专利名称：一种甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的联检试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医学检验领域，尤其涉及一种甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸。
背景技术：
流行性感冒，通常称为“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有很强的传染性，主要通过咳嗽和打喷嚏传播，一般春季和冬季爆发。分为A型(甲型)流感病毒、B型(こ型)流感病毒和C型(丙型)流感病毒。甲型流感病毒具有极强的变异性，乙型病毒次之，而丙型病毒则非常稳定，故甲型病毒和こ型病毒的检测尤为重要。根据统计，全球毎年的流感病例为6-12亿，其中重症流感为300-500万例，死亡 25-50万人，重症流感的病死率可达8% -10%。目前美国毎年流感导致的死亡人数超过车祸和艾滋病造成的死亡人数，在我国和发展中国家已成为严重危害人类健康的头号大故。我国是流感的高发区，流感的流行或局部暴发基本上毎年都有，毎年有I亿多人遭受流感的困扰，到医院就医者超过50万人。现阶段检测流感病毒感染的方法主要包括病毒培养法、RT-PCR法以及胶体金免疫层析法。病毒培养是病毒检测的金标准，但这种检测方法周期很长，一般要3 7天的时间，灵敏度不高；RT-PCR能够4-8小时内对样本实现检测，且灵敏度和特异性很高，但是并不适于在机场、ロ岸、火车站、医院等人口密度大、人流量大、不易让人群长时间聚集的公共场所；胶体金免疫层析法由于不需要辅助的设备，方便的储运及操作简便非常适合在基层场所使用，但现阶段灵敏度不高，容易造成漏检，尚不能够区分病毒感染亚型。中国专利CN200910087632. 5公开了ー种属于病原体基因快速诊断领域的检测甲型HlNl流感病毒的专用引物和包括该引物的检测甲型HlNl流感病毒的试剂盒以及该引物所对应的靶序列。本实用新型的专用引物所对应的靶序列，该试剂盒利用基因反转录和等温扩增技术原理，对甲型HlNl病毒核酸进行快速检测，检测结果可肉眼判定，也可利用电泳进行分析。但是该方法耗时长，费用大，不利于大面积推广和民用化。中国专利CN200910085475. 4公开了ー种流感病毒rRT_PCR检测引物和探针及检测流感病毒的方法，包括甲型流感病毒特异性引物和探针、两组新甲型HlNl流感病毒Hl特异性引物和探针、新甲型流感病毒特异性引物和探针等，4种共12条寡核苷酸引物和探针序列，同时公开了待检样本处理、rRT-PCR反应体系及反应条件、结果分析。该方法的不足也是由于费用昂贵、需要专业的仪器和操作人员需要经过专业培训。故该方法也不适用于普及和民用化。同样的，专利号为CN200810022489. 7的专利公布了一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法、申请号为CN201110223913. 6的专利公布了甲型/こ型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒、申请号为CN201010171355.9的专利公布了人甲、こ型流感及新甲型HlNl流感病毒一管多检方法及试剂盒、申请号为201110149333. 7公布了双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用，这些方法都存在费用高、需要专业仪器、检测周期长的问题，不利于流感检测在家庭、在基层及更广泛人群中推广使用。申请号为CN200710040792的实用新型专利多联检测试剂盒公开了ー种多项联检的试剂盒，但是该试剂盒是有多条检测条组成的，虽然可以同步联检，但是没有达到最大降低一次性耗材消耗，不够环保。申请号为CN200910040975公布了一种用于检测甲型流感病毒及甲型HlNl流感病毒的核酸纳米金生物传感器，是通过玻璃纤维上涂有纳米金标记寡核苷酸探针以及在硝酸纤维素膜上固定两种寡核苷酸探针来检测目标物。但是因为流感会有甲型和こ型之分，该实用新型就不能实现同时检测的目的，而且，检测时间基本需要在半个小时以上。
