专利名称：血红蛋白类的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种利用液相色谱法分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。
背景技术：
目前，利用高效液相色谱法(HPLC)的血红蛋白类的分析被广泛进行，其在糖尿病诊断中用于糖化血红蛋白之一种的血红蛋白Alc的定量或异常血红蛋白的分析等。例如，已知如下液相色谱法 通过阳离子交换法，利用各血红蛋白成分不同的带电状态，分离将血液检体溶血稀释来制备的测定试样中的血红蛋白类。随着近年的糖尿病患者的增加，血红蛋白Alc的测定病例数也倾向于增加，在用HPLC的测定中，也要求高精度测定和测定时间的缩短。在生物体内，在血红蛋白类中存在结合有氧的氧合血红蛋白、结合二氧化碳的脱氧血红蛋白、血红素中所包含的铁被氧化成三价铁离子的高铁血红蛋白。在使用阳离子交换色谱法的HPLC中，根据分离柱上的保留力的不同，而产生氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白的溶出时间的差异，检测到的溶出峰宽化或者显示双峰性，因此分离精度有时变差。此外已知，在高铁血红蛋白与叠氮化物或氰化物共存的情况下，叠氮化物或氰化物与高铁血红蛋白的三价铁离子结合，形成叠氮高铁血红蛋白或氰化高铁血红蛋白(以下，将它们也称为稳定型高铁血红蛋白)而进行稳定化，但该稳定型高铁血红蛋白也在分离柱上的保留力与氧合血红蛋白或脱氧血红蛋白稍微不同，因此由于稳定型高铁血红蛋白的存在，检测到的溶出峰有时宽化或者显示双峰性。使用了 HPLC的血红蛋白类的分析除了糖尿病诊断之外还用于主要引起贫血的异常血红蛋白症或地中海贫血之类的诊断。其中，血红蛋白S为最多见的异常血红蛋白，其是引起严重贫血症状的镰状红细胞症的原因物质，因此，分离、检测的必要性高。此外，对作为糖尿病的指标的血红蛋白Alc进行测定时，理想的是，将以血红蛋白S为首的异常血红蛋白以尖锐的溶出峰形式分离。如果血红蛋白类的溶出峰宽化或形成双峰，则异常血红蛋白与正常血红蛋白之间的分离变得困难，并且有可能对测定值产生不良影响。另外，与新鲜血相t匕，变质血有更易于产生宽或双峰性的溶出峰的倾向。该原因是，通过变质产生的高铁血红蛋白增加。因此，在通过再检查等对保存检体进行分析的情况下，有可能对测定值产生不良影响。作为用于防止血红蛋白类的变质或改性的方法，已知添加公知的抗菌剂的方法和添加糖类的方法，除此之外，例如还公开了下述方法在专利文献I中，公开了使白蛋白与血红蛋白类共存的方法；在专利文献2中，公开了使血红蛋白类与酪蛋白、硼酸等共存的方法；在专利文献3中，公开了使血红蛋白类与亚氨基羧酸及其盐共存的方法。然而，即使使用专利文献I 3中所公开的方法,在血液检体中混杂氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白等各种血红蛋白类的情况下，用HPLC测定时，溶出峰有时宽化或者显示双峰性。此外，在通常的HPLC装置中，虽然组装有用于去除洗脱(溶離)液中的气体的脱气机，但是脱气机在启动后一定时间气体去除能力不稳定，有时血红蛋白的洗脱时间变动、或者对分离造成不良影响。特别是，在HPLC装置刚刚启动后或洗脱液温度不稳定的情况下，血红蛋白类的溶出时间变动、或者容易导致定量性变差。由于这在要求迅速性的以血红蛋白Alc为指标的糖尿病检查中，与第一次报告为止的时间较长有关，因此需要从刚刚启动HPLC装置后就能够稳定地测定的技术。另外，在各种血红蛋白类的检测、定量中，通常使用基于分光光度计的吸光度，但由于氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、闻铁血红蛋白、置氣闻铁血红蛋白、氛化闻铁血红蛋白各自的吸收光谱不同，因此如果它们混杂在一起，则有时不能测定正确的血红蛋白量。
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现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2003-194825号公报专利文献2 :日本特开平11-166932号公报专利文献3 :日本特开2009-97956号公报
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的在于提供一种利用液相色谱法在短时间内能够高精度地分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。解决课题的手段本发明是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，是预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理的血红蛋白类的分析方法。下面，对本发明进行详述。本发明人发现，通过预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，使检体中的血红蛋白类全部变为稳定型高铁血红蛋白，统一各血红蛋白在柱固定相中的保留力，在短时间内能够高精度地分离血红蛋白类，从而完成了本发明。在本发明的血红蛋白类的分析方法中，预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。通过用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，可以提高血红蛋白类的分离能力，并且可以缩短血红蛋白类的溶出时间。进而，即使在HPLC装置的脱气机在刚刚启动后气体去除能力不稳定的情况下，血红蛋白类的溶出时间也不会发生变动，并且检测到的溶出峰不会宽化或显示双峰性，而高精度地分离血红蛋白类。需要说明的是，在本发明中，“预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理”是指，以分离柱分离血红蛋白类之前，用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理，并不限于在液相色谱法中的测定开始前进行处理。具体地说，例如，在检体前处理液和/或洗脱液中，以表I所记载的组合中的任一组合，配合氧化剂和三价血红素铁的结合齐U，由此可以在分离血红蛋白类之前，用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。表I中，“〇”是指配合，是指不配合。[表 I]
权利要求
1.一种血红蛋白类的分析方法，其是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理。
2.根据权利要求I所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为使血红蛋白成为高铁血红蛋白的物质。
3.根据权利要求2所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为亚硝酸盐。
4.根据权利要求3所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，氧化剂为亚硝酸钠。
5.根据权利要求I所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为与高铁血红蛋白中的三价铁结合的物质。
6.根据权利要求5所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为叠氮化物。
7.根据权利要求6所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，三价血红素铁的结合剂为叠氮化钠。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的血红蛋白类的分析方法，其特征在于，作为液相色谱法，使用阳离子交换液相色谱法。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种利用液相色谱法在短时间内能够高精度分离血红蛋白类的血红蛋白类的分析方法。本发明是使用了液相色谱法的血红蛋白类的分析方法，是预先用氧化剂和三价血红素铁的结合剂对检体进行处理的血红蛋白类的分析方法。
文档编号G01N30/06GK102893147SQ20118001472
公开日2013年1月23日 申请日期2011年3月22日 优先权日2010年3月31日
发明者太平博晓, 冈孝之 申请人:积水医疗株式会社