用于测序聚合物的受控的隧道间隙设备的制作方法

专利名称：用于测序聚合物的受控的隧道间隙设备的制作方法
用于测序聚合物的受控的隧道间隙设备对相关申请的引用
本申请要求2010年2月2日提交的美国临时专利申请编号61/300，678，2010年8月31日提交的美国临时专利申请编号61/378，838的优先权，这两者都通过完全引用合并在本文中。政府权益
本发明是由国家卫生研究所授予的拨款HG004378和R21HG004770，来自国家人类基因组研究所的测序技术计划的拨款HG004378，以及来自国家癌症学会的拨款U54CA143682的政府支持所作出的。政府在本发明中享有一定权益。发明背景 DNA测序的新方法需要降低成本和提高个人化基因组学的可用性(M. Zwolak, M. DiVentra, Reviews of Modern Physics 80, 141 (2008))。另外，长的连续读出结果将帮助揭不基因组的长程结构(E. Pennish, Science 318, 1842 (2007)；A. J. Sharp, et al.,Annu. Rev. Genomic Hum. Genet. ARI, 407 (2006)。与 Sanger 测序和下一代方法相比，纳米孑し测序(nanopore sequencing) (D. Branton et al., Nature Biotechnology 26,1146 (2008))是无酶的技术，在其中利用电泳迫使DNA分子通过细孔，从而序列读取机制可以在分子的全长上维持其精确度。穿过孔洞的离子电流对于纳米孔中的序列是敏感的(M.Akeson, et al. , Biophys J. 77, 3227( 1999)；A. Meller, et al. , Proc. Natl. Acad.Sci. (USA)97, 1079 (2000)；N. Ashkenasy, et al. , Angew. Chem. Int. Ed. 44, 1401(2005))但是纳米孔通道中的所有碱基贡献了电流阻断(A. Meller, et al. , Phys. Rev.Lett. 86, 3435 (2001))以及在超出孔洞的强势场区域中的那些(A. Aksimentiev, etal. , Biophysical Journal 87，2086(Sep, 2004)；M. Muthukumar, et al. , Proc. Natl.Acad. Sci· (USA) 103，5273 (2006))。结果，使用离子电流读取尚没有获得单碱基分辨。Lee和Thundat提出，跨越DNA分子的电子贯穿可能是足够局部化的，以感测和鉴定单个核苷酸(J. W. Lee, and T. Thundat. US Patent 6, 905, 586 (2005))，该猜想由 Zwolak 和Di Ventra 的计算所支持(M. Zwolak, M. Di Ventra, Nano Lett. 5, 421 (2005))。进ー步的计算显示，在间隙中分子的热运动拓宽了隧道电流的分布(J. Lagerqvist, et al.,Biophys J. 93，2384 (2007)；R. Zikic et al., Phys. Rev. E 74，011919 I (2006)),实质上降低选择性。隧道间隙中分子的取向范围可以通过使用化学键将其拴系在读取电极上来大大地降低(X. D. Cui et al., Science 294，571 (2001 ))，然而，使用强键不是DNA测序的选项，在DNA测序中与电极的接触必需快速地从ー个核苷酸滑动到下一个核苷酸。OhshiiO和Umezawa展现了氢键可以用于提供扫描隧道显微镜图像中的化学反衬(T.Ohshiro, Y. Umezawa, Proc. Nat. Acad. Sci. 103, 10 (2006))表明这些较弱的键可以充当对单个分子的“滑动接触”。在申请W02008124706A2 (“通过识别测序”)、61/037647 (用于DNA测序的纳米管道纳米孔”)、61/083，001 (“用于DNA测序的串联读取器”)61/083，993 (“用于测序聚合物的基于碳纳米管的设备”)、61/103，019 (“用于测序的反式碱基隧道读取器”)，所有这些通过引用来合并，描述了在隧道间隙中使DNA中的目标碱基接触电极的方案，所述电极是用被设计以特异性地与一种碱基或另一种碱基氢键合的试剂功能化的。结果，每种DNA碱基需要不同的读取器，从而序列必需通过排列四个独立读取器的输出来组装。此外，对被设计以靶向特定位点的试剂的依赖，意味着当两种不同的位点被靶向时(每个电极一种)，电极必需被独立地功能化，这在纳米尺度的间隙中是难以实现的。发明概述
本发明提供了用于分析聚合物和/或聚合物单元的组合物、设备和方法。所述聚合物可以是同型-或异型聚合物，例如，DNA、RNA、多糖或肽。所述设备具有电极，所述电极形成聚合物可以穿过的隧道间隙。电极用附着于其上的试剂来功能化，所述试剂能够与聚合物单元形成瞬时的键。当在试剂和单元之间形成瞬时的键时，产生可检测信号，用于分析聚合物。配置和调节隧道间隙宽度，来优化在电极与聚合物的单元形成瞬时键时产生的信号的选择性。附图的简要描述
附图I说明了用4-巯基苯甲酰胺功能化的电极对T (附

图1A)、G (附图1B)、C (附图1C)和A (附图1D)的氢键键合。附图2提供了 O. 5V偏压的TCB中示范性的背景隧道信号。附图2A处在10 pA的电流下，附图2B处于2 pA的电流下。附图3显示了电极功能化对于嘌呤的电流峰波分布的示范性的作用。裸电极(附图3A-dA和附图3C-dG)得到了宽阔的分布(TCB中间隙电导率20 pS，0. 7μΜ dA，2. 9 μ MdG)。在电流的log中拟合是Gaussian型的(参见附图18-20)。当一个电极用4-巯基苯功能化时分布缩窄了十倍(附图3B-dA，附图3D-dG)(间隙电导率12 pS，Ibl = 6 pA, V =O. 5V)。在电流的log中拟合是双Gaussian型的，一个峰在iQ(“ I”)处，第二个在2 iQ(“2”)处(参见式III)。对于(ΙΑ,Υρδ. 9 ρΑ，对于dG为5. 6 pA。当两个电极都被功能化时(附图3E-dA，3G-dG)，峰值电流是明显不同的(对于dG，iQ=9. 4 pA，对于dA，iQ=16. 5 pA)。附图3F显示了 dA和dG的混合物的分布。dA的更高的峰的分配通过在降低的dA浓度测量的分布来确认了(附图3H)。附图3F和3H中高电流尾部与两种分子(dA+dG)读取结果的小数量是一致的。峰宽度的分布在附图29中给出。附图4提供了当腺嘌呤核苷扩散到间隙中时V= 0.5V、背景电流=6 pA的电流vs.时间轨迹的示范性的曲线。插图显示了结合信号的鼓起。所有四种核苷观察到了相似类型的信号。参见附图15。附图5显示了用于嘧啶读取的电极功能化的示范性的作用。对于用裸电极读取(在附图5A和5B中的宽分布)，Gbl提高到40 pS来提高计数率。5A和5B中的窄分布是用被功能化的两种电极采集的，对dT产生八=6.7 pA，对dC为13.3 pA (Gbl = 12 pS，Ibl =6 pA, V = O. 5V)。在混合的溶液中，(附图5C) dT峰在8 pA处出现，dC峰在13. 4 pA处出现，通过用具有一半浓度dT的混合物测量来验证分配(图21)。附图6显示了当被功能化时两个电极的电流峰的示范性的分布(dG，V=O. 5V,电流=6 PA)。为主要峰信号的峰电流两倍的读取结果的小部分同步于隧道间隙中两个分子的捕
