专利名称：奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法
奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法。
背景技术：
奥硝唑(Ornidazole)为第三代硝基咪唑类衍生物，用于治疗厌氧菌和原虫、滴虫感染。其发挥抗微生物作用的机理可能是通过其分子中的硝基，在无氧环境中还原成氨基或通过自由基的形成，与细胞成分相互作用，从而导致微生物死亡。奥硝唑的血浆消除半衰期为14小时，血浆蛋白结合率小于15%，广泛分布于组织和体液中，包括脑脊液。奥硝唑在肝中代谢，在尿中主要以轭合物和代谢物排泄，小量在粪便中排泄。
奥硝唑中目前报道的杂质共有3种，奥硝唑及其杂质结构分别为
奥石肖 P坐l-chloro-3-(2-methyl-5-nitro-lH-imidazol-l-yl)propan-2-ol, 1-氯-3-(2-甲基-5-硝基-IH-咪唑-1-基)丙-2-醇，化学式见式I。
杂质1 :2-methyl-5-nitro-lH-imidazole，2-甲基 _5_ 硝基咪唑，化学式见式 II。
I^M 2 1-(2-methyl-5-nitro-lH-imidazol-l-yl) propan-2-one, 1_ (3- _ ^^ 基)-2-甲基-5-硝基咪唑，化学式见式III。
杂质 3 :l-(3-chloroallyl)-2-methyl-5-nitro-lH-imidazole，l-丙酮基-2-甲基-5-硝基咪唑，化学式见式IV。
OHW
O2N式I式II/VciO2NO2N
式III式IV发明人发现奥硝唑注射液中主要杂质为2-甲基-5-硝基咪唑(即杂质1)和1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑(最大杂质，即杂质2)，2-甲基-5-硝基咪唑为合成过程中的中间体，分子式为C4H5N3A ；最大杂质为奥硝唑降解产物，分子式为C7H8ClN3O215 为了更快速、精确检测注射液中的杂质，发明人提供了一种新的检测方法检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑和1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑，及其含量测定，以实现简便、快速、精确控制产品质量的目的。发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑(杂质1)及其最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑(杂质2)。
本发明所述杂质1为2-甲基-5-硝基咪唑，分子式为C4H5N3A ；所述杂质2为最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑，分子式为C7H8ClN3O2。
2-甲基-5-硝基咪唑(杂质1)采用高效液相色谱检测，HPLC检测条件如下
固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85; 乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20 80;
流速0.8-1. 2ml/min (流速优选 1. Oml/min)；
柱温30-40°C(柱温优选:35°C )；
检测波长305-315nm(310nm为优选值)；
理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ；
实验材料的处理
(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液1ml，加流动相定容至奥硝唑注射液的 50-100倍体积量(优选100倍)，摇勻，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备
精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解，用流动相稀释制成 2. 0-3. O μ g/ml (优选2. 5 μ g/ml) 2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇勻，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。
检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。
该检测方法的优点是操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短。
最大杂质采用高效液相色谱检测，HPLC检测条件如下
固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85; 乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20 80;
流速0.8-1. 2ml/min (流速优选 1. Oml/min)
柱温30-40°C(柱温优选:35°C )；
检测波长305-315nm(310nm为优选值)；
理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ；
实验材料的处理
(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的 50-100倍体积量(优选100倍量)，摇勻，作为供试品溶液；
(2)对照溶液的制备
取供试品溶液1ml，然后用流动相稀释至100ml，摇勻，作为对照溶液。
检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。
该检测方法的优点是操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短。
在上述检测方法的基础上，本发明还提供了一种奥硝唑注射液杂质2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质的含量测定方法，可快速、简便、准确的确定奥硝唑注射液中杂质含量， 实现控制产品质量的目的。
(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的 50-100倍体积量(优选100倍量)，摇勻，作为供试品溶液；
(2) 2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液的制备
2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解后，再用流动相稀释，制成每2. 0-3. 0 μ g/ ml (优选2. 5 μ g/ml) 2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇勻，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。
(3)最大杂质对照溶液的制备
取供试品溶液1ml，然后用流动相稀释至100ml，摇勻，作为对照溶液。
测定杂质1 甲基-5-硝基咪唑)含量采用高效液相色谱测定，HPLC检测条件如下
固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85; 乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20 80;
流速0.8-1. 2ml/min (流速优选 1. Oml/min)；
柱温30-40°C(柱温优选:35°C )；
检测波长305-315nm(310nm为优选值)；
理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。
测定杂质2 (最大杂质)含量采用高效液相色谱测定，HPLC检测条件如下
固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85; 乙腈-水，或甲醇-水优选体积比为20 80;
流速0.8-1. 2ml/min (流速优选 1. Oml/min)；
柱温30-40°C(柱温优选:35°C )；
检测波长305-315nm(310nm为优选值)；
理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。
本发明杂质检测方法及含量测定方法的有益效果是操作简便，检测迅速，测定结果准确可靠，专属性更强；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。
图12-甲基-5-硝基咪唑紫外扫描图。
图2奥硝唑紫外扫描图。
图32-甲基-5-硝基咪唑线性图
图4奥硝唑最大杂质线性图具体实施方式
以下通过对本发明具体实施方式
的描述说明但不限制本发明。
现有的检测奥硝唑中杂质的相关技术主要为“奥硝唑”国家药品标准 (ffSr(X-454)-2003Z-2010)(以下简称奥硝唑质量标准)中收载的奥硝唑有关物质的测定方法，测定条件规定如下
