专利名称：液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法技术领域
本发明属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。
技术背景
金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌， 可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌存在于自然界的空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此建立一种及时，快速，准确的检测金黄色葡萄球菌的方法显得尤为重要。发明内容
本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，用于检测金黄色葡萄球菌的方法， 以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。
本发明由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG ；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量；捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布；用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul的活化缓冲液，混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心 5min,小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm,孵育池，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4°C保存； 液相芯片检测金黄色葡萄球菌将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床 120rpm，lh，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床120rpm，lh,取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到IOOul，置于37°C摇床反应lh，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到IOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。
本发明液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。运用液相芯片技术检测金黄色葡萄球菌(step如A^occm aureus)的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，为食品安全做出贡献。
图1是本发明捕获抗体最佳工作浓度； 图2是本发明灵敏度检测结果；图3是本发明特异性的检测结果； 图4是本发明重复性检测结果；图5是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的点状图； 图6是本发明在进行检测时所显示微球位置以及数量的实时图的柱状图。
具体实施方式
本发明所采用的技术方案是通过金黄色葡萄球菌的特异抗体，与微球进行偶联后，制备出可以对金黄色葡萄球菌进行检测的液相芯片，在应用时，加入样品增菌液，使增菌液中的金黄色葡萄球菌被微球上的捕获抗体所捕获，检测抗体也与金黄色葡萄球菌结合后，再与生物素标记的抗抗体共同孵育，然后通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白反应，应用LuminexlOO检测系统实现对金黄色葡萄球菌的特异检测。
本发明涉及的检测金黄色葡萄球菌液相芯片主要由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)组成。所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌的单克隆抗体a mAb)，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体(份.a pAb)，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔 IgG(biotin-羊抗兔IgG)；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合。以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量。
上述的检测抗体是用于识别金黄色葡萄球菌的另一类抗体，其作用是将与液相芯片上捕获抗体结合的金黄色葡萄球菌与抗抗体结合，而抗抗体能与检测荧光偶联，间接将结合的金黄色葡萄球菌浓度与检测荧光的强度结合起来，从而实现对金黄色葡萄球菌的浓度进行定量测定。生物素标记的抗抗体通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白结合，最后通过LuminexlOO检测系统对金黄色葡萄球菌进行定性定量检测。
(1)捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布。用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS。然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min。取出后弃上清，加入NHS和EDC各10ul，再加入80ul 的活化缓冲液。混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心5min，小心移去上清。加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm,孵育池。取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1 % BSA的PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭。封闭后4°C保存。
(2)应用液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约;3min。取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的金黄色葡萄球菌IOul，用PBS-TBN补足体积到IOOul。置于37°C摇床 120rpm, Ih。取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次。加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到IOOul。置于37°C摇床120rpm，lh。取出后离心，弃上清，用PBS-TBN 洗两次。然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到IOOul。 置于37°C摇床反应lh。取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次。再加入SA-PE，用PBS-TBN 补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次。重悬于 IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。
1.捕获抗体最佳工作浓度的确定见图1，当单抗浓度为250ug/ml时，其MFI值达到最大，故单抗最佳的工作浓度为 250ug/mlo
2.偶联是否成功的检测
权利要求
1. 一种液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于由微球、捕获抗体、检测抗体、生物素标记的抗抗体、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述微球为羧基化的31号微球；所述捕获抗体是金黄色葡萄球菌单克隆抗体，所述检测抗体是金黄色葡萄球菌的多克隆抗体，生物素标记的抗抗体是经活化的生物素标记的羊抗兔IgG ；所述捕获抗体和检测抗体均能特异与金黄色葡萄球菌结合，以红色激光激发其球型基质上的红色分类荧光，以绿色激光激发与生物素标记的抗抗体相结合的藻红蛋白，测定球型基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球型基质上结合金黄色葡萄球菌的数量； 捕获抗体与微球偶联形成偶联体取微球原液室温恢复30min，用超声波清洗机进行超声lOmin，漩涡震荡30s，使微球均勻分布；用无菌水分别配制50mg/ml的EDC和NHS，然后取200ul的微球原液置于1. 5ml的离心管中，14000 rpm，离心5min，取出后弃上清，加入NHS和EDC各IOul，再加入80ul的活化缓冲液，混勻后，用铝箔纸包好，置于37°C摇床120 rpm，20min，然后14000 rpm，离心 5min,小心移去上清，加入500ul稀释至250ug/ml的捕获抗体，重悬混勻，置于37°C摇床120 rpm,孵育池，取出后离心弃上清，用500ul的PBS进行洗涤，洗涤后加入500ul 1 % BSA的 PBS溶液，重悬微球，37°C水浴摇床孵育两个小时进行封闭，封闭后4°C保存； 液相芯片检测金黄色葡萄球菌将已偶联的微球混合液室温恢复lOmin，漩涡振荡器震荡约3min，取约5000个微球， 加入IO8 CFU/ml的金黄色葡萄球菌10ul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床 120rpm，lh，取出后离心弃上清，用200ul PBS-TBN洗两次，加入已稀释的检测抗体IOul，用 PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床120rpm，lh，取出后离心，弃上清，用PBS-TBN洗两次，然后加入已稀释的生物素标记的羊抗兔IgG IOul，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应lh，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗两次，再加入SA-PE，用PBS-TBN补足体积到lOOul，置于37°C摇床反应，取出后离心弃上清，用PBS-TBN洗涤两次，重悬于IOOul PBS-TBN中，上机进行检测。
全文摘要
一种液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法，属于免疫技术及食品卫生检测技术领域。本发明的目的是提供一种运用液相芯片技术，提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。本发明制备了液相芯片，然后应用液相芯片检测金黄色葡萄球菌。本发明液相芯片是集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术，其最大的特点是高通量，灵活性好，灵敏度高。运用液相芯片技术检测金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的方法，以便实现对金黄色葡萄球菌的快速检测，为食品安全做出贡献。
文档编号G01N33/577GK102507949SQ20111036055
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者刘金华, 宋战昀, 王亚丽, 王振国, 罗雁非, 蔡阳 申请人:吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心