专利名称：一种检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置及其方法
技术领域：
本发明申请涉及一种检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置及其方法，属于临床免疫学检测技术领域。
背景技术：
幽门螺杆菌(HP)是人类胃粘膜内的一种螺旋状的革兰阴性细菌。HP直径约
0.85 μ m,长度约2.9 μ m，菌体光滑，呈S形，有4 6条鞭毛，易粘附在幽门附近的胃窦部及胃体部的粘膜上，位于胃粘液的深层，不与胃酸直接接触。HP是人类常见的致病菌之一，在人与人之间通过经口途径传播，具有活力的HP在河水中可存活I周，是慢性胃炎消化性溃疡和非溃疡性消化不良的重要致病因素。幽门螺杆菌受瞩目的原因，是因为它与胃溃疡，十二指肠溃疡，以及胃炎有极为密切的关系。它在人体中只能寄居在胃黏膜的上皮，绝大多数的感染只造成无症状的慢性胃炎，只有少数毒性较强的菌株会产生胃溃疡或十二指肠溃疡。新近的研究表明，几乎全部的十二指肠溃疡(95 100% )以及人多数的胃溃疡(70 80% )都与幽门螺杆菌有关。幽门螺杆菌除了与胃部疾病有关之外，还与肝硬化、胆石症、高血压、冠心病、糖尿病、缺铁性贫血、脑血栓形成、偏头痛、荨麻疹等疾病关系密切。幽门螺杆菌菌体表面的鞭毛以及分泌的多种抗原组分均可激发宿主的免疫应答而诱导抗体产生，检测血清中特异性抗体可以反映病原体的感染情况。幽门螺杆菌全身性抗体(即血清抗体)主要为IgG和IgA，IgM极为少见。血清抗体可反映机体对幽门螺杆菌的感染及免疫应答能力，检测抗体十分必要。临床检测幽门螺杆菌抗体的常见方法包括金标法、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验的方法，但这些方法都存在着不足之处。一、金标法金标法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，胶体金已经广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。该方法快速、敏感性高，但其特异性差，假阳性率较高，且只能做定性检测，不能定量。二、免疫印迹法免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。其不足之处在于:(I)只能进行定性和半定量分析，无法得出被检物质具体的量。(2)操作步骤繁琐，试验用时较长。(3)检测的灵敏度还有待提闻。三、酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法(ELISA)被广泛应用于检测幽门螺杆菌抗体，但该方法也存在着下述的不足之处:(I)使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；(2)定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，力口注试剂的操作也极为繁琐；(3)缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；(4)检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；(5)检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；(6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数X48/96人份，如果需要检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10X48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10X48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
发明内容
