专利名称：粘红酵母乙酰辅酶a羧化酶基因及其克隆、功能验证方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因，本发明还涉及该基因编码的蛋白质、该基因的克隆方法和功能验证方法以及该基因在转基因油料作物中的应用。
背景技术：
乙酰辅酶A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC) (EC 6. 4. I. 2)是催化脂肪酸合成代谢第一步反应的限速酶，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰单酰辅酶A，是生物素依赖性酶。该酶存在于大多数生物组织中，包括细菌、古菌、真菌、酵母、植物、动物和人类。可分为4大类。乙酰辅酶A羧化酶第一大类为多亚基型ACC，即异质型，存在于细菌、双子叶植物和非禾本科单子叶植物的质体中。Escherichia coli的ACC是第一类中的典型代表，由四个亚基组成，即生物素羧化酶(biotin carboxylase, BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)以及羧基转移酶(carboxyltransferase, CT)的 2 个亚基α-CT和β-CT。这些亚基结合在一起形成ACC全酶，可能以(BC)2(BCCP)4(CTa，(Τβ)2 形式存在。第二大类ACC为多功能型ACC，即同质型，人类和大多数真核生物的ACC属于这一类。此类ACC单体的分子质量在200kD以上，BC、BCCP、CT功能域依次存在于一条多肽链上。ACC在植物中的分类与定位存在两种特殊情况，如油菜的叶绿体中同时含有第一类和第二类ACC，而禾本科植物的质体和胞质中ACC均属于第二类。此外,在天蓝色链霉菌和谷氨酸棒杆菌中发现的ACC由a和β两个亚基组成，a亚基包含BC和BCCP两个功能域，β 亚基包含CT功能域，此为第三类ACC。第四类ACC从古细菌Metallosphaera sedula中发现，与异质型ACC不同之处为CT由一个亚基组成。近年来随着化学燃料的不断减少，利用生物组织合成生物能源的方法备受关注。由于很多油脂微生物产油量极高，人们广泛利用油脂微生物，如酵母、真菌等作为单细胞油脂加工厂(Chisti Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv, 2007, 25(3) :294-306)。已报道的产油微生物以酵母菌和霉菌类居多，其中薛飞燕等(2009， 工业生物技术在资源与能源领域应用发展研讨及成果交流会论文集)通过对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、纯顶螺旋藻(Spirulina platensi)、酿酒酵母 (Saccharomymyces cerevisiae)和粘红酵母(Rhodotorula glutinis)四种产油微生物的研究发现，粘红酵母的油脂组成与生物柴油原料油很相似，且生物量在四种微生物中为最高，如果可以进一步提高菌体油脂的含量，则可能达到生物柴油原料油大量生产的要求，所以利用其开辟一条生产生物柴油的新途径应该是可行的，有发展前景的。而且粘红酵母培养周期中油脂含量和油脂含率达到最优值所用的时间相同，这有利于培养条件的优化。同时随着基因工程的兴起，人们可以将油脂微生物中优良的ACC基因克隆到油菜、大豆等油料作物中，从而提高油料作物油脂的品质和含量(Davis MS, Solbiati J, Cronan JE. Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases therate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem,2000,275(37) 28593-28598)。现有的文献中想知道一个酶是否有功能有活性通常都是测定其酶活，乙酰辅酶A 羧化酶活性测定的方法主要有放射性同位素标记法、氧化偶联法和中间产物法。放射性同位素标记法基于如下反应
Mg2f/Accase、
Acetyl-CoA+H14C03-+ATP^14[C]Malonyl-CoA+ADP+Pi反应PH为8.0-8.5。活性测定反应结束后通过加酸、加热除去未反应的 [H14C03]-，终产物是对酸、对热稳定的14 [C]MalonyI-CoAJf 14 [C]Malonyl-CoA进行荧光标记，采用KC18F反相层析法进行检测，并通过测定14[C]Malonyl-CoA的含量对乙酰辅酶 A羧化酶活性进行评价。该方法最大的优点是检测周期短、检测灵敏度高，因此该方法是目前乙酰辅酶A羧化酶活性测定的主要方法，但放射性同位素标记法需要昂贵的标记试剂， 同时放射性对境造成的污染以及废液的处理也较为复杂，因此在使用时需要特殊的防护措施，为实验操作带来一定的困难。氧化偶联法和中间产物法的原理相似，均是借助反应终产物ADP和Pi与PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)偶联反应生成易检测的NAD+。此类检测方法检测周期短，试剂也较为便宜，但反应步骤过多、中间产物复杂、终产物量少，影响了其灵敏度。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因以及该基因编码的蛋白质。