专利名称：尿中ii型胶原降解产物检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医疗器械领域，具体地是涉及一种尿中Ii型胶原降解产物检测试齐U盒。
背景技术：
软骨结构完整性的损伤是骨关节炎和类风湿关节炎的主要组织学表现。II型胶原蛋白是软骨的主要有机成分。软骨降解后，II型胶原蛋白的片段(CTX-II)释放进入循环系统，随后排入尿中。尿中的CTX-II片段可由尿中II型胶原降解产物检测试剂盒定量检测。据报道，尿中II型胶原降解产物检测有助于预测骨关节炎的发展及其它临床和临床前研究。目前，还没有特异性和灵敏度较高的酶联免疫法检测试剂盒。
实用新型内容本实用新型的目的之一是提供一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及包被有链菌抗生物素蛋白层的微孔板； 所述试剂瓶包括装有浓度为4. 5-5. 5 μ g/ml的生物素标记的CTX-II抗原溶液试剂瓶，和 CTX-II单克隆抗体滴度为1 950-1 1050的CTX-II单克隆抗体溶液试剂瓶。所述检测试剂盒还包括有1瓶装有TRIS缓冲溶液标准品的试剂瓶，5瓶分别具有 CTX-II合成肽的试剂瓶，2瓶分别具有尿CTX-II质控品的试剂瓶，1瓶具有过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白的试剂瓶，1瓶具有底物溶液的试剂瓶，1瓶具有终止液的试剂瓶和 1瓶具有冲洗液的试剂瓶。进一步地，还包括有用于检测时密封微孔板的封口膜。本实用新型所述试剂盒采用酶联免疫法，基于一种单克隆抗体对尿II型胶原片段，或对结合于链霉抗生物素蛋白包被的微孔内表面的生物素标记合成肽的竞争性结合。首先，生物素标记的合成肽结合于包被有链霉抗生物素蛋白的微孔板内表面。清洗之后，加入标准品、质控品和尿样，然后加入单克隆抗体溶液。再次清洗，并加入过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白。再次清洗后，加入生色底物，用硫酸终止显色反应并测定吸光度。本实用新型所述的尿II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
图1是本实用新型实施例1所述盒体与下凹瓶位的的结构示意图；图2是本实用新型实施例1所述微孔板的结构示意图；图3是本实用新型实施例1所述微孔板的结构示意图。
具体实施方式
实施例1(一)、本实施例所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒的主要组成成份如下参见图1-图3，所述尿胶原降解产物检测试剂盒的盒体1内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14个下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置装有溶液的试剂瓶；位于塑料框架3中的微孔板4，微孔板4中的微孔5内包被有链霉抗生物素蛋白层。具体组成如下1.链霉抗生物素蛋白包被的微孔板具有链霉抗生物素蛋白包被层的条形微孔板(12条Χ8孔)，置于框架中。2.尿 CTX-II 标准品 0具有可直接使用的含有蛋白质稳定剂、去污剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液，1瓶(至少 3. OmL)。3.尿 CTX-II 标准品 1-5具有可直接使用的合成肽(溶于含蛋白质稳定剂、去污剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液中)，合成肽的准确浓度标在各瓶上。5瓶(至少0. 4mL/瓶)。4.尿 CTX-II 质控品具有可直接使用的合成肽(溶于含有蛋白质稳定剂、去污剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液中)，2瓶(至少0. 4mL)。5.生物素标记的尿CTX-II抗原可直接使用的生物素标记合成肽1瓶(至少12. OmL)。6. 一抗体溶液可直接使用的单克隆抗体(溶于含蛋防腐剂和红色染料的TRIS缓冲溶液中)1瓶 (至少 12. OmL)。7.过氧化物酶偶联抗体可直接使用的过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白(溶于含防腐剂和蓝色染料的TRIS缓冲溶液中)1瓶(至少12. OmL)。8.底物溶液可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)。1瓶(至少12. OmL)。9.终止液可直接使用的0. 18M硫酸溶液。1瓶(至少12. OmL)。10.清洗溶液(50 X)含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。1瓶(至少20. OmL)。11.封口膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。所述试剂盒的制备如下一)标准品与质控品1)来源[0042]CTX-II 合成肽冻干粉购自 Nordic Bioscience Diagnostic A/S 公司。2)质控品制备将CTX-II合成肽冻干粉与lOmmol/L的TRIS缓冲液混合，质控品1中CTX-II浓度约为1. 50 μ g/L，质控品2中CTX-II浓度约为4. 50 μ g/L，并加入10A的BSA和0. 018 % 的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，各取0. 4mL分装，4°C密封保存。3)标准品制备标准品0取3mL浓度l(toimol/L的TRIS缓冲液，加入1 %的BSA和0. 018 %的 Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。标准品1-5取CTX-II合成肽冻干粉，分别用lOmmol/L的TRIS缓冲液稀释至 CTX-II 浓度为 0. 75μ g/L、l. 25 μ g/L,2. 50 μ g/L,5. 00 μ g/L 和 10. 00 μ g/L。各取 0. 4mL 分装，4°C密封保存。二)生物素标记的CTX-II抗原取CTX-II合成肽25mg，与IOmL浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液；取浓度为1. 25mg/mL的生物素，抗原稀释液生物素=1 4体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与CTX-II合成肽交联；取制备后的生物素标记的CTX-II抗原，加入