本发明专利申请即是针对目前对于幽门螺杆菌抗体的检测中存在的上述不足之处，提供一种能够进行独立单人份检测的试剂装置及其检测方法。本发明专利申请基于酶联免疫检测的原理来实现幽门螺杆菌抗体的检测，是一种独立的、单人份的、一次性的检验方法；进一步的，本发明申请还提供了与该方法配套的相应的试剂装置，该试剂装置将幽门螺杆菌抗体酶联免疫检测所需要的多种试剂盛装在一个独立的、多孔结构的试剂装置内，通过分步加注移弃完成检测步骤；进一步的，所述的试剂装置还可以通过专用的免疫分析仪进行相应的全自动检测。本发明申请的目的之一是提供一种检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置，该目的是通过下述的技术方案实现的:具体来说，本发明申请所述的检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置为长条状，包括具有八个孔位的基体和位于基体一端的手柄，八个孔位的排列顺序从近手柄端开始依次为样本孔、辅剂孔、酶结合物孔、底物孔、终止液孔、稀释液孔、反应孔和稀释孔，样本孔内盛有待测样本，辅剂孔供检测有需要时加入辅助试剂使用，酶结合物孔内盛有酶结合物溶液，底物孔内盛有底物溶液，终止液孔内盛有终止液，稀释液孔内盛有稀释液，反应孔为平底且具有高的光通透性，孔内包被有幽门螺杆菌抗原，并作为反应容器加注待测的液体样本和检测试剂及洗涤液，反应终止后进行吸光度测定，稀释孔作为样本稀释容器，供稀释样本时用。进一步的，所述的试剂装置中，当检测幽门螺杆菌抗体IgG时，辅剂孔不加入任何试剂，当检测幽门螺杆菌抗体IgA时，吸附剂加入辅剂孔内或与稀释液一起加入稀释液孔中。
进一步的，所述的试剂装置中，辅剂孔、酶结合物孔、底物孔、终止液孔和稀释液孔上覆盖有密封薄膜，该密封薄膜主要起到在运输和移动的过程中防止液体溢出的作用，另夕卜，也起到防尘防污染及增强稳定性的作用。进一步的，所述的手柄上粘贴有条形码，该条形码标识有幽门螺杆菌抗体检测试剂及分析装置的相关信息。更进一步的，所述的信息包括检测项目代码、检测试剂生产批号、试剂有效期、定量检测标准曲线参数/定性校正系数、酶联免疫反应类型、试剂及分析装置的序列号。进一步的，所述试剂装置还包括若干个支撑柱，所述的支撑柱位于所述试剂装置基体的下面，相邻支撑柱之间间隔有一个以上的孔位，支撑柱的作用是为了加强基体的机械强度及平衡性。进一步的，所述试剂装置中反应孔由外孔和内孔构成，外孔的底部开有底孔，内孔穿过底孔且与底孔紧配合，外孔和内孔之间留有防溢腔，防溢腔的作用是在反应过程中，如果液体溢出，可以留在腔内，防止污染仪器和其他试剂装置。更进一步的，所述试剂装置中反应孔的内孔包被的幽门螺杆菌抗原包括纯化且灭活的幽门螺杆菌或重组的幽门螺杆菌，重组的幽门螺杆菌包括但不仅限于幽门螺杆菌粘附素BabA重组蛋白、幽门螺杆菌oipA DNA重组质粒蛋白。应该明确的是，本发明申请中，所述试剂装置中各孔位的大小、形状并不加以限制，例如各孔位的开放口缘可为方形或圆形，其剖面的形状也可以是方形、“U”型、或“V”型，但对于反应孔来说，为了获得较好的光通透性，底部应为平底。进一步的，所述的样本孔内加入的样本为待测血清或血浆，加入的量根据样本孔的大小和检测需要稀释的倍数来确定。所述的辅剂孔是在必要的时候加入辅助试剂之用，例如吸附剂、中和剂、抑制剂、缓冲液等。如当检测幽门螺杆菌抗体IgA时，吸附剂加入辅剂孔内或与稀释液一起加入稀释液孔中，其主要成份为抗人IgG抗体或人葡萄球菌蛋白A(SPA)，以去除检测过程中特异性IgG及类风湿因子等其他物质对检测结果的干扰。所述的酶结合物孔内加入酶结合物溶液，主要成份为辣根过氧化物酶标记的抗人IgG或IgA抗体,碱性磷酸酶标记的抗人IgG或IgA抗体,葡萄糖氧化物酶标记的抗人IgA或IgA抗体,或β -半乳糖苷酶标记的抗人IgG或IgA抗体。所述的底物孔中加入的底物溶液主要成份为TMB、OPD或ABTS。TMB作为一种新型安全的色原试剂，已逐步取代强致癌物联苯胺和其他致癌性的联苯胺衍生物，应用于临床化验、法医检验、刑事侦破及环境监测等领域，尤其是在临床生化检验方面，TMB作为过氧化物酶的新底物，在酶免疫分析法(EIA)和酶联免疫吸附检验法(ELISA)中获得了广泛的应用。所述的终止液孔中加入的终止液主要成份为浓度是0.1 0.5Μ的硫酸或盐酸溶液。所述的稀释液孔中加入的稀释液主要成份为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液，并含一定浓度的牛血清白蛋白、叠氮化钠等组份，用于排除样本中小分子物质的非特异性反应的干扰及增加稳定性。本发明申请的另一个目的是提供利用上述试剂装置进行幽门螺杆菌抗体的检测方法，所述的方法包括如下的步骤:I)在所述的样本孔中加入未稀释的样本；2)从稀释液孔中吸取稀释液加入稀释孔中；3)移除稀释液孔中的剩余液体，从稀释孔中吸取部分液体回稀释液孔；4)从样本孔中吸取样本加入稀释液孔中，将样本进行稀释；5)从稀释液孔中吸取液体加入稀释孔中，将样本进行进一步的稀释；6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，从辅剂孔吸取液体加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤；7)从稀释孔中吸取液体加入反应孔中，25 