本发明的第二个目的是提供一种粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆方法。将一个空载体和一个含有外源基因功能域的重组质粒同时转入表达细胞里，如果该基因表达且重组菌株的脂肪酸含量提高了，则可证明该外源基因的表达产物有活性。鉴于粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因核苷酸序列较长，难以进行全长表达且不利于在植物转基因工程的应用，因此，本发明的第三个目的是根据粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶含有三个功能域，将这三个功能域进行分别表达和共表达，比较重组菌株的脂肪酸含量进而验证该基因的功能。本发明的第四个目的是提供粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因在转基因油料作物中的应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所
/Jn ο本发明的乙酰辅酶A羧化酶基因有两个内含子，分别位于42_147bp和315_677bp。 乙酰辅酶A羧化酶的BC功能域位于198-1722bp，BCCP功能域位于1888_2331bp，CT功能域位于4828_6456bp。所述基因来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis),将该基因命名为 RgACCase0所编码的蛋白质命名为RgACCase蛋白质。将其序列在NCBI上比对后发现，此序列未发表且没有进行功能注释。粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆方法，包括以下步骤(I)粘红酵母总DNA的提取；(2)利用两对简并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆到载体PMD18-T上，转化DH5 α感受态，获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的部分保守序列；(3)利用染色体步移法获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的未知序列；(4)通过对扩增序列的拼接获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的全长序列，所述的简并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R分别为QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGC ；WG-R ACVGAGAAGTAACCCCA ；IN-F ATYGCBAACAACGGNATYGC ；FY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTG 粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的功能验证方法，包括以下步骤(I)提取、消化粘红酵母总RNA，合成cDNA第一链；(2)以合成的cDNA第一链为模板，用特异性引物分别克隆粘红酵母ACC三个功能域基因；(3)构建中间表达载体 pETDuet-l-NHl、pETDuet-l-NH3、pETDuet-l-NHl-NH3、 pETDuet-l-NH2 ；(4)构建共表达载体 pETDuet-l-NHl-NH2_NH3 ；(5)将上述获得的所有中间表达载体及共表达载体分别转化；(6)测定三个功能域共表达时重组菌株的脂肪酸含量，所述特异性引物为NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAACNHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCANH2-E-F CGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCANH2-H-R CCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGATNH3-E-F CGGAATTCCCGAGTACCCTCGAGNH3-H-R : CCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG。粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶为同质性乙酰辅酶A羧化酶，BC、BCCP、CT三个功能域依次存在于一条多肽链上，该酶是控制脂肪酸合成的关键酶。本发明公开的乙酰辅酶A基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列以及该基因的克隆方法和原核表达方法，可以广泛应用在油脂微生物的研究以及油料作物转基因工程中。本发明直接通过重组菌株脂肪酸含量判断乙酰辅酶A羧化酶三个功能域的功能， 克服了放射性同位素标记法中容易污染环境、标记试剂昂贵以及操作复杂等缺陷，也克服了其他方法中步骤多、中间产物复杂等造成的灵敏度低等缺陷。