实用新型内容本实用新型的目的在于解决现有技术中存在的流感病毒检测费用昂贵、检测周期 长、用纳米金灵敏度稍低、以及不能同时检测甲型和こ型流感病毒的缺陷，而提供一种新的甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸。为实现上述目的，本实用新型采取了以下技术方案一种甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸，所述试纸由样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-甲型或こ型流感病毒抗体；所述检测区包括包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线，所述质控区包被有羊抗兔抗体。优选地，所述包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线之间的距离为2-5mm。更优选地，所述包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线之间的距离为3. 5mm。为了解决信号扩大不足和不能同时检测两种分型的问题，本实用新型基于固相免疫层析原理，采用功能性彩色微球技术(胶体金颗粒标记技术)、微信号放大技术(亲和素-生物素体系和双抗体夹心反应体系)及联检技术检测人体分泌物中的流感病毒抗原。若样品中含有甲型流感病毒抗原或者是こ型流感病毒抗原，经玻璃纤维膜上的微信号级联系统将信号放大，使甲型/こ型流感病毒抗原与胶体金颗粒标记物结合，形成复合物，并扩散到硝酸纤维素膜上进ー步层析，当遇到包被在硝酸纤维素膜上检测区的Tl线或者T2线(分别为甲型或こ型流感病毒抗体包被线)处的配对抗体时，复合物则又和包被抗体結合，被捕获在包被处，当被捕获的复合物达到一定数量吋，则形成肉眼可见的T线，说明样品中含有甲型或こ型流感病毒抗体，若不出现，说明样品为阴性或含量低于试纸的最低检测限。控制区(C线)作为试纸的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果(I)本实用新型在现有检测试纸的基础上，添加了生物素-亲和素微信号级联放大系统，因而，在检测甲型/こ型流感病毒抗原的过程中，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检；同时，通过调整不同的制备エ艺參数，实现在同一条试纸条上两种分型的同时检测。(2)本实用新型的试纸条具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作ー步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(15分钟左右即可有结果)等优点，可实现对甲型/こ型流感病毒抗原现场和家庭自检；弥补现阶段层析试剂盒灵敏度不高及不能实现分型的缺陷，将能够最大限度地降低人群聚集感染的风险、在疫情现场减低疾病造成的危害；(3)本实用新型的试纸可以实现在一条纸条上同时检测甲型、こ型两种流感病毒，缩短了检测周期，減少因为单ー检测某种分型而漏检的现象，并节约了一次性耗材。
图I为本实用新型的甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸的结构示意图；附图标记1.样品垫；2.玻璃纤维膜；3.硝酸纤维素膜；4.吸水纸；5.底板；6.甲型流感病毒检测区；7.こ型流感病毒检测区；8.控制区。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本实用新型。实施例I本实用新型甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸如图I所示，为本实用新型所述的ー种甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸。包括样品垫I、与所述样品垫I 一端紧密相连的含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜2、与所述玻璃纤维膜2另一端紧密相连的硝酸纤维素膜3、以及与所述纤维素膜3的另一端紧密相连的吸水纸4，所述样品垫I、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4均设置于底板5上，所述硝酸纤维素膜3包括包被有甲型流感病毒抗体的检测线6、包被有こ型流感病毒抗体的检测线7和包被有羊抗兔抗体的控制区8，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-流感病毒抗体，其中流感病毒抗体为甲型流感病毒抗体或こ型流感病毒抗体。该实施例的试纸，胶体金颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为71 u g/cm2 ;胶体金颗粒-亲和素-生物素-こ型流感病毒抗体复合物在玻璃纤维膜2上的用量为75 u g/cm2 ;胶体金标记的兔IgG抗体在玻璃纤维膜2上的用量为35 ii g/cm2 ;甲型流感病毒抗体的原始浓度为3. 00mg/ml,こ型流感病毒抗体的原始浓度为3. 5mg/ml，包被到硝酸纤维膜3的检测区6和检测区7时的浓度分别为I. 2mg/ml和I. 3mg/ml,包被用量分别为0. 216 u g/mm和0. 234 u g/mm ;羊抗兔IgG抗体包被在控制区时的用量为0. 33 u g/mm。 该实施例的试纸的制备方法为在本实用新型中采用胶体金颗粒标记。