专利名称：一种主动脉疾病早期诊断标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种主动脉疾病早期诊断标志物及其应用。
背景技术：
基膜聚糖(Lumican)是一种存在于主动脉中层的基质蛋白，在急性主动脉损伤过程中释放入血，其血清浓度的可作为早期判断急性主动脉疾病(AD)的特异性指标。急性主动脉疾病(AD)包括急性主动脉夹层(AAD)、主动脉壁间血肿(IMH)、胸腹主动脉瘤(TAA/AAA)等。其年发病率约25 30/百万，且发病急、病情严重。据文献报告，AAD 在急诊室的漏诊率可高达50%，而且有25%的AAD诊断是通过死后尸体解剖才明确的。AAD 导致患者死亡的原因除了与病情严重、血压控制欠佳、病情发展等因素有关外，重要的一点是诊断的耽搁和延迟，导致临床上危险因子出现机率增高。故对于临床上胸背痛、高度怀疑 AD的患者，医学界急需确立一套高度敏感、特异性好的临床指标进行早期AD确诊。近十余年来，由于超声心动图、磁共振成像、螺旋CT等敏感性和特异性俱高的影像技术的进步，使医生能更早确诊和治疗AD。但是，大多数这些影像检查成本高、价格贵、检查时间长且需搬动患者，故广泛开展存在困难。生物化学诊断具有快速、经济和非侵入性的优点。这些优点使外周血生化指标诊断AD非常具有吸引力。因此，寻找AD的早期外周血标记物对于迅速确定AD的诊断，早期干预和治疗，降低死亡率和并发症均有重要的意义。已有文献报告的AD患者外周血标志物如平滑肌肌球蛋白重链(smMesHC)、CK_BB、MMPs、平滑肌肌钙蛋白(Sm. troponin) ,Elastin 等，虽然这些指标众多，但是各自的优缺点导致目前无法进入临床运用。D- 二聚体是反应体内纤溶活性的生化指标，是目前唯一能在临床运用的筛查AD的生化指标。但是由于敏感性高、特异性差的特点，D- 二聚体也无法作为确诊AAD的生化标志物。
发明内容
本发明的目的是筛选和鉴定能用于AD早期诊断的分子标志物，为AD的早期诊断提供可以量化的指标，提高主动脉夹层早期诊断率，降低临床误诊与漏诊率。为了达到上述目的，本发明提供了 Lumican作为主动脉疾病早期诊断标志物在制备主动脉疾病早期诊断试剂中的应用。优选地，所述的主动脉疾病为急性主动脉疾病(AD)。优选地，所述的急性主动脉疾病为急性主动脉夹层(AAD)、主动脉壁间血肿 (IMH)、胸腹主动脉瘤(TAA/AAA)。优选地，所述的主动脉疾病早期诊断试剂为主动脉疾病早期诊断Elisa试剂，其包含生物素标记Lumican抗体以及Lumican标准品。本发明的优点是对胸痛患者进行血清Lumican检测，其检测过程快速、检测费用经济并对患者无创伤。
图1为Lumican蛋白检测验证结果图。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1 :Lumican蛋白的筛查
首先取10例AAD患者的血清，以10例正常健康人血清为正常对照，以10例急性心肌梗死患者血清为疾病对照，利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation, iTRAQ)技术进行筛查。结果发现Lumican在AAD患者血清中的表达是健康人的3. 6311倍。实施例2 检测LUMICAN的ELISA试剂盒以及检测方法
1.检测LUMICAN的ELISA试剂盒包括酶联板；Lumican标准品；样品稀释液；生物素标记抗体稀释液；辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液；生物素标记Lumican抗体；辣根过氧化物酶标记亲和素；底物溶液；浓洗涤液；终止液(均由武汉华美生物工程有限公司生产的人基膜聚糖/内腔蛋白(LUM)酶联免疫分析试剂盒(No. CSB-E09797h)提供)。2.检测具体步骤
1)标本的采集和保存全血标本室温放置2小时内，以4500 rpm离心20分钟，取上清液，立即检测；也可将上清液放于-80°C低温保存，解冻后检测。2)标准品的稀释标准品8000rpm离心30秒。每瓶以样品稀释液稀释至Iml(浓度为40ng/ml)，盖好后静置10分钟，然后反复颠倒搓动帮助溶解。做系列倍比稀释40 ng/ ml,20 ng/mlUO ng/ml、5 ng/ml、2. 5 ng/mlU. 25 ng/ml 和 0. 62 ng/ml。样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，检测前15分钟配置。3)检测步骤
加样分别设空白孔、标准孔、代测样品孔。空白孔中加样品稀释液100 μ ，余孔分别加不同浓度的标准品或患者血清100 μι。酶标板覆盖覆膜，37°C反应120分钟。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μ 1 (取1 μ 1生物素标记Iumican抗体加99 μ 1生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混勻，在使用前1 小时内配制)，37°C，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，200 μ 1/孔，思干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲合素工作液100 μ 1 (取1 μ 1辣根过氧化物酶标记亲合素加99 μ 1辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混勻，在使用前1小时内配制)，37°C，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1. 5分钟，200 μ 1/孔，思干。依次每孔加底物溶液90 μ 1，37°C避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔显色不明显，即可终止)。依次每孔加终止液50 μ 1，终止反应(此时蓝色立即转为黄色)。终止液的加入顺序同底物液的加入顺序。
用酶联仪在450nm波长依序测定各孔的光密度(0D值)。在加终止液后15分钟内进行检测。4)浓度计算使用Curve Exert 1. 3软件，以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，制作标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出样品相应的浓度。5)结果判定使用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测患者血清Lumican浓度，当胸痛患者Lumican浓度高于1. 5ng/ml时即可基本确诊AD。
实施例3
取118例急性胸痛患者的样本，其中包括AAM4例、主动脉瘤7例、主动脉壁内血肿5 例、急性冠脉综合症37例、肺栓塞5例、肺部及胸膜炎症4例、消化系统疾病2例、其他原因引起的胸痛4例，利用实施例2所述的方法进行验证。结果发现非AD患者的血清Lumican 浓度均低于1. 5ng/ml, 54例急性主动脉夹层(AAD)患者中有17例患者的Lumican浓度高于1. 5ng/ml, 7例主动脉瘤的患者中有5例Lumican浓度高于1. 5ng/ml (见图1)。当胸痛患者Lumican浓度高于1. 5ng/ml时，诊断主动脉疾病的准确率100%。
权利要求
1.Lumican作为主动脉疾病早期诊断标志物在制备主动脉疾病早期诊断试剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的主动脉疾病为急性主动脉疾病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的急性主动脉疾病为急性主动脉夹层、 主动脉壁间血肿或胸腹主动脉瘤。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的主动脉疾病早期诊断试剂为主动脉疾病早期诊断Elisa试剂，其包含生物素标记Lumican抗体以及Lumican标准品。
全文摘要
本发明涉及一种主动脉疾病早期诊断标志物及其应用。具体涉及Lumican作为主动脉疾病早期诊断标志物在制备主动脉疾病早期诊断试剂中的应用。本发明的优点是对胸痛患者进行血清Lumican检测，其检测过程快速、检测费用经济并对患者无创伤。
文档编号G01N33/68GK102565418SQ20111043864
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月25日 优先权日2011年12月25日
发明者姚晨玲, 童朝阳, 顾国嵘 申请人:复旦大学附属中山医院