37°C的条件下，孵育30 60min ；8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体；9)从酶结合物孔中吸取酶结合物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应30 60min后移除液体；10)重复步骤8);11)从底物孔中吸取底物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应10 20min ；12)从终止液孔中吸取终止液加入反应孔中，I IOmin内于450nm读取OD值，或选择双波长法测定，波长范围在620nm 690nm。进一步的，所述的方法包括如下的步骤:I)在所述的样本孔中加入未稀释的样本，体积至少为样本孔容量的1/4 ；2)从稀释液孔中吸取稀释液加入稀释孔中，吸取的量为孔内液体总量的7/10以上；3)移除稀释液孔中的剩余液体，根据预期稀释倍数从稀释孔中吸取部分液体回稀释液孔；4)从样本孔中吸取样本加入稀释液孔中，将样本进行稀释，稀释倍数为I 10倍;5)从稀释液孔中吸取液体加入稀释孔中，将样本进行进一步的稀释，稀释倍数为I 100倍；6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，从辅剂孔吸取液体加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤；7)从稀释孔中吸取液体加入反应孔中，25 37°C的条件下，孵育30 60min ；8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体；9)从酶结合物孔中吸取酶结合物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应30 60min后移除液体；10)重复步骤8)；11)从底物孔中吸取底物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应10 20min ；12)从终止液孔中吸取终止液加入反应孔中，I IOmin内于450nm读取OD值，或选择双波长法测定，波长范围在620nm 690nm。更进一步的，所述的方法包括如下的步骤:
I)在所述的样本孔中加入样本80 150 μ L ;2)用精密加液器从稀释液孔中吸取360 μ L液体到稀释孔中；3)移除稀释液孔中的剩余液体，从稀释孔中吸取180 μ L液体回稀释液孔；4)用精密加液器从样本孔中吸取20 μ L液体到稀释液孔中，样本10倍稀释；5)用精密加液器从稀释液孔中吸取液体20 μ L到稀释孔中，样本100倍稀释；6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，用精密加液器从辅剂孔吸取液体30 μ L加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤；7)用精密加液器从稀释液孔中吸取液体IOOyL到反应孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液体；8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体；9)用精密加液器从酶结合物孔中吸取100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗体酶结合物溶液至反应孔进行反应，25 37°C下，反应30min后移除液体；10)重复步骤8)；11)用精密加液器从底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反应孔中反应10 15min ；12)用精密加液器从终止液孔中吸取100 μ L的终止液加注至反应孔中，I IOmin内于450nm和630nm双波长条件下进行检测，读取OD值。所述的洗涤液包括PBST溶液，PBST溶液是指PBS溶液加上Tween-20，PBS溶液是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution),渗透压近似于生理条件,又有很强的pH缓冲能力，常用来洗细胞和作为细胞培养的基础液，而Tween-20为一种非离子表面活性剂，对细胞生长可产生影响，Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。