其中胶体金颗粒的颗粒直径大小为纳米级(30 50nm)，胶体颗粒的吸附机理是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷集団，靠静电吸引而结合形成免疫诊断试剂。甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸的制备步骤如下I.制备甲/こ型流感病毒抗体利用常规方法用重组的甲/こ型流感抗原或灭活的流感抗原免疫小鼠，甲/こ型流感抗原免疫的小鼠与骨髄瘤细胞融合后，用ELISA方法鉴别，鉴别出来的杂交瘤在腹水中培养，筛选阳性克隆，分离纯化甲/こ型流感病毒抗体。ELISA鉴定甲/こ型流感病毒抗体的活性和效价，纯化备用，甲型流感病毒抗体的原始浓度为3. OOmg/ml,こ型流感病毒抗体的原始浓度为3. 5mg/ml。2、制备微信号放大系统a、制备胶体金标记亲和素(美国Thermo公司中性亲和素蛋白)将待标记亲和素预先在0.005mol/L pH7.0的NaCl溶液中4°C透析过夜，以除去多余的盐离子，然后4°C 100OOOg离心lh，去除聚合物；以0. lmol/L PBS调节胶体金(按常规方法制备)液的pH值至8 9，按Iml胶体金溶液中加入15 25 y g亲和素的量，标记亲和素以形成胶体金标记亲和素；b、制备生物素(美国Thermo公司EZ-Link NHS-Biotin)化甲/こ型流感病毒抗体先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，再使其与甲/こ型流感抗原結合，生物素与甲型流感病毒抗体的质量比为I : 9，生物素与こ型流感病毒抗体的质量比为I : 10。然后在碳ニ亚胺的作用下将其与N-羟基丁ニ酰胺进行缩和，生成长臂生物素N-羟基丁ニ酸亚胺酯(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl ami do hexanoate,BCNHS),即为生物素化·甲/こ型流感病毒抗体。通过透析除去游离生物素。C、完成微信号放大系统按Iml胶体金标记亲和素溶液中加入100 U I生物素化甲/こ型流感病毒抗体的量，将步骤a得到的胶体金标记亲和素和步骤b得到的生物素化甲/こ型流感病毒抗体直接混合，连接得到胶体金-亲和素-生物素-甲/こ型流感病毒抗体复合物，经过洗涤、离心处理后，即得微信号放大系统。3、胶体金标记的兔IgG抗体在pH6. 5 7.0范围内，兔IgG与胶体金颗粒蛋白(最低用量为8. 0 y g/ml)标记形成胶体金标记兔IgG抗体(蛋白探针)。4、将胶体金-亲和素-生物素-甲/こ型流感病毒抗体、以及胶体金标记兔IgG抗体喷洒到玻璃纤维膜2上，稀释參数(稀释參数是每ml溶液喷洒多少面积的エ艺參数)为25cm2/ml 35cm2/ml，胶体金颗粒-亲和素-生物素-甲型流感病毒抗体复合物的用量为71 ii g/cm2 ;胶体金颗粒-亲和素-生物素-こ型流感病毒抗体复合物的用量为75 u g/cm2 ;胶体金标记的兔IgG抗体的用量为35 u g/cm2 ;并在温度20 40°C，湿度10% -30%,将玻璃纤维膜2干燥12个小时以上，备用。5、用包被缓冲液(其包被缓冲液的配方是0. OlM pH7.2PBS、5%蔗糖、1%甲醇、5%甘氨酸、0. 05%NaN3)稀释甲和こ型流感病毒抗体，使其浓度分别为I. 2mg/ml和I. 3mg/ml,按包被用量分别为0. 216 u g/mm和0. 234 u g/mm，将其分别细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，其中硝酸纤维素膜3孔径为5. 0 ii m 12. 0 ii m，置于20 40°C，湿度10% 30%条件下烘干处理12个小时以上，备用；用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体，使其浓度为
I.5mg/ml，按包被用量为0. 33ii g/mm，将其细致均匀的喷到硝酸纤维素膜3上，置于20 40°C，湿度10% 30%条件下烘干处理12个小时以上，封袋，备用；6、将样品垫I、玻璃纤维膜2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4依序粘贴于底板5上，即得所述联检试纸。所述甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸经过包装可以直接使用，或者安装到试剂盒里，配合小滴管，充当试剂卡使用。[0039]实施例2利用实施例I中的试纸检测分泌液中甲/こ型流感病毒抗原的方法本实施例利用实施例I的试纸对分泌液样本中的甲/こ型流感病毒抗原进行检測。包括以下步骤(I)采集样本使用无菌PP (聚丙烯)杆的聚酯海绵拭子采集样本。鼻腔分泌物采集方法收集鼻腔分泌物吋，将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲(离鼻孔约2. Ocm 2. 