—hon Chen, Xi-an Mao,J Magn Reson，1998，131 :358-361)，逐步建立溶剂水和靶标生物分子及其配体之间的信号传递。主要信号传递过程概括如下水信号通过与生物分子NH基团的交换和NOE等效应传递到生物大分子上，进而在通过NOE等效应转移到结合于其上的配体分子，使结合的配体分子NMR信号与生物大分子和水发生了一致强度变化。
(3)将所建立的信号进行激发，就可选择性检测蛋白质及其配体分子。
本发明所提供的核磁共振技术的脉冲序列主要由两个基本脉冲模块单元构成 (图 1)
(a)信号建立模块D1为每次扫描完成后的恢复时间，为3-5倍的水质子的纵向弛豫时间，一般为2-10秒。随后的π脉冲主要是用于产生水的辐射阻尼效应，其后不同延迟时间所施加的脉冲梯度场单元主要用于调控辐射阻尼效应，大的脉冲梯度场能够使辐射阻尼效应迅速减小以致消失。因此作为辐射阻尼“开关”用于水的磁化矢量的选择性操作，即采用两种不同模式模式1中，η脉冲施加之后，立即施加脉冲梯度场。辐射阻尼效应被消除；模式2中，π脉冲施加，等待一定的时间，等待时间的大小为5ms-k，使辐射阻尼效应作用之后，再施加脉冲梯度场，由于辐射阻尼效应作用时间非常短，因此此模式中的脉冲梯度仅是为了保持实验的稳定对比而施加，辐射阻尼没有消除。模式1中水的辐射阻尼效应被脉冲梯度场消除，而模式2则由于脉冲梯度场时间较晚，水的辐射阻尼效应已经完全作用。因此模式1和2的区别就可行实现水磁化的选择性激发。此外Tmix为混合时间，通常为l_3s，主要是使水的磁化通过交换，转移NOE等效应传递到靶标蛋白质和与其结合的配体小分子上，以建立靶标蛋白质和其配体分子的选择性激发。
(b)检测模块主要是使用不同的方法对信号建立模块中通过辐射阻尼效应所建立的靶标蛋白质和其配体分子的信号进行检测。其方法可以灵活多样如对于最基础的一维谱观测，可直接使用η /2激发脉冲配合溶剂峰抑制技术实现检测，观测靶标蛋白质及结合态小分子。也可以在η/2激发脉冲后采用弛豫加权技术抑制大分子较宽的谱线，即通过施加一定时间(10-30ms)的自旋锁定脉冲，以实现大分子信号的抑制，因为大分子的弛豫时间较短，在自旋锁定时间会迅速衰减，使得谱线简化，小分子信号得以选择性检测。但是由于结合态的小分子配体信号的信号衰减也可能较为严重(强结合)，使得检测灵敏度降低。此外，也可以使用各种不同的多维核磁共振方法来实现检测，以方便配体分子的快速识别，以及结构确认等。如采用二维1H」H相关谱(COSY)或全相关谱(TOCSY)或异核单量子相关谱(HSQC)或异核多量子相关谱(HMQC)或NOE谱(NOESY)或ROE谱(ROESY)等均可方便的用于配体分子的检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
(1)灵敏度高该实验使用辐射阻尼效应来选择溶剂水信号，避免了弛豫和扩散等效应的影响，在800MHz磁共振谱仪上，该技术的灵敏度比目前所用的waterLOGSY技术高 10%。
(2)实验操作简单在该实验所有的操作以基本的普通“硬脉冲”为主，能够为本领域甚至是其他领域普通工作者所采用。
(3)容错率高脉冲的设置也无需精确校准，大大提升了实验的容错率和可操作性，更易为不同基础的各种专业和非专业用户所使用。
(4)效率高该实验具有高通量药物筛选一些基本特点，可同时对种小分子的混合体系进行同时筛选。
图1为一种可用于药物高通量筛选的辐射阻尼差谱技术的脉冲序列示意图。
其中D1为弛豫恢复时间，一般设为2秒以上；Δ为不同模式下脉冲梯度场施加时间之差，Tmix为极化转移时间，一般设定为1-3秒(与大分子和小分子之间的结合强度有关)，△ <极化转移时间Tmix ；g为脉冲梯度场(持续时间1ms)，其强度和持续时间可以调整，通常第一个用于调控辐射阻尼效应的脉冲梯度长强度要求较高，需要30G/cm或更高。 模式1和模式2为两组不同的采样模式，基本区别是两次脉冲梯度场的施加时间相差△，实验时，采用间隔采样的模式用2种不同模式分别采集信号，并对所得到的信号进行差减处理，即为辐射阻尼差谱信号。检测时可采用谱仪所提供的各种标准的脉冲序列进行，但是由于采样前需要进行溶剂峰水信号抑制，因此这些标准需要需要具有溶剂峰抑制效果，如在采样之前拥有“水门”或者“ fl ip-back”等溶剂抑制操作。