-M-犾。附图7提供了示范性的读取结果的概述。附图7A显示了作为基线电导率的函数的dA (实心正方形)和dT (实心圆形)的峰电流(在V=O. 5V下)。空心正方形(dA)和空心圆形(dT)显示了两个分子读取结果的部分如何随着隧道间隙变得更小而提高。附图7A显示了测量的分子电导率随Gbl (黒色圆形dT，黒色正方形dA，误差线是土HWHH)线性地提高。两个分子读取结果(空心圆形，dT，空心正方形，dA)的数量在Gbl = 20 pS下提高，读出率在Gbl = 4 pS下实质上地降低了。附图7B提供了对于四种核苷在三个独立运行中测量的峰电流(交叉影线的柱)。附图7B显示了在两个电极都被功能化时，在每种核苷的特征性电流下观察到狭窄的电流峰分布。交叉影线的框(3个重复的数据集)显示了在6 pA、V = O. 5V的基线电流下测量的每种核苷的峰电流。每个框上方的误差线代表测量的电流分布的完整宽度。阴影的框显示了在两个电极中仅一个被功能化时测量的电流。功能化的表面和裸露的Pt (浅色阴影的柱)和裸露Au (暗色阴影的柱)探针的读取结果对核苷的身份是相对不敏感的，如在附图7C中定量地显示的，其中相对用两个功能化的探针测定的分子电阻标绘了联结电阻。附图8显示了随着示范性的隧道间隙被扩大卿，隧道电流基线，Gbl变得更小)，读取频率降低。

附图9图形地描绘了本发明的示范性的实施方式。附图IOA和IOB提供了利用金或一氮化钛探针以及金或一氮化钛包被的纳米孔的示范性的隧道间隙和纳米孔阵列的细节。附图IOB的电子显微照片中的比例尺(110)是2nm0附图IOC和IOD提供了利用碳纳米管探针以及石墨烯纳米孔的示范性的隧道间隙和纳米孔阵列的细节。附图IOD的电子显微照片中的比例尺(210)是10 nm。附图IOE (横截面视图)和IOF (顶视图)提供了利用金属探针和碳纳米管纳米孔阵列的示范性的隧道间隙和纳米孔阵列。附图11说明了本发明的实施方式的间隙化学作用。附图12说明了利用碳纳米管中的间隙形成电极对的示范性的实施方式。附图13显示了各种氨基酸的示范性的氢键键合位点。附图14提供了用TBDMS修饰的核苷的示范性的化学结构。附图15提供了在都用4-巯基苯甲酸功能化的两个电极的TCB中，4. 3 μΜ dT(附图15Α)、2·9 μΜ dG (附图15Β)和O. 8 μ M dC (附图15C)的Gbl=12 pS的示范性的电流-时间轨迹。附图15A和附图15B的电流比例尺是相同的。附图16提供了使用用于获取峰波数据的增益设置，开放回路中示范性的噪声谱(附图16A)和伺服控制下的噪声谱(附图16B)。短划线是对Ι/f谱的拟合。附图17显示了用固定的(5 PA)截断(圆形)、可变的1.5 ο截断(正方形)和可变的2σ截断(三角形)分析的、两个Gaussian对数与示范性的数据集拟合。拟合的峰从6. 6移动至7. I pA，相对于不同核苷的峰的分离是可忽略的变化。附图18显示了对dA (附图18A)、dC (附图18B)、dG (附图18C)和dT (附图18D)在Gm = 20 pS (V = O. 5V)下裸电极获得的示范性的电流分布。表I列出的核苷浓度下180s中记录的总计数在每个画面中列出。參见实施例1.4。附图19显示了对dA (附图19A)、dC (附图19B)、dG (附图19C)和dT (附图19D)在Gbl = 40 pS (V = O. 5V)下裸电极获得的示范性的电流分布。注意到，由于分布的宽度，可以得到dA的一些清晰的读取结果。与在Gm = 20 pS下获得的数据相比，嘌呤和嘧啶之间的读出率是较少地不同的。参见附图18。180 s周期中的计数列出在每个画面上。附图20显示了在双对数标绘图上标绘的，对来自附图19A的数据的示范性抛物线拟合(实线)。附图21提供了 dT和dC的混合的示范性的分布，dT的浓度相对于附图5C使用的是减半的。分布与三个Gaussian对数函数(实线)拟合。dT峰位于6. 6 pA,dC峰位于12. 3PA。高的电流尾部与小部分dG+dC读取结果拟合(集中在6. 6 + 12.3 pA)。附图22A和22B提供了用产生更大间隙的O. 75V偏压(Gbl = 8 pS)在Ibl = 6 pA下测量的示范性的电流分布。分子的电导率如所预料的降低了(G(dA)= 14. 4 pS, G(dC)=15.6 pS)。从dA的降低大于附图7A中显示的拟合所预计的。这表明除了在间隙大小的指数依赖性之外存在偏压依赖性。作为在固定间隙大小下偏压的函数采集的数据(参见附图23)倾向于确认这种趋势。

附图23提供了作为恒定间隙电导率下偏压的函数的dA的示范性峰电流(12 pS ；O. 75V, 9pA, O. 5V, 6pA和O. 25 V 3 pA)。圆圈是用一个裸露的金电极采集的数据，它们显示了对偏压的轻微依赖性。用2个功能化的电极采集的数据(正方形)显示了随着偏压降低峰电流提高。改变偏压的征象不引起大的改变(-0.5 V下的数据)。附图24显示了作为基线隧道电流的函数的、功能化探针每秒的读取结果，是通过将在180 s间对dA (圆形)和dT (正方形)获得的数据平均化来获得的。这些数据稍微取决于探针几何结构，这是一种反映在通过比较用两个不同的探针采集的数据而获得的误差线中的效应。附图25显示了对于dA在Gbl = 20 pS下获得的示范性的电流分布(功能化的探针)，显示了 2个和甚至3个分子读取结果的证据。附图26显示了 Ibl = 6 pA、V = O. 5V下对dT (圆形)、dG (正方形)、dC (三角形)和dA (菱形)的实验数据集(包括2个分子阅读峰)的示范性的拟合的分布(峰从左到右dT、dG、dC、dA)。在所显示的值(8 pS、11.7 pS和14. 8 pS)处设置分辨率水平，对dT如果i〈8pA 产生了 72%的概率，对(16为64%(8口4〈丨〈11.7 pA)，对 dC 为 61%( (11. 7〈i〈14. 8 pA),以及对 A 为 60% (i>14. 8 pA)。附图27显示了在通过示范性的分析中保留所有记录的峰波(附图27A)，以及通过淘汰仅I个(20 μ S)或2个(40 μ S)采样点延续时间的峰波(附图27Β)获得的示范性的电流分布。数据是对于dG的，2.9 μ Μ, Gbl = 12 pS。实曲线是与A中独立的峰，以及与B中在io和2 i0处固定的峰的2 Gaussian对数拟合。A中的数据由7. 3 pA处的特征主导，等于用未功能化的探针记录的电流。B中的峰移动到9. 7 pA。分布反映了 STM电流电压变换器的有限的频率响应，其将降低快速的峰的测得幅度(参见附图29)。对dC获得了类似的结果(所有数据的峰=7.3 PA，过滤的数据的峰=13 pA)。dT的数据不受过滤的影响(所有数据的峰=7. 3 pA，过滤的数据的峰=6. 8 pA)。附图28提供了示范性的电流分布，其是通过在dA的示范性的分析中保留所有记录的尖峰获得的(附图28A-所有数据，附图28B-淘汰最快的两个点)。在这种情况下，6. 5PA处“单个功能化的电极”峰的残基保留，此时I个或2个点尖峰被淘汰，从而数据与三个Gaussian对数函数拟合，具有两个独立的峰值(八，I1和2ix、。当最短的尖峰被淘汰时，分布的最大值从6. 5 pA移动到15. 6 pA。分布的形状取决于使用的探针，2 Gaussian拟合对其他数据集工作良好(例如，附图2)，其中“未功能化的”峰通过排除最快的尖峰几乎被完全地消除。附图29显示了 dA (附图29A)、dC (附图29B)、dG (附图29C)和dT (附图29D)的尖峰寿命的示范性的分布。圆形线是裸电极的，三角形线是ー个功能化的电极的，正方形线是两个功能化的电极的。尖鋭的特征反映了数据binning。所有数据在表I显示的工作浓度和O. 5V下采集。对于裸露的探针Gbl = 20 pS，功能化的探针为12 pS。箭头指向40或
