专利名称：用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的LSPR传感芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型属于肿瘤细胞中质粒DNA含量的检测技术领域，涉及一种用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的传感芯片。
背景技术：
C-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进程中起重要作用。由C-myc基因编码的C-myc重组蛋白不仅在细胞生命活动如细胞增殖、细胞分化和细胞周期中有极其重要的作用，而且还密切地参与了细胞肿瘤的转化。C-myc重组蛋白的表达与很多癌组织和细胞肿瘤的启动及癌性程度密切相关。目前针对质粒DNA的检测方法分别有水平琼脂糖凝胶电泳法和传统的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法，并没有专门针对含致癌基因 C-myc抗原片段的质粒DNA的检测装置。上述方法操作繁琐、精度低，仅能做到定性或半定量，且抗干扰性、选择性不足，使其应用受到限制。因此需要寻找一种能够快速定量地检测含C-myc抗原片段的质粒DNA的装置。本实用新型提供了一种基于金纳米粒子的局域表面等离子体共振(LSPR)光谱技术的生物传感检测芯片，能简便、快速、定量地检测癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量。
实用新型内容本实用新型要解决的技术问题是提供一种检测含C-myc抗原片段的质粒DNA的 LSI^R芯片装置。该装置是一种基于金纳米颗粒局域表面等离子体共振(LSPR)光谱技术的生物传感检测芯片。该芯片能实现操作简便、定量快速、灵敏地检测癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量。为解决上述问题，所述芯片的组装结构自基质(聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃)表面到最外层依次为厚度均勻的金膜、DTT单分子层、金纳米粒子层、3-巯基丙酸单分子层、 C-myc单克隆抗体，具体组装过程如下采用磁控溅射镀膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面镀上一层金膜(30 300nm)，通过控制镀膜真空度彡1. 0 X 10_3Pa，镀膜速度彡1.0 A，使金膜表面平整光滑，形成金平板电极。然后将Piranha溶液(注Piranha溶液为浓硫酸双氧水=7 3的溶液)滴加在金平板电极金膜表面浸润5 30s，取出用二次蒸馏水反复冲洗3次处理后，将上述电极依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声5 600s。然后将上述电极浸入10 200mmol/L的1，4-二硫苏糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 M h，可在金膜表面组装上一层DTT单分子膜层。分别用无水乙醇、二次蒸馏水反复冲洗后，将上述电极浸入纳米金溶胶溶液(粒径大小为5 50nm)中放置1 Mh，这样金纳米粒子可通过Au-S键固定在金平板电极金膜表面形成金纳米粒子层，用二次蒸馏水反复冲洗干净，并保存于二次蒸馏水中[0007]将上述电极浸入0. 1 lOOmmol/L的3.巯基丙酸中，静置1 24 h，可在金纳米粒子层表面修饰上3-巯基丙酸单分子层；用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加1 200mmol/ L DMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP为4- 二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于电极上活化1 30min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。经过DMAP-EDC活化，在上述电极上滴加0 2. 6 μ g/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应3 600min后，使3-巯基丙酸与C-myc单克隆抗体键合，C-myc单克隆抗体的吸附量范围为 0. 01 0. 4g-mr1 ·πιπΓ2 ；再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4°C环境中备用，即得C-myc单克隆抗体修饰的Lsra传感芯片。在测量过程中首先将LSra传感芯片置于样品工作台上，在所述工作台上有固定反射探针光纤的悬臂支架，所述反射探针光纤包含入射光纤和读出光纤结构，其中的一分支与碘钨灯光源相连接，另一分支与光谱仪相连接；所述反射探针光纤可把所述光源产生的光传输到传感芯片上，并接收反射回的光信号至所述光谱仪，所述光谱仪再与计算机相连接，构成一个信号识别系统。其检测的原理如下所述当入射光照射传感芯片，入射光子频率与金纳米粒子上的自由电子的集体振动发生共振时，导致金纳米粒子表面的局部电场被增强，反射光能量增强，从而展现出强烈的表面等离子体吸收，其局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200 700nm之间。当 C-myc单克隆抗体与含C-myc抗原片段的质粒DNA结合后，等离子体共振频率变小，共振吸收峰向长波方向移动，该峰位移与待测含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量在6. 