图2为一种测试样品的实验结果图。
测试样品为色氨酸的重水溶液(样品1)和0. ImM的人血清白蛋白，2mM葡萄糖和2mM色氨酸的混合样品水溶液(10%重水用于锁场)(样品幻。其中白蛋白仅结合色氨酸， 而不结合葡萄糖。图中a，b，c分别是样品1色氨酸溶液的常规一维谱，样品2混合溶液的辐射阻尼差谱和常规一维谱。图中显示，只有配体分子-色氨酸具有较强的信号强度，且信号的相位和白蛋白相同，而葡萄糖信号不仅较弱，且符号和白蛋白相反。表明辐射阻尼差谱技术具有很好的信号选择性，能够高灵敏的选择性检测配体分子。
图3为一种样品2混合溶液在脉冲设定不准确时的辐射阻尼差谱测试结果对比示意图。
从图中可以看出，脉冲差异并未影响实验的结果，仅是信号强度发生了较小的变化，表明辐射阻尼差谱具有较好的容错率。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步说明本技术的
具体实施例方式
实施例1
已知人体血清白蛋白(HSA)是一种重要的药物载体，在血清中大量存在，可将药物运输到靶器官后释放。因此本例将以白蛋白作为靶标生物分子，进行配体药物的筛选。
一种高通量筛选药物的核磁共振方法，其步骤是
1.配置待测样品样品为0. ImM白蛋白(HSA)，2mM色氨酸和2mM葡萄糖的混合水溶液，其中加入少量D2O用于锁场，D2O所占的体积比为5%-10% (D20/H20)。该样品的基本特征为白蛋白可结合色氨酸，不结合葡萄糖。
2.检测将样品转入直径为5mm的核磁样品管，并将样品管放入Bruker Avance 600核磁共振谱仪，控制实验温度为298K，等待10-15分钟，以便是样品内的温度达到平衡。 然后进行图1所示核磁共振实验检测，载入脉冲宽度等标准参数，设定谱宽为12ppm使其覆盖所有信号，扫描次数256，空扫次数32，扫描间隔时间为2. 5s，混合时间Tmix为1.如。由于所采用的间隔时间较短，为了消除扫描结束期间未回复信号对实验的影响，在每次采样之前可时间适当的修剪脉冲以消除这些可能的残存信号。修剪脉冲为2个相位相差90度的自旋锁定脉冲，依照先后次序依次分别为2ms和:3ms，功率无需准确校正，此处为4000Hz。 其余脉冲的时间按照测定均为14μ s。实验过程中，采样前的溶剂峰抑制主要是采用改进的 “水门"W5技术，详细描述见文献"The impact of pulse duration on compositeffATERGATE pulse, Wang, J. J. , Zhang, X. , Sun, P. , Jiang, X. W. , Jiang, B. , Cao, C. Y. , Liu, M. L. , J. Magn Reson,206,205-209(2010) ”。
3.结果分析将所采集的时域信号进行傅里叶变换得到NMR谱，调整谱的相位为纯吸收线形，与蛋白质信号相位一致的即为具有结合能力的配体分子。实验谱图见图2b。 为了对比分析，申请人采集了色氨酸水溶液和此混合溶液的常规一维谱，分别见图加和图 2c。从图2中可明显看到，混合样品的常规ID核磁共振谱中，两种小分子和大分子蛋白质的信号均为同相位，而在辐射阻尼差谱中，只有色氨酸和白蛋白的信号保持一致，且所有信号和单独的色氨酸样品的常规一维谱完全对应。而葡萄糖的信号(主要分布在化学位移 3-4ppm范围)则是呈反相位，且信号强度很弱。由于已知色氨酸和血清白蛋白结合，因此这一结果表明测申请人所设计的辐射阻尼差谱技术是有效可行的。
实施例2 以人血清白蛋白为例进行容错率分析。
1.配置待测样品操作如实施例1相同。