20μ S持续时间的尖峰，它们从电流分布中被淘汰以增强选择性。除了 dT之外，用两个功能化的探针寿命是稍长的。然而，裸露探针的寿命，或一个功能化探针的寿命是基本上相同 的。因而，隧道分布的变窄必需反映为功能化的和裸金属表面之间容许的结合几何结构范围中的差异，而不是结合态寿命中的差异。电流电压变换器的-3 dB频率是kHz (143μ s)，从而在此处显示的数据中更快的特征被减弱。附图30说明了在50 mM铁氰化钾中示范性的裸露金线(电势vs. Ag线)。附图31说明了示范性的HDPE包被的STM尖端的循环伏安法。假定半球形暴露的尖端形状以及使用式Imax = 2 π RnrcD，包被的扫描探针的暴露表面积在10_2 μ m2的数量级上。附图32说明了 4-巯基苯甲酰胺单层(下方的线)和粉末(上方的线)的示范性的FTIR光谱。附图33是STM图像，显示了 Au表面上巯基苯甲酰胺的小岛。在金尖端、O. 5V尖端偏压，10 PA设置点的I mM BP缓冲液中的图像。附图34显示了来自示范性电极的光学和透射电子显微镜(TEM)图像。附图34A是裸电极的光学图像。附图34B和34C是裸电极的TEM图像。附图34D是包被的电极的光学图像。附图34E和34F是包被的电极的TEM图像。34C中的短划线弧具有16 nm的半径。34E和34F中的箭头表明暴露的金的位置。附图35说明了使用裸电极探针和功能化电极表面在水中的电报噪声。当探针和表面都是裸露吋，以及在PB中当表面和/或探针是裸露吋，见到类似的信号。附图36显示了纯H2CK在每种情况下标绘多条曲线)中，裸露的金电极(附图36A)、功能化的电极(附图36B)以及ー个裸露的和一个功能化的电极(附图36C)的隧道电流衰减曲线。附图37显示了 β的示范性的直方图，对数衰减曲线的斜率的负值，即，。纯
αζ
水中对裸露的金电极(附图37Α)、用巯基苯甲酰胺功能化的电极(附图37Β)以及ー个裸露的和一个用巯基苯甲酰胺功能化的电极(附图37C)获得的值。Gausian拟合(平均值土SD)产生37Α — 6. 11±0· 68 ηπΓ1，37Β — 14. 16±3· 20 ηπΓ1 ;和 37C — 6· 84±0· 92 ηπΓ1。附图38显示了利用4-巯基苯甲酰胺读取器(reader)分子采集的d (CCACC)的示范性的10 s时间轨迹。注意A信号的优势。电流尖峰分布(插图)几乎完全由A信号主宰，拟合中的C部分(黑线)是7%或更低。这显示了探针花费更多的时间结合到少数的A碱基。附图39 显示了对于 dAMP (附图 39A)、dCMP (附图 39B)、dGMP (附图 39C)和 dmCMP(附图39D)随着时间的过去的示范性的电流尖峰轨迹，显示了数据的示范性的爆发。这些实例的每一个都由无尖峰的电流区域围绕。附图40说明了对胞苷(灰色)和5me胞苷在三氯苯溶剂中使用苯甲酸读取器测量的示范性电流分布。附图41显示了 dGMP、dCMP、dAPM和cfCMP单体的“on时间”的示范性分布，实线是
指数性拟合。附图42显示了 d (C) 5、d (A) 5和d (mC) 5聚合物的“on时间”的示范性的分布，实线是指数性拟合。

附图43显示了 dGMP、dCMP、dAPM和cfCMP单体的“off时间”的示范性分布，实线
是指数性拟合。附图44显示了 d (C)5、d (A)Jd (mC)5聚合物的“off时间”的示范性的分布，实线是指数性拟合。附图45显示了 d (A)5的尖峰>0.1 nA计数的示范性的分布。这些是总数的约20%，在dNTP或d (C)5中没有观察到。附图46显示了 d (mC) 5的尖峰>0. I nA计数的示范性的分布。这些是总数的约20%，在dNTP或d (C)5中没有观察到。附图47显示了与苯甲酰胺表面(R :不含有DNA碱基的2_脱氧核糖_5_磷酸钠盐)相互作用的核苷-5’ -单磷酸(A、C、G、T、R)的示范性的SPR传感器图。线条是拟合的曲线，被建模来描述1:1结合事件。附图48显示了附着事件的直方图，是对捕集dAMP的一对4_巯基苯甲酰胺读取器分子用原子力显微镜记录的。附图48A显示了不存在dAPM时采集的对照曲线，其几乎不显示苯甲酰胺分子之间的附着事件，推测是因为它们被水阻断。附图48B显示了在第一次清洗之后dAMP的附着。附图48C显示了在第二次清洗之后dAMP的附着。附图48D显示了在第三次清洗之后dAMP的附着。附图48E显示了在第四次清洗之后dAMP的附着。添加dAMP引起许多附着事件，其随着过量的dAMP被洗出系统而提高(附图48B、C)，随着清洗继续而降低(附图48D、E)。附图49显示了示范性的模拟的位移(上部图案-黑色)和电流(底部图案-灰色)对比时间-阶梯，其中相关性C具有O. 9的值。附图50显示了示范性的模拟的位移(上部图案-黑色)和电流(底部图案-灰色)对比时间-阶梯，其中相关性C具有O. 98的值。附图51显示了示范性的模拟的位移(上部图案-黑色)和电流(底部图案-灰色)对比时间-阶梯，其中相关性C具有O. 99的值。附图52显示了从同聚物获得的信号的示范性的标准化的分布。附图52A显示了对标准化电流分布的拟合。附图52B显示了在信号爆发中标准化的尖峰频率，是与多项式拟合的。对分布的拟合被用于指定特定噪声爆发来自A或C的概率(如果平均电流和频率在交叉点上方或下方，标记为“IAC”和“fAC”)。(和丫的电流分布是分离的(交叉点标记为“Im。”)，但是频率分布重叠。
附图53显示了 4-巯基苯甲酰胺对腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的示范性氢键键合方式。附图54显示了读取异聚物内单个碱基的示范性的数据。54B显示了示范性的隧道噪声爆发，大的、罕见的尖峰信号为C，更小的、更频繁的尖峰信号为ム。“*”标记的尖峰是非特异性的。附图54c显示了尖峰高度的滚动平均值(O. 25s窗ロ，O. 125s阶梯)。C碱基产生了低于O. 015 nA (直线)的可忽略的尖峰数。附图54D显示了尖峰频率的滚动平均值。附图54E显示了信号来自A (由淡灰色线显示)或C (由暗色线显示)的概率。附图55显示了磷酸盐缓冲盐水中功能化的隧道间隙的隧道信号，但是没有被分析物，使用20 pS间隙(i= 10 pA, V = +0. 5V)。除了箭头所指出的ー些AC耦合的线条噪声之外，这个实施例得到无特征的信号。附图56显示了功能化的隧道间隙的隧道信号。附图56C-F显示了当核苷酸dAMP(附图56C)、dCMP (附图56D)、cfCMP (附图56E)和dGMP (附图56F)被引入时产生的特征性 电流尖峰(dTMP在这个实施例中没有得到信号)。附图56G-J显示了 dAMP(附图56G)、dCMP(附图56H)、dmCMP (附图561)和dGMP (附图56J)的脉冲高度的相应分布。附图56G-J中的曲线拟合于电流对数中的两个Gaussian分布。附图57说明了用于表征隧道信号的參数。如果超过了局部背景上噪声标准偏差的I. 5倍，尖峰被计数。信号在爆发中发生(持续时间TB，频率fB)，各自含有处于频率fS下的电流尖峰。对于周期tm尖峰是高的，对于周期セ。 是低的。总计数率(參见附图56G-J)是所有爆发中的尖峰数除以时间的测量值。附图58说明了来自寡聚体的隧道信号分布是怎样类似于构成核苷酸的那些。附图58A、C和E显示了 d (A) 5、d (C) 5和d (mC) 5的代表性的电流轨迹，相应的分布在附图58B、D和F中显示。附图58B、D和F中的曲线显示了对构成性核苷酸和寡聚体核苷酸两者的拟合。曲线彼此紧密地相关。附图58G和I显示了来自混合的寡聚体d (ACACA)(附图58G)和d (CmCCmCC)(附图581)的电流轨迹，和相应的电流分布(附图58H和J)。附图58H和J中的实线曲线是标量了的同聚物拟合。在附图58H中，上方点划线显示了 A贡献，底部的点划线显示了 C贡献。在附图58J中，上方曲线显示了 mC贡献，底部曲线(在电流(nA)轴上方O. 02处开始)显示了 C贡献。数据由经过某些中间信号的同聚物參数(标记为“I”)来良好地描述，新的高电流特征(标记为“2”)显示了序列背景轻微地影响读取。附图58G中的上部横线标记了 C样信号，而下方的横线标记了 A样信号。附图581中的上部横线标记了 C样信号，下方的横线标记了 mC样信号。附图59显示了关于读取复合物的寿命的数据(在零力下寿命在秒的数量级上)。附图59A显示了 AFM间隙功能化，其中s形线条代表了 34 nm PEG接头。