5X 10_3 1.3 μ g/mL范围内成线性响应关系，检测下限达到6. 5ng/mL，可实现在线动态监测、快速定量检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA分子的目的。同时，所述LSTO传感芯片对癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量能进行准确测定，其回收率为92. 31 109. 23%。在癌症疾病预测和治疗等生物医学方面具有非常重要的应用前景和经济价值。本实用新型的有益效果是，与传统的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)装置相比，该LSI3R传感装置操作简便，能实现快速、定量、灵敏地检测癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量，在癌症疾病预测和治疗等生物医学方面具有非常重要的应用前景和经济价值。
图1是LSra传感芯片组装结构示意图。图2是LSI3R传感芯片组装膜层直观图。图3是基于金纳米粒子的局域表面等离子体共振光谱检测图。图4是传感芯片的局域表面等离子共振吸收峰位移与含C-myc抗原片段的质粒 DNA的浓度的关系曲线图，其在9.0X 10_3 μ g/mL 1.5 μ g/mL范围的标准曲线(见图4内插图)方程为Δ λ = 0. 00948+1. 38723C其中Δ λ表示为最大吸收峰位移值(nm)，C表示含C-myc抗原片段的质粒DNA的浓度(μ g/mL)。上述关系曲线是在室温25°C时绘制的。图5是典型质粒DNA的pCMV-myc片段碱基序列图。
4[0019]图6是标尺为200nm的典型金纳米粒子的TEM图。图7是标尺为IOOnm的典型金纳米粒子的TEM图。图1、2中1.厚度均勻的金膜，2. DTT单分子层，3.金纳米粒子层，4. 3_巯基丙酸单分子层，5. C-myc单克隆抗体，6.含Ciyc抗原片段的质粒DNA。
具体实施方式
本实用新型通过固定于LSra传感芯片上的c-myc单克隆抗体与含C_myC抗原片段的质粒DNA的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子层表面产生局域表面等离子体共振光谱吸收峰的位移，与含C-myc抗原片段的质粒DNA含量成线性响应关系，从而达到含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的检测目的。实施例1LSPR传感芯片的组装制备1)采用磁控溅射镀膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面镀上一层IOOnm 的金膜，通过控制镀膜真空度为1.0 X 10_4Pa，镀膜速度为1.0 A/S，使所述金膜表面平整光滑，形成金平板电极；2)将Piranha溶液(注=Piranha溶液为浓硫酸双氧水=7 3的溶液)滴加在金平板电极表面浸润15s，取出后用二次蒸馏水反复冲洗3次；3)将上述电极依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声60s ；4)将上述电极浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT单分子层，用无水乙醇反复冲洗3次以去除表面游离的DTT，再用二次蒸馏水反复冲洗干净；5)将上述电极浸入粒径为10. 5nm的纳米金溶胶中，放置Mh，取出后用二次蒸馏水反复冲洗干净，这样金纳米粒子通过Au-S键固定在金平板电极金膜表面形成金纳米粒子层，然后保存于二次蒸馏水中备用；6)将上述电极浸入lOmmol/L的3-巯基丙酸中，静置他，在金纳米粒子上形成
3-巯基丙酸单分子层，然后用二次蒸馏水冲洗干净；7)用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加lOOmmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP为
4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于电极上活化lOmin， 再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；8)在上述电极上滴加2. 4μ g/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应60min后，再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4°C环境中备用，即制得用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的C-myc单克隆抗体修饰的LSI3R传感芯片。实施例2含C-myc抗原片段的质粒DNA标准曲线的测定1)所用试剂(二次蒸馏水、PBS缓冲溶液)经灭菌处理后均保存于4°C环境中备用；2)取1 μ L质粒DNA置于1. 5mL小试管中，以PBS为缓冲溶液，分别稀释1 100000 倍，配制成0 1. 5 μ g/mL的一系列溶液备用；3)采用上述C-myc单克隆抗体修饰的LSI3R传感芯片分别测试各浓度的质粒DNA 样品，通过C-myc单克隆抗体与含C-myc抗原片段的质粒DNA的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子局域表面等离子体共振光谱吸收峰红移，该峰位移与质粒DNA含量成线性响应关系；以质粒DNA的浓度C(yg/mL)为横坐标，最大吸收峰位移值Δ λ (nm)为纵坐标，绘制测定质粒DNA样品浓度的标准曲线(见图4内插图)，通过质粒DNA对应浓度的LSI3R吸收峰位移信号，即可测定出癌变组织样品中的含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量；4)测试完后，用0. lmol/L HCl溶液洗脱回复，再分别用PBS缓冲溶液、二次蒸馏水冲洗干净，可保存于4°C环境中备用。