本发明申请所述测定幽门螺杆菌抗体的试剂装置及其方法，不但具有其他检测方法所具有的特异性强、灵敏度高，准确性好、成本较低、使用要求不高、操作较为简便、获得检测结果时间短、应用广泛等的优点，而且解决了其他检测方法的诸多不足，具体体现在以下几个方面:1.所述的检测方法运用酶联免疫分析原理，利用特定的分析仪器，采用配套专用的检测试剂盒及分析试剂装置，自动实现幽门螺杆菌抗体定量测定，是一种全新的、适用的、实用的、高效的、快速的检测幽门螺杆菌抗体的方案；2.它是一种独立的、单人份的检测试剂及分析装置，无需像通用ELISA法那样使用12X8型、6X8型、8X 12型或整板型96孔专用酶联免疫微孔板作为抗原包被用品和反应容器，在使用时只要有一份样本即可进行对应项目的检测而无试剂的浪费，如果样本的数量超过一份，按实际样本数使用该试剂及分析装置即可；3.它将每一检测必需的试剂盛装在一个分析试剂装置的试剂孔位内，而无须将检测试剂分别用不同的试剂瓶来盛装，不但操作极为简便，而且不容易造成操作差错，从而保证检测结果的正确性；4.它对每一个分析试剂装置都有一个专用条形码，条形码的数值包含检测所对应的检测项目代码、检测试剂生产批号、试剂有效期、定量测定标准曲线参数、具体的酶联免疫反应类型、试剂及分析装置的序列号等信息，不能随意被改变，使用时严格受控，尤其是在使用超过有效期检测试剂时，将被识别并阻止发出检测报告，从而可以确保检测的准确性；5.它将每一检测试剂进行有效分隔和密封，不会引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果；6.它是一种专用于特定分析仪器的分析试剂装置，在检测过程中用全自动的精密加液器来加注检测试剂、洗涤液或样本，操作自动化，加量精确，检测结果的准确度和精密
度高；7.在检测项目成套试剂的数量配置及使用上，一切按实际使用需要来进行配备即可，尤其是在对多项目检测上，配备更为适量，不会出现超配置及使用情况。
图1是本发明申请所述试剂装置的一个实施例的剖面结构示意图；图2是图1所述实施例的平面俯视图；图3是本发明申请所述试剂装置的另一个实施例的剖面结构示意图；图4是本发明申请所述试剂装置的再一个实施例中反应孔的平面俯视图；图5和图6是图4所述试剂装置中反应孔中内孔和外孔的装配示意图；其中，10为基体、20为手柄、30为条形码、40为密封薄膜、50为支撑柱、11为样本孔、12为辅剂孔、13为酶结合物孔、14为底物孔、15为终止液孔、16为稀释液孔、17为反应孔、18为稀释孔、171为外孔、172为内孔、173为防溢腔、174为底孔。
具体实施例方式以下结合具体的检测装置与实施步骤对本发明申请所述的试剂装置和检测方法进行进一步的描述，目的是为了公众更好的理解本发明申请所述的技术方案，而不是对所述技术方案的限制。事实上，以相同或近似的原理，对所述试剂装置进行的改进，包括其形状、尺寸、所用材质的改变，以及相应结构的增减或替换，都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。实施例一检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置一如图1-2所示，本发明申请所述的检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置为长条状，包括具有八个孔位的基体10和位于基体10 —端的手柄20，八个孔位的排列顺序从近手柄10端开始依次为样本孔11、辅剂孔12、酶结合物孔13、底物孔14、终止液孔15、稀释液孔16、反应孔17和稀释孔18，所述的样本孔11内盛有待测样本，辅剂孔12供检测需要时加入辅助试剂使用(如检测IgA时辅剂孔内加入吸附剂)，酶结合物孔13内加入酶结合物溶液，底物孔14内加入底物溶液，终止液孔15加入终止液，稀释液孔16内加入稀释液，反应孔17为平底并具有很高的光通透性，当盛装无色或空白试剂溶液时，对可见光或紫外光或荧光的吸光度值接近于零，孔内已包被有纯化且灭活的幽门螺杆菌抗原，并作为反应容器加注待测的液体样本和检测试剂及洗涤液，反应终止后进行吸光度测定，稀释孔18作为样本稀释容器，供稀释样本时用。进一步的，所述的试剂装置中，辅剂孔12、酶结合物孔13、底物孔14、终止液孔15和稀释液孔16上覆盖有密封薄膜40，该密封薄膜40主要起到在运输和移动的过程中，防止液体溢出的作用，另外，也起到防尘防污染及增加稳定性的作用。