附图59B显示了代表性的カ曲线，显示了(i) 一次拉动超过ー个分子，力基线在每次断裂后没有恢复，Z-延伸(校正的尖端位移)是 34 nm，以及(ii)示范性的软件接受的类型的单分子曲线(如A.Fuhrmann, PhD Thesis in Physics, Arizona State University, 2010 所描述的)。力在键断裂之后回到基线，校正的延伸是 34 nm。附图59C显示了在标记的拉动速度下键断裂力的直方图。曲线显示了与异源键模型的示范性的最大可能性拟合。附图59D显示了对比键模型參数标绘的键生存概率(实线)，其从上到下是5000 nm/s、2000 nm/s、500 nm/s和200 nm/s ο这些拟合产生了零力off率O. 28 s'意味着在纳米间隙中组件存活时间在秒的数量级上，比溶液中的寿命更久得多(溶液结合测量的细节參见附图47)。附图60说明了根据本发明的实施方式的芯片。在芯片中，一对读取电极通过导体例如TiN的原子层沉积来形成，所述导体通过薄的(例如，2 nm)介质层分隔，具有钻过芯片的纳米孔。识别分子(试剂)共价拴系到金属电极上，随着电泳驱动分子通过间隙，随后通过非共价相互作用形成在每个碱基(或残基)上自组装的联结。附图61显示了咪唑-2-氨基甲酰对腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤的示范性氢键键合方式。附图62A和62B显示了在包含咪唑-2-氨基甲酰功能化电极的固定间隙中用脱氧-核苷酸测量的示范性的电流分布。附图63显示了具有咪唑-2-氨基甲酰功能化的电极以及可以恒定间隙在表面上平移的探针的示范性设备。 附图64显示了 DNA读取结果拟合dC5 (附图64A)和dA5 (附图64B)的核苷酸电流分布。附图65显示了固定间隙的AAAAA寡聚体的示范性的电流读取結果。附图66显示了固定间隙的CCCCC寡聚体的示范性的电流读取結果。附图67显示了固定间隙的d (mC) 5寡聚体的示范性的电流读取結果。附图68显示了通过隧道电流的伺服控制保持在近似恒定值下的可变间隙的d(CCCCC)寡聚体的示范性电流读取結果。附图69显示了 dA5 (上方的斜坡)和dC5 (下方的斜坡)的信号爆发时间对比扫描速度倒数的示范性的标绘图，斜率大约O. 3 nm。附图70显示了固定间隙的ACACA寡聚体的示范性的电流读取結果。附图71显示了固定间隙的CCACC寡聚体的示范性的电流读取結果。附图72显示了固定间隙的CmCCmCC寡聚体的示范性的电流读取結果。附图73显示了通过隧道电流的伺服控制保持在近似恒定值下的可变间隙的ACACA寡聚体的示范性电流读取結果。附图74显示了通过隧道电流的伺服控制保持在近似恒定值下的可变间隙的CmCCmCC寡聚体的示范性电流读取結果。附图75显示了通过隧道电流的伺服控制保持在近似恒定值下的可变间隙的GTCGTCGTC寡聚体的示范性电流读取結果。附图76显示了氨基酸和肽主干的示范性的识别分子(试剂)。发明的详细说明
本发明提供了用于分析聚合物単元和/或聚合物的组合物、成分、设备和方法。可以被分析的示范性的聚合物単元和聚合物包括异聚物和相关的单元。例如，可以被分析的聚合物包括DNA、RNA、多糖和肽；聚合物単元包括聚合物単体、核苷酸、核苷、氨基酸、多糖単体。在某些实施方式中，可以分析遗传外的标记,例如甲基化的DNA和/或RNA，并与例如非甲基化的DNA/RNA单元相区分。所述设备包括用一个或更多个读取器分子(在此也称为试剂)功能化的两个或更多个电扱，以及聚合物単元和/或聚合物可以穿过的隧道间隙。电极上的试剂能够与聚合物的単元形成瞬时的键。当単元处于间隙中时形成瞬时的化学的或物理的键，并且完成第一和第二电极之间的回路。形成的瞬时的键然后可以引发用于分析聚合物的可检测信号。电极
两个或更多个电极可以由任何适合的材料制成，所述材料可以用能结合目标聚合物单兀的试剂来功能化。例如，电极可以由任何导电的材料制成，例如，金属、金属合金、金、钼、金合金、钼合金、碳、碳纳米管、石墨烯或ー氮化钛。在某些实施方式中，电极包含探针和基底。电极可以在任何适合的无机或有机绝缘材料之上、或之间形成、或被其部分绝缘，例如，无机材料包括Six0_lx、氮化硅、金属氧化物，或有机材料包括聚合物，例如聚こ烯、聚苯こ烯、聚甲基丙烯酸甲酯以及本领域公知的其他的。绝缘材料可以被配置以阻止在电流流动时来自电极的背景噪声。例如，除了小的尖端或顶端之外，电极可以完全地用HDPE覆盖。在另ー个实施方式中，电极可以包埋在绝缘层之间，仅暴露与纳米孔接触的区域(附图60)。多达一平方微米可以暴露于达到一摩尔的盐溶液，对于半伏特或更低的偏压仅有可忽略的漏泄电流。

读取试剂在“削尖”电极中起到重要作用。典型的金电极具有纳晶体组成，其中大小10 nm或更大的接触面被暴露。因而看起来不可能的是仅接触单个碱基。然而，当电极被功能化时，单个碱基是容易分辨的。这是因为特异性的分子接触现在充当了隧道电极，在金属表面上形成尖鋭的、界限分明的微刺。试逝
电极用一种或更多种试剂功能化。电极可以用同一试剂、试剂的组合来功能化，或用独立的试剂分别功能化。可以使用能够结合电极并瞬时地结合目标聚合物単元的任何适合的试剂。为了促进目标聚合物単元与电极的结合，各种功能基团可以拴系到能与目标聚合物单元结合的读取器分子上，取决于期望的电极物质。适合的功能基团可以包括，例如，-SH、-NH2, -N3> -NHNH2, -ONH2, -C00H、-CHO,こ炔、ニ硫代氨基甲酸盐以及ニ硫代羧酸盐。通过将分子能级更紧密地与金属的费米能级对准，与金属的ニ硫代氨基甲酸盐连键大大地提高了隧道电流(參见Florian von Wrochemj Deqing Gaoj Frank Scholzj Heinz-GeorgNothoferj Gabriele Nelles and Jurina M. Wesselsj “Efficient electronic couplingand improved stability with dithiocarbamate-based molecular junctions，，，NatureNanotechnology, June 20, 2010)。在某些实施方式中，电极被栓系到功能基团上,功能基团然后结合读取器分子。例如，对于金属，当电极是金时，具有硫醇功能基团的试剂可以用于促成试剂与电极之间的共价键。ニ硫代氨基甲酸盐可以用于结合到金、Pt和TiN。这些基团可以提供金属与试剂之间的增强的电子耦合。胺化学作用可以用于功能化石墨烯孔洞和碳纳米管末端，因为石墨烯边缘经常地具有羧酸盐、羰基和环氧化物。试剂能够与目标聚合物单元(J.He et al., Nano technology 20, 075102(2009))和核苷(S. Chang et al., Nature Nano technology 4, 297 (2009))形成瞬时的键。瞬时的键可以是物理的、化学的或离子的键，只要所述键允许通过电极检测出可检测电子信号(S. Chang et al. , Nanotechnology 20，075102 (2009) ；M. H. Lee, 0. F.Sankey, Phys. Rev . E 79, 051911 1 (2009))。优选的瞬时的键包括氢键。因而，示范性的试剂可以包括氢供给或接受基团。另ー个实施方式是芳香环之间的Pi-堆叠相互作用，芳香环在水或水性电解质中被推到一起。