图I为简并PCR扩增粘红酵母ACC基因部分序列，A :利用引物对QK-F/WG-R进行 PCR扩增的结果；B :利用引物对IN-F/FY-R进行PCR扩增的结果，LaneM DL2000 Maker。图2为粘红酵母总RNA的提取。
5
图3为粘红酵母ACC三个功能域cDNA序列的扩增，泳道M DL2000Marker ;泳道I : BC功能域cDNA ;泳道2 =BCCP功能域cDNA ;泳道3 CT功能域cDNA。图4为载体pETDuet-1-NHl的构建。图5为载体pETDuet-l_NH2的构建。图6为载体pETDuet-l_NH3的构建。图7 为载体 pETDuet-l-NHl_NH3 的构建。图8 为载体 pETDuet-l-NHl-NH2_NH3 的构建。图9为粘红酵母ACC三个功能域共表达的SDS-PAGE图，泳道1、3、5 :三个重组表达菌株；泳道2、4、6 :三个对照菌株。泳道M :蛋白Marker，箭头代表目的蛋白所在位置。图10为气相色谱分析后不同处理菌株脂肪酸含量的对比结果。
具体实施例方式下面结合实例对本发明做详细的描述。实施例I克隆粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因(I)以粘红酵母(Rhodotorula glutinis)为实验材料,提取基因组DNA。(2)如图I所示，从数据库中在KEGG数据库中下载不同种类酵母和丝状真菌的乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列，利用软件Clustal XI. 83进行多序列比对后，选取三个保守区域 IANNGA、QKIIEEA、WGYFSV 设计了两对简并引物 IN-F/FY-R、QK_F/WG-R 进行 PCR 扩增。引物如下QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGCWG-R ACVGAGAAGTAACCCCAIN-F ATYGCBAACAACGGNATYGCFY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTGPCR 体系如下(50uL) :10Xbuffer 5uL,2. 5mM dNTPs 4uL，上下游引物各 luL， EXTaq 酶 0. 5uL (5U/uL)，dd H20 37. 5uL。采用降落 PCR 程序94 °C 预变性 5min ；其后94 °C lmin, 51 V lmin,每经过一个循环温度降低O. 5°C,72°C lmin, 11个循环；然后 940C lmin, 460C lmin，72°C lmin，19 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0将扩增得到的保守区片段连接pMD18-T，4°C过夜，按照pMD18_T载体试剂盒操作， 说明书连接体系如下目的片段3uLpMD18T-vector IuLSolution I 5uLddH20 IuL连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞后，采用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆子进行菌落PCR验证，将验证正确的菌落进行测序，获得粘红酵母部分保守序列。(3)分别用四种平末端限制性内切酶EcoR V、Pvu II、Dra I、Stu I消化基因组 DNA以构建Genome walking酶切文库,酶切体系如下基因组DNA
限制性内切酶
I Ox限制性内切酶Buffer
25 uL (O. I ug/uL) 8 uL (10 units/uL)
10 uL
ddH2057 uL纯化后的酶切产物与Genome walker Adaptor相连,体系如下
纯化后的酶切产物
4 uL
Genome walker Adaptor (25 uM)
9
IOxligation buffer T4 DNA ligase (6 units/uL)
UL
5
ο·
UL
6以适当稀释的Genome walking文库DNA为模板,用引物API和外侧特异性引物进行首轮 PCR，体系如下:DNA 酶切文库 luL, 10XLA buffer5uL, 2. 5mM dNTPs 4uL，IOuM 夕卜侧引物 luL，APl luL, LA Taq 酶 0. 5uL(5U/uL)，dd H20 37. 5uL ;再以适当稀释的首轮 PCR 产物为模板，用引物AP2和内侧特异性引物进行次轮的巢式PCR，体系同前。琼脂糖凝胶电泳回收适当大小的特异性巢式PCR产物，测序验证。引物如下API GTAATACGACTCACTATAGGGC 外侧接头引物AP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT内侧接头引物将染色体步移得到的片段序列拼接获得了粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的全长序列。