进一步的，所述的手柄20上粘贴有条形码30，该条形码30标识有幽门螺杆菌抗体检测试剂及分析装置的信息，所述的信息包括检测项目代码、检测试剂生产批号、试剂有效期、定量检测标准曲线参数/定性校正系数、酶联免疫反应类型、试剂及分析装置的序列号。实施例二检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置二如图3所示，本实施例中的检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置，其基本结构与实施例一中的试剂装置相同，在所述试剂装置还包括若干个支撑柱50，所述的支撑柱50位于所述试剂装置中基体10的下面，相邻支撑柱50之间间隔有一个以上的孔位，支撑柱50的作用是为了加强基体的机械强度及平衡性。实施例三检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置三如图4-6所示，为本发明申请所述检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置的优选的实施例，其基本结构与实施例一或实施例二相同，区别在于反应孔17为可拆卸式的结构，反应孔17由外孔171和内孔172构成，外孔171的底部开有底孔174，内孔172穿过底孔174且与底孔174紧配合，外孔171和内孔172之间留有防溢腔173，防溢腔173的作用是在反应过程中，如果液体溢出，可以留在腔内，防止污染仪器和其他试剂装置。进一步的，所述内孔和外孔的配合固定方式还可以是将内孔的外壁设计为两段，上段外壁的厚度大于下段外壁的厚度，外孔的底孔的直径与内孔下段的外径相等，这样将内孔下段插入底孔中，内孔的上段恰好卡在底孔之上，同样可以起到紧固的效果。实施例四试剂装置或试剂盒的制作-间接法检测幽门螺杆菌抗体本发明是基于酶联免疫检测技术上的一种更加简单、准确、有效的一套方法，其采用的基本原理为间接酶联免疫法:将由纯化且灭活的幽门螺杆菌抗原吸附于固相上，通过孵育使稀释的人血清或血浆中的特异性抗体与抗原结合，洗涤去除未与固相结合的抗体，加入用辣根过氧化物酶标记的抗人免疫球蛋白酶联物，孵育，去除未结合的酶联物，加入酶色原底物，产生的颜色与检测样本中的特异性抗体浓度成正比。这种方法主要是通过用于酶联免疫检测的分析试剂装置和配套试剂来实现幽门螺杆菌抗体的免疫检测。通过这种酶联免疫方法，同时运用特定分析仪器的分析试剂装置和试剂，可快速，准确的做出判断用于辅助临床诊断。以孔位11作为样本孔，在使用时加入液体样本，供检测时取用；以孔位12作为辅剂孔，检测有需要时加入辅助试剂(如检测IgA时加入吸附剂)，用密封薄膜封口，供检测取用；以孔位13作为酶结合物孔，加入酶结合物溶液用密封薄膜封口，供检测时取用；以孔位14作为底物孔，加入TMB底物溶液后用密封薄膜封口，供检测时用；以孔位15作为终止液孔，加入终止液后用密封薄膜封口，供检测时用；以孔位16作为稀释液孔，加入样本稀释液后用密封薄膜封口，供检测时用；以孔位17作为包被物孔/反应孔/比色孔，已包被有纯化且灭活的幽门螺杆菌抗原，并作为反应容器加注待测的液体样本和检测试剂及洗涤液，反应终止后进行吸光度测定;以孔位18作为稀释孔，供稀释样本时用；在手柄20粘贴有幽门螺杆菌抗体检测试剂及分析装置信息的条形码30，该条形码包括检测项目代码、检测试剂生产批号、试剂有效期、定量检测校正系数、酶联免疫反应类型、试剂及分析装置的序列号。按照上述方法制备若干分析装置，另外制备相应的校准品和质控物。这样即构成了完整的幽门螺杆菌抗体测定试剂盒组份。将检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置及配套使用组份装入试剂盒的外包装盒，即制成检测幽门螺杆菌抗体试剂盒。实施例五幽门螺杆菌抗体IgG的检测方法本发明申请提供一种利用上述试剂装置进行幽门螺杆菌抗体IgA检测的方法，所述的方法包括如下的步骤:1.在所述的样本孔中加入样本80 150μ L ;2.用精密加液器从稀释液孔中吸取360 μ L液体到稀释孔中；3.移除稀释液孔中的剩余液体，从稀释孔中吸取180 μ L液体回稀释液孔；4.用精密加液器从样本孔中吸取20 μ L液体到稀释液孔中，样本10倍稀释；5.用精密加液器从稀释液孔中吸取液体20 μ L到稀释孔中，样本100倍稀释；6.用精密加液器从稀释液孔中吸取液体100μ L到反应孔中，25°C下，孵育60min后移除液体；7.用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体；8.用精密加液器从酶结合物孔中吸取100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体酶结合物溶液至反应孔进行反应，25°C下,反应30min后移除液体；9.重复步骤7;10.用精密加液器从底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反应孔中反应10 15min ；11.