结合DNA和/或RNA的示范性试剂包括巯基苯甲酸、4_巯基苯甲酰胺、咪唑_2 -羰基化物、以及ニ硫代氨基甲酸咪唑-2 -羰基化物(也称为4-氨甲酰基苯基ニ硫代氨基甲酸盐)。4-巯基苯甲酰胺呈现了两个氢键供给位点(在氮上)，以及ー个氢键接受位点(羰基)。在附图53中显示对例如四种核苷酸碱基的可能的结合模式。在附图61中显示了咪唑-2-氨基甲酰与四种核苷酸碱基的可能的结合模式。涉及读取器中的芳香环与DNA碱基之间的Pi-堆叠的其他键合模式也是可能的。当处在各种溶剂，例如有机溶剂、水或水性电解质溶液中，试剂可以被配制以呈现一个或更多个氢键供体和/或一个或更多个氢键接受体。例如，巯基苯甲酸在有机溶剂例如三氯苯中工作，而4-巯基苯甲酰胺咪唑-2-羰基化物和ニ硫代氨基甲酸咪唑-2 -羰基化物在水性电解质和水中工作。要注意的是，包含这些设计原则的许多分子将作为读取器(reader)起作用。例如，用硫醇功能化来将其锚定在金或TiN电极上的鸟嘌呤将产生识别信号。在某些实施方式中，试剂可以被配置以包括柔性的部分，其形成电极与试剂的氢键键合部分之间的桥。这种桥可以是取代的或未取代的烷基链，例如，-(CH2)y-,其中y是I到5的整数。例如，当被功能化到电极上吋，咪唑-2-氨基甲酰具有-CH2CH2-桥，将酰胺 部分连接到电极。这种桥允许酰胺部分旋转，从而以不同的和可检测的方式与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶相互作用。參见附图61。试剂还可以被配置以与氨基酸形成瞬时的键来分析肽。附图13显示了氨基酸上的氢键供体和接受体位点的实例。两种或更多种附近的位点(标记“D”供体，或“A”接受体)是在天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和精氨酸上可获得的。赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和色氨酸上的单个位点可以结合利用也与肽主干形成氢键的试剂来读取。芳香族试剂可以通过Pi-堆叠的方式识别具有芳香环的氨基酸(组氨酸、酪氨酸、脯氨酸和色氨酸)。因而，肽可以根据在此描述设备和方法来分析。附图76显示了识别肽主干以及识别氨基酸的侧链的示范性的试剂。隧道间隙
聚合物的単元，例如，DNA的核苷或蛋白质的氨基酸随着它们扩散通过隧道间隙、或通过电泳驱动通过时被检测。间隙的宽度可以是固定的或可动态地调整。间隙优选地是固定的。间隙包含两个电极之间的空间。间隙被调节到这样的大小，从而每个目标単元适合间隙。间隙可以是约O. 5到约6 nm的宽度，例如约I到约4、约I. 5到约3. 5 nm、约2到约3nm、或约2到约2. 5 nm。间隙宽度可以取决于使用的试剂和要分析的目标聚合物単元而变化。对于用4-巯基苯甲酰胺功能化的两个电极来说，间隙可以是约2到约2. 5 nm，例如，约2. I到约2. 2 nm，或约2. 16 nm (当间隙电导率是20 pS时，一般用于DNA读取)。对于用咪唑-2-氨基甲酰功能化的两个电极来说，间隙可以是约2. 2到约2. 6，例如约2. 3到约2. 5nm,约2. 35到约2. 4 nm,或约2. 37 nm(当间隙电导率是20 pS时，一般用于DNA读取)。间隙距离可以如以下描述的确定。附图I显示了在ー个固定的隧道间隙中与四种DNA核苷的每ー个形成的独特的氢键键合。4-巯基苯与四种核苷的每ー个形成氢键。氢键是圆形的，“S”代表脱氧核糖的糖部分。这些结构通过计算机模拟产生，可能非常好地代表了实际的结构，因为4-巯基苯甲酰胺是在有机溶剂中使用的。对于在水中工作的读取器分子来说，与水分子竞争氢键、以及由水介导的芳香环的相互作用，使得结构建模的尝试复杂化了，水将芳香环推到一起形成Pi-堆叠相互作用。间隙的确切大小在获得可靠的读取结果方面可能是重要的。它应当被调整大小，从而大部分的时间(或产生的大部分信号)是由间隙中仅一个聚合物単元的存在所引起的。适合的间隙宽度可以通过使用能够动态地调整间隙的设备来确定。在某些实施方式中，可动态地调整的设备可以用于分析目标单元。在两种情况下，间隙宽度可以如下确定或设置电极相互接近到一起，直到选定的隧道电流到达特定的偏压。例如，当在1，2，4-三氯苯中建隧道时，在O. 5V偏压下6 PA的电流相应于2. 5 nm的间隙。通过应用扫描隧道显微镜领域中公知的主动伺服控制来维持间隙。在某些实施方式中，伺服控制具有限于IOOHz的响应频率或更低。假设间隙被保持足够大，背景隧道信号没有特征，如附图2中所示的。当分子在间隙中结合时，在隧道间隙中观察到瞬时的电流峰(附图4)。当两个电极被功能化吋，对于每种核苷在特征性的电流下观察到电流峰的狭窄分布(图7B)。然而，可归因于间隙中同时超过ー个的目标分子结合、在分布上的高电流尾部，使得从电流信号鉴定特定的核苷复杂化。这可以产生在电流分布中的第二个峰，为主峰电流的两倍(附图6)。随着间隙制成更小(提高的基线电导率或电流)，从而跨越电极的更多接触变得可能，多分子读取结果的相对频率提高。两个分子读取结果的这种逐步提高的频率在附图7A中显示(其也显示了峰电流如何随着降低间隙而提高)。因而，使间隙更大具有两种有害影响首先，峰电流下落(如附图7A中显示的)，第二，对于给定的目标浓度，读取率 降低(附图8)。因而，在某些实施方式中，重要的元素包括(a)引入具有纳米孔的、可变和可控制的隧道间隙，通过所述纳米孔目标聚合物可以被移位来向读取系统一次呈现ー个元素(即，对于DNA聚合物，一次ー个碱基)；以及(b)使用以一定方式或其他方式结合所有目标的试齐U，间隙被调节到这样的大小，从而对于目标仅存在少数独特的结合几何结构，从而产生区别性信号。纳米孔
在某些实施方式中，设备可以具有一个或更多个纳米孔，通过所述纳米孔聚合物可以被导向隧道间隙用于分析。纳米孔可以被配置以允许聚合物一次向隧道间隙流动ー个单元。因而，用于分析DNA的纳米孔可以小于用来分析肽的纳米孔。对于具有可变间隙的隧道联结，在附图9中说明了这样的实施方式。间隙本身的细节在附图10A-F中给出。固定的间隙设备的细节在附图60中给出，要测序的聚合物例如DNA存在于流体储存器I中(以横截面显示)。含有聚合物的流体可以流过纳米孔3的阵列，或任选地可以被电泳偏压V6驱动通过纳米孔，所述偏压通过參考电极4在第一储存器I和第二流体储存器2之间施加。两个储存器都充满电解质，例如，I M KC1，此外，储存器I的pH值可以被调节到大的值(pH=ll或12)以将目标DNA维持在其单链形式。如果不需要根据电信号来独立验证移位，采集储存器2中的电解质溶液优选地制成小的(mM)来最小化电化学的渗漏。在某些实施方式中，纳米孔是电学上导电的，通过铺在纳米孔阵列顶部的电极5来连接。阵列可以由通过扫描传导器7固定就位的ー个或更多个第二电极6来探測，扫描传导器7例如，扫描探测显微镜领域公知的X，y, z扫描元件。扫描器可以通过刚性框架8附着到纳米孔阵列。隧道联结的示范性的图示在附图10中显示。附图IOA显示了金探针读取序列，随着DNA分子穿过纳米孔101顶部上的探针104与金或TiN 103之间，DNA通过电泳移位通过纳米孔101。纳米孔101在横截面中显示，它钻穿硅、氮化硅或ニ氧化硅基底102。读取试剂105和106附着到探针104和金属电极103。附图IOB中的电子显微照片显示了氮化硅基底上的纳米孔107，其被金108的薄层(20 nm)包被。钻出孔洞的动作引起金在孔洞周围重结晶，从而金109的尖鋭的、原子级的突起在纳米孔的边缘突出，形成聚合物的读取电极之一。附图IOC显示了一个实施方式，其中带有碳纳米管电极204的探针被保持在石墨烯基底202中的纳米孔201上，石墨烯基底202由氮化硅基底203支持。读取试剂205和206附着到CNT204以及石墨烯纳米孔201的边缘。附图IOD中的电子显微照片显示了在石墨烯多层208上钻出的纳米孔207。附图IOE和IOF显示了一个实施方式，其中从绝缘体12突出的金属探针13被保持在突出于介电基底11的碳纳米管纳米孔的阵列上(一个纳米孔被标记为10)，所述介电基底11用薄金属电极5包被，碳纳米管通过所述金属电极5突出。这样的阵列可以通过纳米管从硅表面CVD生长、随后伴随着蚀刻掉底层支持物来用氮化硅填充来制造，如 Holt et al. , Fast Mass Transport Througn Sub - 2-Nanometer Carbon Nano tubes.Science, 2006. 312: p. 1034-1037所描述的，通过引用将其合并在此。例如，在通过离子蚀刻除去其余突出的碳纳米管之前，膜的顶面可以具有蒸发在其上的Au层来作为触点(厚度10到100 nm)。