取供试品适量，加流动相溶解并制成每Iml中含100 μ g的供试品溶液与每Iml中含0. 5 μ g的对照溶液。另取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加流动相溶解并制成每Iml 中含0.2yg的对照品溶液。以甲醇_水QO 80)为流动相，检测波长318nm。取对照溶液20 μ 1注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高达满量程的20%，精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20 μ 1注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2. 5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，2-甲基-5-硝基咪唑杂质按外标法以峰面积计算，不得过0. 2%，其它各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(0. 5% )。
其中采用的色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水 (20 80)为流动相；检测波长为318nm。然而，这种方法对奥硝唑有关物质的测定灵敏度不够，对最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑的含量没有明确规定，使得奥硝唑的质量可控性受到影响。
—、以下为本发明奥硝唑注射液杂质检测方法及含量测定方法的检测条件筛选实验。
1、确定检测波长
奥硝唑国家药品标准(^^-(1-454)-20032-2010)中采用以甲醇-水QO 80)为流动相，检测波长为318nm，测定有关物质，对2-甲基-5-硝基咪唑进行了定位和限度控制， 对最大杂质进行了定位，未进行限度控制，而奥硝唑在310nm的波长处有最大吸收，为了有效地控制奥硝唑中的杂质，对杂质的最大吸收波长进行研究，需确定更加合适的检测波长。
确定本发明检测方法的检测波长
(1)精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并稀释至每Iml约含 10 μ g的溶液，在200 400nm波长范围内扫描。结果2_甲基-5-硝基咪唑在310nm处有最大吸收，因此选择2-甲基-5-硝基咪唑检测波长310nm。紫外扫描图见图1。
图1中峰谷检测灵敏度0. 0100
权利要求
1.奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于杂质2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱检测，检测条件如下固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85 ； 流速0. 8-1. 2ml/min ； 柱温:30-40 0C ；检测波长305-315nm，检测波长优选310nm ； 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ； 实验材料的处理(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇勻，作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备 >2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解，然后用流动相稀释，制成每Iml约含2. 5 μ g 杂质2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇勻，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。
2.奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于杂质为1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱检测，检测条件如下固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85 ； 流速0. 8-1. 2ml/min ； 柱温:30-40 0C ；检测波长305-315nm ；检测波长优选310nm ； 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ； 实验材料的处理(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇勻，作为供试品溶液；(2)对照溶液的制备取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，摇勻，作为对照溶液。
3.根据权利要求1或2所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于高效液相色谱的检测条件中流动相乙腈-水体积比为20 80;或流动相甲醇-水体积比为20 80。
4.根据权利要求1或2所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于高效液相色谱的检测条件中所述的流速为1. Oml/min ；柱温为35°C。
5.根据权利要求1或2所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于供试品溶液的制备中加流动相，定容至奥硝唑注射液的至100倍体积量。
6.奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于杂质为2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱测定，检测条件如下固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85 ； 流速0. 8-1. 2ml/min ； 柱温:30-40 0C ；检测波长305-315nm ；检测波长优选310nm ；理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ；实验材料的处理(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇勻，作为供试品溶液；(2)对照品溶液的制备2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解，然后用流动相稀释，制成每Iml约含2. 5 μ g 杂质2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇勻，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。
7.奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于杂质为1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱测定，检测条件如下固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-水体积比为15-25 75-85 ；或甲醇-水体积比为15-25 75-85 ；流速0. 8-1. 2ml/min ；柱温:30-40 0C ；检测波长305-315nm ；检测波长优选310nm ；理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500 ；实验材料的处理(1)供试品溶液的制备取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇勻，作为供试品溶液；(2)对照溶液的制备取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，摇勻，作为对照溶液。
8.根据权利要求6或7所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于高效液相色谱的检测条件中流动相乙腈-水体积比为20 80;或流动相甲醇-水体积比为 20 80。
9.根据权利要求6或7所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于高效液相色谱的检测条件中所述的流速为1. Oml/min ；柱温为35°C。
10.根据权利要求6或7所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于供试品溶液的制备中加流动相，定容至奥硝唑注射液的至100倍体积量。
全文摘要
本发明属于药物分析领域，具体涉及奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法。本发明为了提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质，该最大杂质为奥硝唑失去1分子水的降解产物1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑)，采用液相色谱检测上述杂质，关键在于控制HPLC检测条件流动相为乙腈-水(或甲醇-水)体积比为15-25∶75-85，杂质2-甲基-5-硝基咪唑及最大杂质检测波长为305-315nm。通过控制关键检测参数实现简便，迅速、精确检测的目的，本发明方法操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。
文档编号G01N30/02GK102539564SQ20111044711
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者孙毅, 王婕, 田阿娟 申请人:成都金典药物科技开发有限公司