实施例3大肠杆菌中含C-myc抗原片段的质粒DNA浓度的测定本实施例采用碱裂解法提取大肠杆菌中含C-myc抗原片段的质粒DNA，具体操作方法如下1、取含质粒的大肠杆菌细胞于aiil LB培养基，37°C振荡培养过夜，取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。2、加 0. Iml 溶液 1(1%葡萄糖，50mM/L EDTApH8. 0,25mM/L Tris-HCl pH8. 0)充分混合。加入0. 2ml溶液II (0. 2mM/L NaOH, 1 % SDS)，轻轻翻转混勻，置于冰浴5min。加入 0. 15ml预冷溶液III (5mol/L KAc, ρΗ4· 8)，轻轻翻转混勻，置于冰浴5min。3、以IOOOrpm离心20min，取上清液于另一新Ep管，再加入等体积的异戊醇，混勻后于0°C静置lOmin，再以IOOOrpm离心20min，弃上清，用70% 7醇0. 5ml洗涤一次，抽干所有液体，待沉淀干燥后，溶于0. 05mlTE缓冲液中。4、将上述处理好的质粒DNA待测液滴在传感芯片表面反应Imin后用二次蒸馏水冲洗。再次记录读数。每个吸收峰响应值(Δ λ，nm)可由下式得出Δ λ = λ 1-λ2，把 Δ λ代入到图4的标准曲线方程中，即可算出待测液中含C-myc抗原片段的质粒DNA的浓度值，检测结果表明该传感芯片检测装置可以用于质粒DNA含量快速、准确的检测。实施例4回收率的测定本实施例测定质粒DNA传感芯片对响应不同浓度质粒DNA溶液的回收率，并与传统生物学上的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)装置进行比较。 在已知浓度溶液中加入已知量的含C-myc抗原片段的质粒DNA样品溶液(300ng/mL、500ng/ mL和1800ng/mL)，然后测定各样品的吸收峰，计算位移值Δ λ，对照标准曲线找出浓度，比较测得的加入量和实际加入量，获得的回收率分别为93. 33%U06. 00%和101. 67%，平均回收率为100. 33%，而ChIP装置仅能做出定性检测，说明本实用新型优于ChIP装置，且回收率好，在含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA检测方面具有实际应用价值。实施例5重现性的测定在上述的传感芯片上，固定C-myc单克隆抗体的传感膜对响应不同浓度的质粒 DNA溶液的出峰位置的重现性，本实施例测定LSra传感芯片对响应不同浓度含c-myc抗原片段的质粒DNA溶液的吸收峰位置的重现性，对0.6 μ g/mL和1.5yg/mL样品重复测定12次，通过对数据的分析处理，获得的相对标准偏差分别为3. 70%和1.08%，说明该方法有着良好的重现性，确保了所测实验数据的准确性。
权利要求1.一种用于检测含致癌基因c-myc抗原片段的质粒DNA(6)的LSTO传感芯片，其特征在于所述芯片的组装结构自聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面到最外层依次为厚度均勻的金膜(1)、DTT单分子层O)、金纳米粒子层(3)、3_巯基丙酸单分子层(4)、C-myc单克隆抗体(5)。
2.根据权利要求ι所述的Lsra传感芯片，其特征在于所述金膜(1)的厚度为30 300nmo
3.根据权利要求1所述的Lsra传感芯片，其特征在于所述金纳米粒子的粒径范围为 5 50nmo
4.根据权利要求1所述的LSra传感芯片，其特征在于所述C-myc单克隆抗体(5)的吸附量范围为 0. 01 0. 4g · ml/1 · mm_2。
5.根据权利要求1所述的LSra传感芯片，其特征在于所述金纳米粒子层(3)表面所展现的局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200 700nm之间。
专利摘要本实用新型提供了一种检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的LSPR传感芯片，即一种基于金纳米颗粒的局域表面等离子体共振(LSPR)光谱技术的生物传感检测芯片，所述芯片的组装结构自聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面到最外层依次为厚度均匀的金膜(1)、DTT单分子层(2)、金纳米粒子层(3)、3-巯基丙酸单分子层(4)、C-myc单克隆抗体(5)，通过已固定于LSPR传感芯片上的C-myc单克隆抗体(5)与含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的免疫结合反应达到检测的目的。该芯片能实现操作简便、定量快速、灵敏地检测癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的含量，优于传统的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)装置，在癌症疾病预测和治疗等生物医学方面具有非常重要的应用前景和经济价值。
文档编号G01N33/577GK202033369SQ20112000010
公开日2011年11月9日 申请日期2011年1月4日 优先权日2011年1月4日
发明者何婧琳, 孙立贤, 张玲, 戴云林, 曹忠, 曾巨澜, 王明星, 黄茜茜 申请人:长沙理工大学