DNA通过碳纳米管的电泳移位近来由Liu et al. , Translocationof single-strandea DNA througn smgle-walied carbon nano tubes, science, 2010,327，p 64-67展现了，通过引用合并在此。探针6可以用绝缘体12的层覆盖，留下少量(几平方微米)暴露的顶端 13,如 Nagahara et al. , Preparation and Characterizationof STM Tips for Electrochemical Studies. Rev. Sci. Instrum. , 1989. 60: p.3128-3130所描述的。这产生进入电解质溶液的最小的电化学泄漏电流。在某些实施方式中，如上所述的部件可以被配置到微阵列或芯片中，如在例如附图60中所说明的。在此，支持材料302 (硅、ニ氧化硅或氮化硅)用薄金属电极303包被，例如通过原子层沉积来沉积的TiN，然后用电介体304的层覆盖，其厚度308是根据使用的读取试剂最优选择的。对于在此描述的大多数试剂，这种厚度是1.5到3 nm。沉积第二电极305，并用最后的介电层309覆盖。纳米孔301被钻穿过整个设备(通过电子束的方式，如本领域公知的)，暴露的金属电极表面用读取试剂306和307功能化。金属电极可以通过任何常规方法在纳米孔周围形成。例如，Pt可以在氮化硅膜中形成的纳米孔上通过聚焦离子束化学气相淀积来沉积。金属，例如TiN，也可以通过原子层沉积或化学气相淀积来沉积，之后蚀刻或产生孔洞。金属也可以首先包被在膜上，例如，SiN、Si或SiO2，此后钻出孔洞。石墨烯，一种本身导电的物质，也可以用作纳米孔的电极。在石墨烯的情况下，孔洞可以在石墨烯中钻出。石墨烯孔的移位可以用于长的寡聚体，例如，达到48 kbp。在使用石墨烯时，有可能仅功能化孔洞的边缘。在附图11中显示了对于纳米孔利用碳纳米管的示范性的隧道间隙。探针可以从基底上除去，因而在基底和探针上用不同的试剂功能化是可能的。在某些实施方式中，探针、金或钼、或钼合金用4-巯基苯脲21来功能化，4-巯基苯脲是在水性溶液中呈现氢键供体和接受体的试剂。碳纳米管10的末端优选地可以利用本领域公知的酰胺键(未显示)用脲部分22来功能化。參见Feldman, A. K. , M. L. Steigerwald,X. Guoj and C. Nuckolls, Molecular Electronic Devices Based on Single~WalledCarbon Nanotube Electrodes. Acc. Chem. Res.，2008. 41: p. 1731-1741。
_4] 移位速度的控制
利用用读取试剂功能化的读取间隙的其他优点是间隙中碱基的固有的长结合时间，如实施例13中讨论的。纳米孔的主要问题是当跨孔洞施加足够大而主导热涨落的偏压时DNA移位的高速度。DNA以每秒几百万碱基的速度移位，对于任何实际的读取方案都太快了。Branton et al. , Nature Biotechnology volume 28, pp 1146-1153，2008 讨论了这个问题。在电极用结合DNA碱基的分子功能化的情况下，ー个碱基可以保持捕捉达到几秒。附图59中呈现的原子力显微镜数据的详细分析(Huang et al, Nature Nanotechnology,voI 5 pp 868-873，2010)显示，仅需要施加小的力来提高DNA通过用读取试剂功能化的纳米孔的速度。例如，附图59的数据被用于显示，在跨纳米孔的80 mV偏压下，DNA将以每秒10个碱基的速度移位，在120 mV下提高到每秒超过100个碱基。聚合物的分析
本发明的化合物、部件、设备和方法可以用于分析聚合物。在某些操作方法中，偏压，例如，约0. I到IV、例如约0. 3到0. 7V，或约0. 5V (Vt)可以通过电压源在电极之间施加，附图9中的Vt。探针和纳米孔之间的间隙通过传导器(附图9中的7)来调整，直到达到期望的设置点电流。这可以是约I到10 PA，例如，约3到6 PA。例如，可以施加移位偏压(V6)来产生DNA通过碳纳米管的移位。Ve的优选的值在0. I到IV之间。在某些实施方式中，电极之一(例如，探针)可以利用传导器7的横向扫描动作来在表面上移动来定位成功地移位DNA的纳米孔，间隙被调节来实现隧道信号中的最大辨别率。间隙将被设置为优选的初始值(例如，在0.5V下的6 PA电流)，在背景隧道电流中进行小的调整来优化来自四种核苷的信号的分离。分析聚合物中优选的其他部件有(a)快速数据峰的排除(低于40 μ s持续时间)；(b)使用设置在高于0. 3s数据块中噪音水平I到2个标准偏差的阈值的自动化峰检测；以及(c)維持背景电流信号的伺服机构增益的调整，从而频率响应不快于35Hz ;(d)在数据的获取期间关闭伺服机构的装置。当控制平均间隙大小的伺服机构在数据获取期间被保留吋，随着伺服机构响应于期望的测序信号调整间隙，数据是失真的。例如，附图68、73和74中的轨迹是在伺服机构打开时获得的(利用如刚刚描述的低响应时间)。附图70、71和72中的轨迹是用固定的间隙获得的(没有伺服控制)。信号更易于解释。在具有可变间隙的仪器中，最佳的安排是在不存在DNA的情况下采样背景信号，用伺服机构稳定间隙，然后关闭伺服机构来获取数据，重设间隙，然后DNA信号停止。在某些实施方式中，根据它们的延续时间选择电流信号，在0. 5 s或更短的间隔时间上数字地拟合背景电流，以建立识别高于该背景的峰的基线。要了解的是，本发明的进ー步的优点是，呈现处在小的间隔距离(距离达到10个碳-碳键)上的氢键供体和/或接受体(和/或可以Pi-堆叠的芳香环)的任何目标可以在这种方案中读取，如有必要，调整间隙来优化来自目标子集的信号。形成两个电极的碳纳米管
在其他实施方式中，碳纳米管可以用于形成两个电极，如在附图12中说明的。作为用于测序聚合物的电极的碳纳米管在61/083,993 (“用于测序聚合物的基于碳纳米管的设备”)中描述了，通过引用合并在此。如在Liu et al. , Translocation of single-strandedDNA through single-walled carbon nano tubes. Science, 2010, 327, p 64-67 中描述以及在61/083，993 (“用于测序聚合物的基于碳纳米管的设备”)中进ー步描述的，利用在硅晶片表面上建立的设备，DNA移位跨越碳纳米管30中的小间隙(參见附图12)。通过抵抗阻挡物35的开放部分对氧等离子蚀刻的短暂暴露、随后用传导器36弯曲设备，所述传导器36按压薄膜34，薄膜34相对于间隙上方的固定的点37弯曲并变位到它的ー侧，可以制成CNT中非常小的切ロ。弯曲切开碳纳米管将会折断它，随着管子坐落的底座被进ー步弯曲，间隙的程度提高。开放的间隙的大小可以通过从ー个电极(31a)到另ー个电极(31b)穿过的隧道电流来測量。当获得了期望的间隙大小(2到2. 5 nm)吋，CNT的末端用如上所述的脲基团32功能化。在某些方法中，DNA移位通过间隙30，传导器36被调节以优化来自碱基的隧道电流信号的分离，所述碱基通过结合电极31a和31b上脲基团横跨间隙。
实施例

实施例I.材料的合成和表征 I. I材料和方法
质子NMR (1H)光谱在Varian 500 MHz光谱仪上记录。氯仿中的1H化学位移參考溶剂峰(Sh = 7. 26 ppm)。高分辨率质谱(HRMS)使用大气压力化学电离(APCI)技术来记录。UV光吸收在Varian Cary 300 UV分光光度计上记录。Flash层析使用自动化的flash层析(Teledyne Isco, Inc. CombiFlash Rf )来进行。所有化学试剂购自商业的供应商，除非另有说明按收到的使用。2’-脱氧腺苷和2’-脱氧鸟苷购自TCI America ;胸腺嘧啶核苷购自Alfa Aesar ;2’-脱氧胞苷购自Sigma-Aldrich。Sure/Seal 瓶子中的无水N, N-ニ甲基甲酰胺(DMF)购自Sigma-Aldrich。I, 2，4-三氯苯(TCB，99%，Aldrich)在氮气中在分子筛(4A)上干燥，然后在过滤后减压蒸馏。所有其他溶剂按收到的使用。1.2制备核苷的双(叔丁基ニ甲基硅烷)(TBDMS)衍牛物的一般过稈(参见附图14) #JAL(D. A. Barawkar, R. K. Kumar, K. N. Ganesh, Tetranedron Letters 48,