用精密加液器从终止液孔中吸取100 μ L的终止液加注至反应孔中，I IOmin内于450nm和630nm双波长条件下进行检测，读取OD值。实施例六通过全自动分析仪实现对样本中幽门螺杆菌抗体IgG检测的分析操作流程进一步的，本发明申请所述的检测方法还包括相应配合使用的全自动分析仪，该全自动分析仪包括一个分析装置托盘，它是与分析装置的形状相配套的，一共有30个位置可供分析装置放置，用于检测分析，此外还包括模块式集成机械电子结构及软件控制系统，可实现自动化的加注、稀释、孵育、洗涤、读数、分析过程。每个位置独立定量分析，保证结果的准确性。仪器运行后，分析装置托盘会自行转动到不同的位置进行加注，稀释，孵育，洗涤以及读数的步骤。具体的操作包括如下的步骤:(I)检查程序的准备:按要求配置好相应的溶液，包括洗涤缓冲液，清洗液或消毒液，配制完毕装入相应的液体瓶中；(2)与外接计算机相连:仪器和外接计算机相连，从而将仪器正常工作所得结果交由集中式系统处理；(3)开机:打开仪器开关后，通过外接计算机的工作界面对仪器设置自动或手动自检，从而为仪器的正常运行做准备；(4)预热:在开机后，仪器会启动加热程序，将温度调至待检温度；
(5)冲洗检查；(6)幽门螺杆菌抗体IgG的检测:I)从有密封口的一边打开包装袋，取用所需数量的分析试剂装置，排除空气后将袋口封紧；2)检查分析试剂装置TMB底物孔中的溶液，应为无色泽改变，否则应弃掉；3)分别在每个分析试剂装置的样本孔中加50 120 μ L未稀释的样本，建议加100 μ L的样本，每更换一个批号的试剂，应取其中一个分析试剂装置及校准品进行仪器校准；4)按照所需检测的数量在分析装置托盘中放入相对应数量的分析试剂装置，点击“开始”、“扫描”，仪器可自动地扫描分析试剂装置条码、质控物条码和校准品条码，然后对样本进行编号，或通过外部条码扫描仪对样本条码进行扫描；5)点击“运行”，仪器根据条码信息自动运行，根据条码，程序首先检测校准品，通过校准，修正标准曲线；其次对质控物进行检测，如果其检测结果在标示的范围内，则表示检测的标准曲线符合要求，可用于样本的检测，最后开始样本的检测程序；6)稀释:加注针刺破孔位密封薄膜自动吸取稀释液360 μ L到稀释孔中，并移除稀释液孔中的剩余液体，再从稀释孔中吸取稀释液180μ L回稀释液孔，加注针从样本孔自动吸取样品20 μ L到稀释液孔进行样本稀释，再从稀释液孔中吸取20 μ L到稀释孔，动作完成后，被稀释的样本被加注针移至反应孔孵育30 60min，通常仪器设定为60min，之后移除液体；7)洗涤:冲洗针从相应的液瓶中吸取一定量的洗涤缓冲液对试剂孔进行三到五次洗涤后移除液体；8)加注针刺破酶结合物孔密封薄膜吸取IOOyL辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体酶结合物溶液至反应孔进行反应，反应30 60min后移除液体，通常仪器设定为30min ；9)重复步骤7);10)加注针刺破TMB底物孔密封薄膜吸取100 μ L的TMB底物至反应孔反应10 20min,通常仪器设定为IOmin ；11)加注针刺破终止液孔密封薄膜吸取100 μ L的终止液加注至反应孔，在I IOmin内于450nm/630nm双波长下读取OD值。(7)检测结果:当检测程序运行完毕，可通过计算机上的数据处理软件分析，最后生成报告单以便查阅；(8)关机:检测结束后，在仪器关机前，必须启动清洗循环，这样可以避免来自溶液中的残留盐份在液路中结晶，避免损坏仪器或导致检测结果无效，清洗完成后，仪器电源自动关闭。实施例七患者样本中幽门螺杆菌抗体IgG的检测应用、结果分析以及检测的质控采用实施例五的操作方法与程序，使用实施例四所述的试剂盒，可用于定量测定人血清或血浆中的幽门螺杆菌抗体IgG水平。检测血清中特异性抗体可以反映病原体的感染情况。幽门螺杆菌抗体(即血清抗体)主要之一是IgG，血清抗体可反映机体对幽门螺杆菌的感染及免疫应答能力。可根据检测的结果来辅助临床诊断，初步判断患者患病的情况，最终确诊应结合临床表现或其他诊断方法/指标进行综合考虑。以下为检测结果的分析:(I)参考值(参考范围)正常参考值:0 10AU/mL ;检测一定数量(具有统计学意义)的阴性样本，结果的平均值加3倍标准偏差(即X+3SD)为参考值的上限。各实验室可根据实际情况建立适宜的参考范围。(2)检测结果的解释若样本值> 10AU/mL，提示抗体水平升高，但应结合临床表现或其他诊断方法/指标进行确诊。为了方便临床应用，可参考如下判断规则:样本值< 8AU/mL阴性8AU/mL彡样本值彡12AU/mL 可疑样本值> 12AU/mL阳性当检测结果为可疑时，应重新检测，若仍为可疑，需在2 3周后重新采集样本检测。