实施例2粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因三个功能域的克隆和共表达(I)如图2所示，用E. Z. N. A. Yeast RNA Kit试剂盒提取粘红酵母总RNA0(2)参照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书首先用 DNase I 消化总 RNA,体系如下RNA lug, IOXDNase I reaction buffer with MgC12 luL, DEPC Water 加至 9uL，DNase I luL。总体积 10uL。37°C温育 30min，加入 luL25mM EDTA65°C IOmin 终止反应。取lug总RNA为模板，加入oligo(dT)18作为反转录引物，加DEPC处理水至 12uL后，轻微混勻，65°C温育5min,短暂冰浴。依次加入下列组分5XReaction Buffer 4uL, Ribolock RNase Inhibitor(200u/uL)luL,IOmM dNTP Mix 2uL, RevertAid M-MuL V Reverse Transcriptase (200u/uL) luL。轻微混勻。42°C lh。72°C 5min 终止反应。合成的 cDNA第一链立即使用或_70°C备用。如图3所示，以合成的cDNA第一链为模板，用特异性引物分别克隆粘红酵母ACC 三个功能域基因。体系同前2. 2. 3。扩增条件如下94°C 3min ；94°C 30s, 45°C 45s, 72°C 2min 进行5个循环，再按94°C 30s, 58°C 45s, 72°C 2min进行30个循环，最后72°C延伸IOmin。 引物如下NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAACNHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCA
NH2-E-FCGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCA
NH2-H-RCCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGAT
NH3-E-FCGGAATTCCCGAGTACCCTCGAG
NH3-H-RCCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG
(3)首先，用Nde I和EcoR V分别双酶切表达载体pETDuet-Ι和
PMD-18T-GBD-NH1,回收带粘性末端的pETDuet_l和GBD-NH1，两者在DNA Ligase的作用下 16°C过夜连接。连接产物转化感受态大肠杆菌宿主细胞DH5a。菌落PCR鉴定阳性转化子。 将重组质粒命名为pETDuet-1-NHl (如图4所示)。用EcoR I和Not I分别双酶切表达载体pETDuet-Ι和pMD-18T-GBD-NH3，回收带粘性末端的pETDuet_l和GBD-NH3，用上述相同的方法构建载体pETDuet-l-NH3 (如图6所示)。然后用EcoR I和Not I分别双酶切表达载体 pETDuet-1-NHl 和 pMD-18T-GBD_NH3，回收带粘性末端的 pETDuet-1-NHl 和 GBD-NH3， 用上述相同的方法构建载体pETDuet-l-NHl-NH3 (如图7所示)。用Not I和Afl II分别双酶切 pETDuet-Ι 和 pMD-18T-GBD-NH2，构建载体 pETDuet-l_NH2 (如图 5 所示)。如图8所示，以表达载体pETDuet-l_NH2为模板，采用引物T7-pDuet-bccp-f/ T7-pDuet_bccp-r 进行 PCR 扩增(T7-pDuet-bccp-f ataagaatgcggccgctaatacgact cactatagggga ；T7-pDuet~bccp-r aatccccttaagttaaagggccaagataccgaggat) , _ ^lJ 片段GBD-NH2-2带上一个T7启动子序列，最后将带有Not I和AfI II粘性末端的 GBD-NH2-2连接到带相同粘性末端的pETDuet-l-NHl-NH3上，构建获得的表达载体命名为 pETDuet-l-NHl-NH2-NH3-2,该表达载体中每个目的片段都带有一个启动子。(4)将上述获得的所有中间表达载体及共表达载体pETDuet-l-NHl-NH2-NH3分别转化Transetta (DE3)感受态,涂布含50 μ g/mL Amp的LB固体平板,37°C过夜培养。菌落 PCR验证转化子。实施例3测定三个功能域共表达时重组菌株的脂肪酸含量进而验证该基因的功倉泛大量诱导表达重组菌株，离心收集菌体，_80°C冷冻3h，然后抽真空冷冻干燥。采用水浴法(Li et al. , 2006)抽提菌体脂肪酸,步骤如下(I)试剂配制5% (体积百分比)浓硫酸/甲醇溶液；0· 2% (质量百分比)BHT/ 甲醇溶液；2.5mg/mL碳十七脂肪酸甲酯/石油醚(90°C _120°C )溶液；O. 9% (质量百分比)NaCl/水溶液；(2)将干燥的菌体用研钵研碎后用分析天平称取50mg加入20mL钳口顶空瓶中，加入5%浓硫酸甲醇溶液2mL(分两次加，每次ImL)，将玻棒冲洗干净后依次向瓶中加入如下试剂0. 2% BHT 溶液 25 μ L,甲苯 300 μ L ；(3)用压盖器将顶空瓶用带聚四氟乙烯垫的铝盖封好，将上述混合物轻微晃动混匀，然后于恒温水浴锅中90-95°C水浴I. 5h提取；(4)提取结束后取出冷却至室温,用启盖器启盖后加入5 μ L10mg/mL碳二十二脂肪酸甲酯作内标，再加入O. 9% NaC12mL，稍微振荡，用3mL正己烷萃取，萃取时用移液枪取上清液再吹入瓶中，反复3-4次以保证萃取完全，将上清液转移至IOmL离心管中；(5)得到的萃取物在氮吹仪下吹干，然后用ImL的正己烷溶解定容，涡旋2_3s，再离心(转速4500rpm、时间5min、温度4°C )取上清液；