8505 (1992) ；ff. Zhang, R. Rieger, C. I den, F. Johnson, Chem. Res. Toxi col. 8,148 (1996) ；P. Potier, A. Abdennaji, J. P. Behr, Chem. Eur· J. 6, 4188 (2000)。叔丁基ニ甲基硅烷氯化物(TBDMSC1，2. 5 mmol)添加到无水的核苷(I. O mmol)、ニ甲基氨基吡啶(DMAP，0. 15 mmol)和咪唑(6 mmol)在无水DMF (10 mL)中的溶液中。在室温下在氮气中搅动反应混合物过夜之后，用饱和的水性NaHCO3淬灭，用ニ氯甲烷提取。浓缩组合的有机层，残余物通过硅胶flash层析、用100:0到100:5的CH2Cl2 - CH3OH梯度洗脱来纯化。3’，5’-ニ-0_ 谈-丁基ニ甲基硅烷)-脱氧腺苷(I):产率 80%。1H NMR (500MHz, CDCl3): δ 8. 29 (s, I H, 2-H), 8.09 (s, I H, 8-H), 6.65 (br s, 2 H, NH2),6. 41 (t, I H, I，-H), 4. 56 (dd, I H, 3，-H)，3. 96 (d, 1H, 4，-H)，3. 82 (dd, IH, 5，-H), 3. 72 (dd, I H, 5，，-H), 2. 59 (m, I H, 2，-H), 2. 39 (m, I H, 2，，-H),0.86 (s, 18 H, (CH3)3CSi), 0.05 (s, 6 H, CH3SiO), 0.03 (s, 6 H, CH3Si0)。HRMS(APCI):对 C22H41N5O3Si2 +H 的计算值，480. 2826 ;实测值，480. 2818。3’，5’-ニ-0_ (/友-丁基ニ甲基硅烷)-脱氧胞苷(2):产率 17%。1H NMR (500MHz, CDCl3) δ 8. 07 (d, I Η, 6_Η)，7. 14 (br s, 2Η, NH2) , 6. 24 (t, I H, I’-H)，5. 84 Cd, I H, 5-Η) , 4. 38 Cm, I H, 3，-H)，3. 92 Cm, 2 H, 5，-H)，3. 77 Cm, I H,4，-H), 2. 42 Cm, I H, 2，-H), 2. 08 Cm, I H, 2，，-H), O. 92 Cs, 9 H, (CH3)3CSi),0.88 Cs, 9 H, (CH3)3CSi)), O. 11 Cs, 3 H, CH3Si0)0. 10 (s, 3 H, CH3SiO), 0.07 (s,3 H, CH3Si0)0. 06(s, 3 H, CH3SiO)。HRMS(APCI): C21H41N304Si2+H 的计算值，456. 2714 ；实测值，456. 2722。3’，5’-ニ-0_ CiT - 丁基ニ甲基硅烷)_脱氧鸟苷(3):来自层析的粗产物进一步通过在こ醇(95%)中重结晶来纯化。产率21%。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 13. 10 (brs, I H, NH), 7.89 (s, I H, 8-H)，7. 11 (br s, 2 H, NH2), 6. 26 (t, I H, I，-H),4. 57 (t, I H, 3，-H), 3.97 (t, I H, 4，-H), 3.81 (m, I H, 5，-H), 3. 77 (m, I H,5”-H), 2. 51 (m, I H, 2，-H), 2. 37 (m, I H, 2”-H), 0.91 (s, 9 H, (CH3)3CSi),0.90 (s, 9 H, (CH3)3CSi)), O. 10 (s, 6 H, CH3SiO) 0.07 (s, 6 H, CH3SiO). HRMS:(APCI) C22H41N504Si2+H 的计算值，4%. 2775 ;实测值，4%. 2767。3’，5’-ニ-0-(/友-丁基ニ甲基硅烷)-胸腺嘧啶核苷(4):产率83%。1H NMRC500 MHz, CDCl3) 5 9. 78 (br s, I H, NH), 7.40 Cs, I H, 6-H), 6. 27 (t, I H, I，-H),4. 33 (t, I H, 3，-H), 3. 85 (t, I H, 4，-H), 3. 80 (dd, I H, 5，-H), 3. 69 (dd, IH, 5”-H), 2. 18 Cm, I H, 2，-H), 1.93 Cm, I H, 2”-H), 1.84 Cs, 3 H, 5_CH3)，0.85 (s, 9 H, (CH3)3CSi), 0.82 (s, 9 H, (CH3)3CSi)), 0.04 (s, 6H, CH3SiO) 0.00(s, 6H, CH3SiO). HRMS: (APCI)C22H42N2O5Si2 +H 的计算值，471. 2711 ;实测值，471. 2712。1.3贮备溶液的制备
具有叔-丁基ニ甲基硅烷基团保护的羟基基团的核苷(dA、dG、dT、dC)的饱和溶液(1.0mg)添加到新蒸馏的1，2，4-三氯苯(20 ml)中，在超声浴中超声10分钟。溶液用滤纸(1#，Whatman)过滤,保存在手套箱(水分低于O. 5 ppm,氧气低于O. 5 ppm)中。工作溶液通过用TCB稀释贮备溶液来制备。I. 4贮备溶液的浓度
由于TCB的UV光吸收与核苷的重叠，贮备溶液的浓度通过溶剂交換来測定。在真空下在80°C从贮备溶液的等分量(I ml)中除去TCB，残余物重新溶解到同体积的氯仿中，測量它的UV光吸收来确定浓度。分别利用dA、dG、dT和dC稀释物的系列，在它们的最大吸收波长下，測定氯仿中所有核苷衍生物的UV消光系数。稀释因数从3. 5到200。曲线拟合在Origin 8中进行。贮备溶液的最终浓度在下表中列出。表I. TCB贮备溶液中核苷的饱和浓度。底部行列出了隧道測量中使用的终浓度(对每个核苷产生近似相等的读出率的浓度)。
—dAdGdTdC
. I； (nm)26025 268280
e12 WO1147094S07400
€ ,{10-6mol/L)5-8嫌22_9±0‘17.7士O, I60.4±7.8
C(10'6mol/L)0.7±§.022.9±0.l4.3±0.060.8±0.1
实施例2 :探针和表面的制备和表征
蚀刻金(S. Chang et al., Nano technology 20, 075102( 2009))(A1 fa Aesar, O. 25mm diameter, 99.999% pure)和 Pt (20% Ir) (L. A. Nagahara, T. Thundat, S. M.Lindsay, Rev. Sci. Instrum. 60, 3128 (1989))探针，并准备表面(J. A. DeRose, T.Thundat, L. A. Nagahara, S. M. Lindsay, Surf. Sci. 256 102 (1991))在氢焰中退火。0. 3 mg苯甲酸溶于用気气脱气的2 mL N, N-ニ甲基甲酰胺((Sigma-Aldrich,>99. 99%纯度)中。在氢焰退火之后基底直接浸入这种溶液两小时，然后用N，N-ニ甲基甲酰胺、丙酮和1，2，4_三氯苯清洗，使用前在流动N2中干燥。在修饰之前，探针在piranha (H2S04/30% H2O2, 3:1 :产生热和氧气，小心处理)中清洁。它们然后浸入I mM苯甲酸溶液中过夜，用N，N-ニ甲基甲酰胺、丙酮、1，2，4-三氯苯清洁，使用之前吹干。所有測量在新制备的、核苷的纯溶剂或溶液中进行。