以下是将实施例六的检测过程重复检测阳性和阴性质控血清，检查结果的再现性，获得如下的结果:
阳性质控物
编号检测值 I 结果 I I编号检测值结果
1— 83.9P6107.1P
2— 98.2P793.7P
3— 97.4P885.8P
4— 81.5P989.2P
5— 108.3P1095.6 ~ P
测定结果均值为94.1AU/raL，CY%=9.7%。
阴性质控物
13.5 N II 6I 3.1N
2— 4.0 N74.1~ N
3— 3.8 NB3.9~ N
4— 3.7 N93.4~ N
5— 3.6 N103.3~ N
测定结果均值为3.6 AU/mL, CV%=8.9%
实施例八患者样本中幽门螺杆菌抗体IgA的检测应用、结果分析以及检测的质控采用实施例五的操作方法与程序，使用实施例四所述的试剂盒，可用于定性检测人血清或血浆中的幽门螺杆菌抗体I gA水平。检测血清中特异性抗体可以反映病原体的感染情况。幽门螺杆菌抗体(即血清抗体)主要之一是IgA，血清抗体可反映机体对幽门螺杆菌的感染及免疫应答能力。可根据检测的结果来辅助临床诊断，初步判断患者患病的情况，最终确诊应结合临床表现或其他诊断方法/指标进行综合考虑。以下为检测结果的分析:(I)参考值(参考范围)正常参考值:0 1.0。(2)检测结果的解释若样本值> 1.0，提示抗体水平升高，但应结合临床表现或其他诊断方法/指标进行确诊。为了方便临床应用，可参考如下判断规则:样本值<0.9阴性0.9≤样本值≤1.1 可疑样本值> 1.1阳性当检测结果为可疑时，应重新检测，若仍为可疑，需在2 3周后重新采集样本检测。以下是将实施例六的检测过程重复检测阳性和阴性质控血清，检查结果的再现性，获得如下的结果:
阳性质控物
权利要求
1.一种检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置，其特征在于:所述的试剂装置为长条状，包括具有八个孔位的基体和位于基体一端的手柄，八个孔位的排列顺序从近手柄端开始依次为样本孔、辅剂孔、酶结合物孔、底物孔、终止液孔、稀释液孔、反应孔和稀释孔，样本孔内盛有待测样本，辅剂孔供检测有需要时加入辅助试剂使用，酶结合物孔内盛有酶结合物溶液，底物孔内盛有底物溶液，终止液孔内盛有终止液，稀释液孔内盛有稀释液，反应孔为平底且具有高的光通透性，孔内包被有幽门螺杆菌抗原，并作为反应容器加注待测的液体样本和检测试剂及洗涤液，反应终止后进行吸光度测定，稀释孔作为样本稀释容器，供稀释样本时用。
2.根据权利要求1所述的试剂装置，其特征在于:所述的试剂装置中，当检测幽门螺杆菌抗体gIG时，辅剂孔内不加入任何试剂，当检测幽门螺杆菌抗体IgA时，吸附剂加入辅剂孔内或与稀释液一起加入稀释液孔中。
3.根据权利要求1所述的试剂装置，其特征在于:所述的试剂装置中，辅剂孔、酶结合物孔、底物孔、终止液孔和稀释液孔上覆盖有密封薄膜。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂装置，其特征在于:所述的手柄上粘贴有条形码，该条形码标识有幽门螺杆菌抗体检测试剂及分析装置的相关信息。
5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂装置，其特征在于:所述试剂装置还包括若干个支撑柱，所述的支撑柱位于所述试剂装置中基体的下面，相邻支撑柱之间间隔有一个以上的孔位。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂装置，其特征在于:所述试剂装置中反应孔由外孔和内孔构成，外孔的底部开有底孔，内孔穿过底孔且与底孔紧配合，外孔和内孔之间留有防溢腔。
7.根据权利要求1-3任一项所述的试剂装置，其特征在于:所述试剂装置中反应孔的内孔包被的幽门螺杆菌抗原包括纯化且灭活的幽门螺杆菌或重组的幽门螺杆菌。
8.利用权利要求1-7所述的试剂装置进行幽门螺杆菌抗体检测的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤: 1)在所述的样本孔中加入未稀释的样本； 2)从稀释液孔中吸取稀释液加入稀释孔中； 3)移除稀释液孔中的剩余液体，从稀释孔中吸取部分液体回稀释液孔； 4)从样本孔中吸取样本加入稀释液孔中,将样本进行稀释； 5)从稀释液孔中吸取液体加入稀释孔中，将样本进行进一步的稀释； 6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，从辅剂孔吸取液体加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤； 7)从稀释孔中吸取液体加入反应孔中，25 37°C的条件下，孵育30 60min； 