2.检测所用核磁共振实验操作如实施例1相同，为了分析实验的容错率，在准确测定了实验所需的90度脉冲之后，分别进行了两组筛选实验，其中一组采用了准确测定的脉冲作为参数，另外一组将脉冲宽度增加了 14%，进行了测定。
3.结果分析实验测定结果如附件图3所示，在具体实验中，当所有脉冲不准确度达到14%左右时，实验采集的谱图所包含的信息没有任何变化。仍然是结合的潜在药物分子色氨酸和白蛋白同相位，而葡萄糖呈现反向位。和准确校正了 90度脉冲的实验结果相比，该实验仅是信号的相对强度发生了减小。
权利要求
1.一种高通量筛选药物的核磁共振方法，其步骤是(a)配置靶标生物大分子和待筛选的10-50种药物或配体分子的混合水溶液，靶标生物大分子为可溶于水的蛋白质，DNA或RNA分子，其浓度为μ m,将靶标生物大分子和待筛选分子先后加入水溶液中混合均勻，溶液中加入盐以保持pHO-14，离子浓度，使生物分子结构稳定；(b)将该混合溶液装入NMR样品管，放入谱仪中，采用配体药物分子选择性检测的核磁共振技术，选择性检测与靶标蛋白质结合的配体分子的信号；(c)完成配体分子的确认所述的配体药物分子选择性检测，其步骤是(1)通过辐射阻尼效应建立溶剂水的选择性扰动；(2)通过交换和极化转移等效应，建立溶剂水和靶标生物分子及其配体之间的信号传递，信号传递过程如下水信号通过与生物分子NH基团的交换和NOE等效应传递到生物大分子上，通过NOE等效应转移到结合于其上的配体分子，使结合的配体分子NMR信号与生物大分子和水发生了一致强度变化；(3)将所建立的信号进行激发，选择性检测蛋白质及其配体分子。所述的配体药物分子选择性检测由两个基本脉冲模块单元构成(a)信号建立模块D1为每次扫描完成后的恢复时间，为3-5倍的水质子的纵向弛豫时间，随后的η脉冲是用于产生水的辐射阻尼效应，其后不同延迟时间所施加的脉冲梯度场单元用于调控辐射阻尼效应，大的脉冲梯度场能够使辐射阻尼效应减小以致消失，采用两种不同模式模式1中，η脉冲施加之后，施加脉冲梯度场，辐射阻尼效应被消除；模式 2中，π脉冲施加，等待时间的大小为5ms-k，使辐射阻尼效应作用之后，再施加脉冲梯度场，模式中的脉冲梯度为了保持实验的稳定对比施加，模式1中水的辐射阻尼效应被脉冲梯度场消除，模式2脉冲梯度场时间较晚，水的辐射阻尼效应已经完全作用，模式1和2的区别就实现水磁化的选择性激发，此外Tmix为混合时间，转移NOE等效应传递到靶标蛋白质和与其结合的配体小分子上，建立靶标蛋白质和其配体分子的选择性激发；(b)检测模块使用不同的方法对信号建立模块中所建立的磁化矢量通过辐射阻尼效应所建立的靶标蛋白质和其配体分子的信号进行检测，对于最基础的一维谱观测，直接使用η /2激发脉冲配合溶剂峰抑制技术实现检测，观测靶标蛋白质及结合态小分子，在 η /2激发脉冲后采用弛豫加权技术抑制大分子较宽的谱线，通过施加10-30ms的自旋锁定脉冲，实现大分子信号的抑制，小分子信号得以选择性检测。
2.根据权利要求1所述的一种高通量筛选药物的核磁共振方法，其特征在于所述的配体分子的识别，采用二维1H-1H相关谱或全相关谱或异核单量子相关谱或异核多量子相关谱或NOE谱或ROE谱用于配体分子的检测。
全文摘要
本发明公开了一种高通量筛选药物的核磁共振方法，步骤(a)配置靶标生物大分子和待筛选的药物混合水溶液，将靶标生物大分子和待筛选分子加入水溶液中混合均匀；(b)将混合溶液装入NMR样品管，放入谱仪中，选择性检测与靶标蛋白质结合的配体分子的信号(1)通过辐射阻尼效应建立溶剂水的选择性扰动；(2)通过交换和极化转移等效应；(3)将建立的信号进行激发，选择性检测蛋白质及其配体分子，该操作由两个脉冲模块单元构成信号建立模块和检测模块；(c)完成配体分子的确认。该方法操作简便易行，实验检测的准确性和灵敏度高，有效的提高了药物筛选的准确性和效率。
文档编号G01N24/08GK102507627SQ201110358670
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者刘买利, 孙鹏, 张许, 蒋滨 申请人:中国科学院武汉物理与数学研究所