表面用捕圆光度法，STM(A. H. Schafer, C. Seidel, L. Chi, H. Fuchs, Adv.Mat. 10，839 (1998))和 FTIR (S. E. Creager, C. M. Steiger, Langmuir 11，1852(1995))来表征。FTIR谱清楚地显示了苯甲酸部分被暴露，并且处于它的中性形式。測量背景隧道信号，在附图2中显示。2. I极化电流和电化学滲漏
峰值电流的绝对值受电化学渗漏的影响，如下在回退用远离表面的探针测量的背景漏泄电流之后，设置隧道电流。如果这是实质性的(数十到数百PA)，则，即使探针是不绝缘的(从而渗漏在它们的整个表面上产生)，当探针被带至表面时，作为探针顶端周围改变的扩散速率的結果，渗漏仍可以改变(以PA水平)。因而，对远离表面的探针的渗漏应用的校正可过度纠正靠近表面的探针的渗漏。结果，表观隧道电流被估计过高，如果渗漏在ー种核苷溶液与另ー种核苷溶液之间不同，则改变核苷与核苷的真实设置点。这种效应足够大到改变处在饱和浓度下dC和dG峰的表观数量级(表I)。稀释到表I显示的工作浓度，O. 5V偏压下的漏泄电流是I. O到2 pA (dA)、0. O到I. O pA (dT)以及O. 3到I pA (dG)。在dC的情况下(O. 8 μ Μ)，起初观察到15 pA的电流，但是这在对溶液的ー小时暴露之后降低到几PA。这些背景已经从在此报告的基线隧道电流中减去。它们看起来不引起显著误差，由单个核苷的数据与混合物的数据之间的相似性所证明。dT、dG和dC的原始数据的实例可以在附图15中找到。2.2 STM伺服机构增益
伺服机构的频率响应通过比较没有(附图16A)和有(附图16B)应用伺服机构的Ι/f噪声曲线来确定。当前的轨迹是作为谱线密度转化和显示的Fourier，根据
卿2(1^.1ηι欠丄ぽ.lm2(式〗)
^ L
其中/ 是频道数量(At=20 μ s，N=50000)。附图16A中的实线是对Ι/f的拟合。在伺服回路关闭时(附图16B)，噪声数据被抑制到低于35 Hz，相应于28 ms响应时间。这是足够长的而不会扭曲除了最长脉冲的之外的所有脉冲(附图15的插图中的长脉冲显示了峰值电流水平的小的降低，与测量的伺服机构响应一致)。2.3自动化的峰检测
为了速度和消除操作员偏差，数据分析是自动化的。如果遇到极其嘈杂的背景(污染的特征)，对过程的ー个操作员输入是将探针移动到基底的更平静的区域。原理挑战在于背景电流中的低频不稳定性，其不能被伺服机构完全地校正。如果为峰的接受使用小的固定阈值，高于这个阈值的即使非常小的基线变动也产生大量的虚假计数。如下克服了这ー难题。电流-吋间数据(在50 kHz下获得)打断成O. 3 s的块。块中的幅度被binned，数据的下半部通过Gaussian来拟合,其是检查Gaussian的平均值等于期望的基线电流的程序。Gaussian的HWHH被用于确定SD,基线噪声的σ。此处显示的数据通过将阈值设置为高于O. 3 s数据运行中噪声2σ。由于噪音水平在运行的延续时间期间改变，这种可变的阈值引起了变化的筛截，当数据被聚集时，这可能改变最低电流读取的分布形状(即，对于dT和用一个裸露电极获得的数据)。在数据(dT，4. 3 μ M, Gbl = 12 pS V = 0.5V)的30 s运行(B卩100个O. 3 s片段)上筛截的三种选择的作用在附图17中显示了。非常短的脉冲(处于仪器分辨率的极限)可占据数据的主要，看起来不对核苷的身份敏感。因而，仅ー个(20 μ s)或两个数据点延续时间(40 μ s)的全部峰波被淘汰。峰波生命时间的分布在附图27-29中提供。2.4用裸电极获得的数据
用裸电极获得的数据在附图18和19中显示。附图18和19显示了分布是不对称的。我们假定分子构型是随机分布的，以及隧道电流对位置的改变是指数地敏感的。因而，我们在电流的对数中使用了 Gaussian分布
权利要求
1.一种用于分析聚合物的设备，所述设备包括 Ca)第一和第二电极，它们形成所述聚合物可以穿过的隧道间隙；和(b)附着到所述第一电极的第一试剂和附着到所述第二电极的第二试剂，其中所述第一和第二试剂各自能够与聚合物的单元形成瞬时的键， 其中当瞬时的键形成时产生可检测信号。
2.权利要求I的设备，其中，所述试剂和隧道间隙的宽度被配置以在所述第一和第二试剂与聚合物的所述单元形成瞬时的键时对聚合物的每种单体产生特定的可检测信号。
3.权利要求I的设备，其中所述第一和/或第二电极包含金、碳、钼、石墨烯或氮化钛。
4.权利要求I的设备，其中所述产生的可检测信号是由隧道间隙中聚合物的仅一个单元的结合引起的。
5.权利要求I的设备，其中所述隧道间隙具有约I到约4nm的宽度。
6.权利要求I的设备，其中所述第一和第二试剂是相同的。
7.权利要求I的设备，其中所述瞬时的键是氢键。
8.权利要求I的设备，其中所述第一和第二试剂包含水性溶液中的至少一种氢键供体和至少一种氢键接受体。
9.权利要求I的设备，其中所述第一和第二试剂独立地选自由巯基苯甲酸、4-巯基苯脲、咪唑-2-羰基化物和4-氨甲酰基苯基二硫代氨基甲酸盐构成的组。
10.权利要求I的设备，其中所述聚合物是DNA或RNA,所述单元是核苷酸。
11.权利要求I的设备，其中所述单元选自由A、C、T、G和mC构成的组。
12.权利要求I的设备，其中所述聚合物是蛋白质，所述单元是氨基酸。
13.权利要求I的设备，进一步包括 c)第一流体储存器和第二流体储存器，其由聚合物可以流动通过的至少一个纳米孔分隔。
14.权利要求13的设备，进一步包含第一驱动电极和第二驱动电极，来在所述第一流体储存器和所述第二流体储存器之间施加电泳偏压。
15.权利要求13的设备，进一步包括位于纳米孔上方的上部接触电极，其中所述纳米孔是电学上导电的。
16.权利要求I的设备，其中所述第一和第二电极是碳纳米管。
17.一种分析聚合物或聚合物单元的方法，所述方法包括 a)在聚合物的单元与用第一试剂功能化的第一电极之间，以及所述聚合物的单元与用第二试剂功能化的第二电极之间形成瞬时的键； b)当瞬时的键形成时检测可检测信号。
18.权利要求17的方法，其中所述第一和第二试剂是相同的，并选自由巯基苯甲酸、4-巯基苯脲、咪唑-2-羰基化物和4-氨甲酰基苯基二硫代氨基甲酸盐构成的组。
19.权利要求17的方法，其中所述聚合物是DNA或RNA，所述聚合物单元是核苷酸。
20.一种测序聚合物的方法，所述方法包括 a)容许所述聚合物的单元流入在用第一试剂功能化的第一电极与用第二试剂功能化的第二电极之间形成的隧道间隙； b)在所述聚合物的单元与所述第一和第二试剂之间形成瞬时的键；c)当瞬时的键形成时检测可检测信号；以及 d)对聚合物的每个连续的单元重复步骤a)-C)。
21.权利要求I的设备，其中所述瞬时的键是读取器分子中的芳香基团与被分析物中的芳香基团之间的Pi-堆叠。
22.一种减慢电泳驱动的聚合物穿过由分子组成的纳米孔的速度的设备，所述分子化学地键合到所述孔的内侧，并且随着聚合物穿过孔时与聚合物的单元形成瞬时的键。
全文摘要
本发明包括了用于分析聚合物和/或聚合物单元的组合物、设备和方法。所述聚合物可以是同型-或异型聚合物，例如，DNA、RNA、多糖或肽。所述设备包括电极，所述电极形成聚合物可以穿过的隧道缺口。电极用附着于其上的试剂来功能化，所述试剂能够与聚合物单元形成短暂的键。当在试剂和单元之间形成短暂的键时，产生可检测信号，用于分析聚合物。
文档编号G01R27/08GK102687027SQ201180004174
公开日2012年9月19日 申请日期2011年1月31日 优先权日2010年2月2日
发明者J.何, P.张, S.常, S.林赛, S.黄 申请人:阿利桑那卅评议会