8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体； 9)从酶结合物孔中吸取酶结合物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应30 60min后移除液体； 10)重复步骤8)； 11)从底物孔中吸取底物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应10 20min； 12)从终止液孔中吸取终止液加入反应孔中，I IOmin内于450nm读取OD值，或选择双波长法测定，波长范围在620nm 690nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤: 1)在所述的样本孔中加入未稀释的样本，体积至少为样本孔容量的1/4； 2)从稀释液孔中吸取稀释液加入稀释孔中，吸取的量为孔内液体总量的7/10以上； 3)移除稀释液孔中的剩余液体，根据预期稀释倍数从稀释孔中吸取部分液体回稀释液孔； 4)从样本孔中吸取样本加入稀释液孔中，将样本进行稀释，稀释倍数为I 10倍； 5)从稀释液孔中吸取液体加入稀释孔中，将样本进行进一步的稀释，稀释倍数为1 100 倍； 6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，从辅剂孔吸取液体加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤； 7)从稀释孔中吸取液体加入反应孔中，25 37°C的条件下，孵育30 60min； 8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体； 9)从酶结合物孔中吸取酶结合物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应30 60min后移除液体； 10)重复步骤8)；11)从底物孔中吸取底物溶液加入反应孔中，25 37°C的条件下，反应10 20min； 12)从终止液孔中吸取终止液加入反应孔中，1 1Omin内于450nm读取OD值，或选择双波长法测定，波长范围在620nm 690nm。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤: 1)在所述的样本孔中加入样本80 150μ L ; 2)用精密加液器从稀释液孔中吸取360μ L液体到稀释孔中； 3)移除稀释液孔中的剩余液体，从稀释孔中吸取ISOyL液体回稀释液孔； 4)用精密加液器从样本孔中吸取20μ L液体到稀释液孔中，样本10倍稀释； 5)用精密加液器从稀释液孔中吸取液体20μL到稀释孔中，样本100倍稀释； 6)当检测幽门螺杆菌抗体IgA且辅剂孔内加入吸附剂时，用精密加液器从辅剂孔吸取液体30 μ L加入反应孔中，其他情况则不需要此步骤； 7)用精密加液器从稀释液孔中吸取液体100μ L到反应孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液体； 8)用洗涤液对反应孔进行3 5次洗涤后移除液体； 9)用精密加液器从酶结合物孔中吸取100μ L辣根过氧化物酶标记的抗体酶结合物溶液至反应孔进行反应，25 37°C下，反应30min后移除液体； 10)重复步骤8)； 11)用精密加液器从底物孔中吸取1OOμL的TMB底物溶液至反应孔中反应10 15min ； 12)用精密加液器从终止液孔中吸取100μ L的终止液加注至反应孔中，1 1Omin内于450nm和630nm双波长条件下进行检测，读取OD值。
全文摘要
本发明申请公开一种检测幽门螺杆菌抗体的试剂装置及其方法，所述的试剂装置为长条状，包括具有八个孔位的基体和位于基体一端的手柄，八个孔位的排列顺序从近手柄端开始依次为样本孔、辅剂孔、酶结合物孔、底物孔、终止液孔、稀释液孔、反应孔和稀释孔。本发明申请基于酶联免疫检测的原理，利用上述的试剂装置对幽门螺杆菌抗体进行检测，是一种独立的、单人份的分析检测方法，并且可以与相应的特定分析仪器配合使用，在检测过程中，用全自动的精密加液器来加注检测试剂或样本，具有操作自动化，加量精确，检测结果的准确度和精密度高的优点，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N33/569GK103185793SQ20111045183
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者胡德明, 刘清波, 何林, 阳辉 申请人:深圳市亚辉龙生物科技有限公司