的BSA和0. 018%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存，所述CTX-II抗原浓度为 5μ g/ml。三)一抗溶液1)抗体制备取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔5-8处部位进行免疫接种，初次免疫注射lmg/mL浓度的CTX-II抗原0. 2mL，第3周、第4周及第5周注射lmg/mL浓度的CTX-II 抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0. 4mL。拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入含有1 %的BSA、 0.1% Tween 20和0. 0075%的Bronidox的溶液5L做为防腐剂和稳定剂，4°C密封保存。2) 一抗溶液制备取制备后的CTX-II单克隆抗体，用10mmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入红色素做为显色剂，其浓度为0. 03mg/ml，取12mL分装，4°C密封保存，所述CTX-II 单克隆抗体滴度为1 1000。一抗浓度的选择稀释度测定先将0. Iml的生物素标记抗原加入预包被链酶抗生物素蛋白的微孔板，洗涤后加一系列不同稀释度(1 1000,1 2000,1 3000， 1 4000,1 5000,1 6000)的一抗进行孵育，洗涤后加入0. Iml的过氧化物酶偶联抗体孵育，洗涤后加底物显色，加终止液终止反应。在酶标比色计中测定不同稀释度的一抗OD 值，选择OD值> 1.0的那个一抗稀释度即为一抗的使用浓度。最终确定一抗的最佳工作浓度为 1 1000。四)过氧化物酶偶联抗体通用鼠抗兔IgG冻干粉购自英国Abcam公司。取鼠抗兔IgG冻干粉0. Ig,与IOmL 浓度为lOmmol/L的TRIS缓冲液混合。取HRP固体用去离子水稀释为5mg/mL，采用简易过碘酸钠法将HRP与鼠抗兔IgG交联。取制备后的鼠抗兔IgG，用lOmmol/L的TRIS缓冲液和25mol/L的EDTA混合，加入蓝色素做为显色剂，蓝色素的浓度为0. 08mg/ml，再加入1 %的BSA,0. 的Tween20和0. 0075%的Bronidox 5L做为防腐剂和稳定剂，取12mL分装， 4°C密封保存。所述酶偶联抗体的工作滴度为1 5000。五)其他预包被链菌抗生物素蛋白的微孔板、底物液、终止液和冲洗液均由其他商业公司提供。实施例2 运用实施例1所述的试剂盒对尿中II型胶原降解产物检测使用前，将所有溶液平衡至室温(1822°C )。确定实验所需微孔板数量。每一样本设两个平行孔。另外，每轮实验共需要14孔用于标准品和质控。将适当数量的微孔板置于塑料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。具体包括以下步骤1)预孵育向各孔加入100 μ L生物素标记的尿CTX-II抗原，用封口膜密封，室温(18_22°C ) 下孵育30士5分钟，不要震荡。2)清洗清洗缓冲溶液(50X)以1体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。手工清洗微孔板5次。使用自动洗板机，通常清洗5次。确保每次手工或自动清洗后将微孔中的溶液倒干净。3) 一次孵育向适当的孔中加入40yL尿CTX-II标准品(0_5)，质控品或待测尿样，再加入 IOOyL—抗体溶液。用封口膜密封微孔板，在冰箱中孵育21 士 3小时，不要震荡。4)清洗见第2步。5) 二次孵育向各孔加入IOOyL过氧化物酶偶联抗体溶液。用封口膜密封微孔板，室温 (18-22°C )下孵育60士5分钟，不要震荡。6)清洗见第2步。7)与生色底物溶液孵育向各孔加入100 μ L底物溶液，用封口膜密封，室温(18-22°C )下避光孵育15 士 2 分钟，不要震荡。8)终止显色反应向各孔加入100 μ L终止溶液。9)测定吸光度在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度。检测范围如果待测样本的吸光度低于标准5，建议用标准品0稀释样本并重新分析。质量控制参考值(参考范围)各类人群的平均值和标准偏差举例如下。
权利要求1.一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及包被有链菌抗生物素蛋白层的微孔板；所述试剂瓶包括装有浓度为4. 5-5. 5μ g/ml的生物素标记的CTX-II抗原溶液试剂瓶，和CTX-II单克隆抗体滴度为1 950-1 1050的CTX-II单克隆抗体溶液试剂瓶。
2.根据权利要求1所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，所述检测试剂盒还包括有1瓶装有TRIS缓冲溶液标准品的试剂瓶，5瓶分别具有CTX-II合成肽的试剂瓶，2瓶分别具有尿CTX-II质控品的试剂瓶，1瓶具有过氧化物酶偶联的兔抗鼠免疫球蛋白的试剂瓶，1瓶具有底物溶液的试剂瓶，1瓶具有终止液的试剂瓶和1瓶具有冲洗液的试剂瓶。
3.根据权利要求1或2所述的尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，其特征是，还包括有用于检测时密封微孔板的封口膜。
专利摘要本实用新型公开了一种尿中II型胶原降解产物检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及包被有链菌抗生物素蛋白层微孔板；所述试剂瓶包括装有浓度为4.5-5.5μg/ml的生物素标记的CTX-II抗原溶液试剂瓶，和CTX-II单克隆抗体滴度为1∶950-1∶1050的CTX-II单克隆抗体溶液试剂瓶。所述尿中II型胶原降解产物检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。
文档编号G01N33/543GK201945595SQ20112004794
公开日2011年8月24日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者郭志程 申请人:广州固康生物科技有限公司