(6)进行气相色谱分析(气相色谱仪的工作条件FID氢火焰离子化检测器， HP-INNOWax色谱柱，进样口温度250°C，分流比10 1，检测器温度260°C，色谱柱初温 210°C,9min,程序升温20°C /min,升至230°C,并在此温度下维持8min)每个样品做三个重复，同时取空载体转化菌株做对照，油脂计算方法如下
Six#
菌体油脂含量(%)= S2XMSI :总峰面积S2:内标峰面积N:内标用量M :菌体质量图10为气相色谱分析后不同处理菌株脂肪酸含量的对比结果。表达不同功能域的重组菌株的脂肪酸含量如图10所示。图中的Ck是空载体转化表达菌株，即不含有外源基因的载体pETDuet-Ι转化Transetta (DE3)感受态细胞后测的的
脂肪酸含量。
权利要求
1.粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
3.根据权利要求I所述的粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤(1)粘红酵母总DNA的提取；(2)利用两对简并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆到载体PMD18-T上，转化DH5 α感受态，获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的部分保守序列；(3)利用染色体步移法获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的未知序列；(4)通过对扩增序列的拼接获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的全长序列，所述的简并引物IN-F/FY-R、QK-F/WG-R分别为QK-F CAGAAGATYATYGAGGAGGC ；WG-R ACVGAGAAGTAACCCCA ；IN-F ATYGCBAACAACGGNATYGC ；FY-R GAGCCTCCTCRATRATCTTCTG
4.根据权利要求I所述的粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的功能验证方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取、消化粘红酵母总RNA，合成cDNA第一链；(2)以合成的cDNA第一链为模板，用特异性引物分别克隆粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶的三个功能域基因；(3)构建中间表达载体pETDuet-l-NHl、pETDuet-l_NH3、pETDuet-l-NHl_NH3、 pETDuet-l-NH2 ；(4)构建共表达载体pETDuet-l-NHl-NH2-NH3 ；(5)将上述获得的所有中间表达载体及共表达载体分别转化；(6)测定三个功能域共表达时重组菌株的脂肪酸含量，所述特异性引物为NHl-B-F CGGGATCCATCAACAAGGTCCTCATCGCTAACAAC NHl-N-R AATGCGGCCGCGATAAGCTCATCCAGCCA NH2-E-F CGGAATTCGACTTCATCTACGAGGGCCA NH2-H-R CCAAGCTTAAGGGCCAAGATACCGAGGAT NH3-E-F CGGAATTCCCGAGTACCCTCGAG NH3-H-R :CCCAAGCTTAGCATCCTTCCACACAAG。
5.权利要求I所述的粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因在转基因油料作物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因以及该基因编码的蛋白质、该基因的克隆方法和功能验证方法。本发明粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明通过测定粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶基因三个功能域分别表达和共表达时重组菌株的脂肪酸含量，进而验证该基因的功能。本发明公开的乙酰辅酶A基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列以及该基因的克隆方法和原核表达方法，可以广泛应用在油脂微生物的研究以及油料作物转基因工程。
文档编号G01N30/02GK102586289SQ201110396148
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者喻子牛, 张吉斌, 李洁琼, 王利兵, 郑世学 申请人:华中农业大学