5cm)受阻处，贴鼻腔壁旋转拭子三次，取出拭子；咽喉分泌物采集将拭子从口腔完全插入咽喉中，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子。(2)采集样品后，在样本提取管内垂直加入400 ill (约10滴)样本提取液，将采样后的拭子插入样本提取管中的溶液内，紧靠试管内壁旋转约10次，使标本尽可能溶解在溶液中，沿提取管内壁挤压拭子的棉签头，使液体尽可能留在管内，取出并弃去拭子。标本采集后尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2°C 8°C下可保存8小吋，-70°C可长期保存。(3)沿铝箔袋切ロ部位撕开，取出试条平放，吸取5iU样本垂直滴加于试条箭头胶所示的加样区；由于毛细管作用，样品将沿着试纸向玻璃纤维素膜2和硝酸纤维素膜3移动，待样品完全通过玻璃纤维素膜2以及硝酸纤维素膜3，结果开始显示；(4) 15分钟后观察显示结果(30分钟后显示的结果无效)，判读并记录检测結果，若硝酸纤维素膜3的检测区6出现一条肉眼可见的深色线(T2线，即A区)，即表明样品中含有大量甲型流感病毒抗原，即说明受检验者的肌体已经被甲型流感病毒感染(甲型流感病毒阳性)；若检测区7出现一条肉眼可见的深色线(Tl线，即B区)，即表明样品中含有大量こ型流感病毒抗原，即说明受检验者的肌体已经被こ型流感病毒感染(こ型流感病毒阳性);若Tl线和T2线同时出现，即说明受检验者的肌体已经被甲型和こ型流感病毒的同时感染(A区和B区)；若硝酸纤维素膜3的检测区6和检测区7均未出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中未含有大量的流感病毒抗原，说明受检验者未被病毒感染(阴性)；当样品通过硝酸纤维素膜3的检测区6和检测区7移动至控制区8吋，无论样品中有没有甲/こ型流感病毒抗原，控制区8都会有一条深色线(C线)；若控制区8无色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误；(5)测试结束后，将使用后的试纸、样本提取管和口腔取样器按生物医疗废弃物进行处理。測定结果为了表示方便，在下列表格中A代表甲型流感病毒抗原，B代表こ型流感病毒抗原。I.实施例I中的试纸对人流感病毒不同亚型和不同株的甲型流感病毒和こ型流感病毒均有良好的反应性，研究结果见表I。表I对人甲型/こ型流感病毒抗原的检测灵敏度结果
权利要求1.一种甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸，所述试纸由样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，其特征在于，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-甲型或こ型流感病毒抗体；所述检测区包括包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线，所述质控区包被有羊抗兔抗体。
2.根据权利要求I所述的甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸，其特征在于，所述包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线之间的距离为2-5mm。
3.根据权利要求2所述的甲型流感病毒抗原和こ型流感病毒抗原的联检试纸，其特征在于，所述包被有甲型流感病毒抗体的检测线和包被有こ型流感病毒抗体的检测线之间的距离为3. 5mm。
专利摘要本实用新型公开了一种甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原的联检试纸，包括样品垫、含有胶体金颗粒标记物的玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸，所述硝酸纤维素膜包括包被有甲型流感病毒抗体的检测区、包被有乙型流感病毒抗体的检测区和包被有羊抗兔抗体的控制区，所述胶体金颗粒标记物包括微信号放大系统和胶体金标记的兔IgG抗体，所述微信号放大系统为胶体金颗粒-亲和素-生物素-甲/乙型流感病毒抗体。本实用新型在双抗体夹心检测体系中添加了生物素-亲和素微信号放大系统，扩大了目标抗体的信号，增加检测灵敏度，避免因信号太弱而出现假阴或者漏检，同时还可同时对甲型和乙型流感病毒抗原进行联检，节省检测时间、样本和成本。
文档编号G01N33/569GK202433383SQ201120538758
公开日2012年9月12日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者张健, 王继华, 郭诗静 申请人:广州万孚生物技术有限公司