使用凝胶状介质的液滴操作装置以及方法

专利名称：使用凝胶状介质的液滴操作装置以及方法
技术领域：
本发明涉及一种使用凝胶状介质的液滴操作装置以及方法。即，本发明涉及微装置以及在微装置内的液滴操作方法。详细地说，是涉及在微装置内能够实施核酸提取、纯化以及基因扩增的方法。
背景技术：
在从生物体试样中进行核酸提取、纯化方法中，以往使用标准的酚氯仿法。然而，由于操作复杂而且使用的试剂有害，废液处理花费成本，所以在基础研究以外的领域不常使用。例如，在把基因检查作为目的的核酸纯化法中，利用核酸特异吸附硅的性质，可采用不使用有害试剂而简便地提取 纯化核酸的方法。尤其是使用磁性硅粒子的纯化法，有利于自动化，作为核酸提取纯化装置由各公司在市上销售。这样的装置，通过药液来溶解试样，使核酸成为游离的状态，并对其添加磁性硅粒子，以此使核酸特异地吸附在硅表面上，经过后续的清洗工序之后，经过只回收核酸的工序就能够得到核酸纯化试样。在进行基因检查时，使用由这样的装置中回收的核酸，来实施以PCR(聚合酶链式反应)为代表的基因扩增法近年来，核酸提取·纯化以及以PCR为代表的基因扩增都在芯片上进行的微装置的开发正在蓬勃发展。一般来说，在微装置内构建有将进行核酸提取纯化装置的结构原样缩小化了的流路、泵、阀门等，并且正在开发用微量比例进行核酸提取纯化的装置。然而，在以一次性使用为原则的基因检查用微装置中，由于装置的制造成本的问题，实用的基因检查芯片还没有达到普及的程度。根据日本国特开2008-12490号公报(专利文献I)，不在微装置内构建泵、阀门等而是对封入在油中的液滴进行操作，以此用微量比例进行各种的反应。通过使液滴中含有磁性体粒子，并通过施加磁场的装置而能够进行液滴操作。在该公报中，作为封入液滴的介质所使用的油，采用的是在常温附近(从15°C到25°C)具有熔点的油，因此，根据在常温以下油会固化的现象，就能够进行装置的移动、搬运、保存。在先技术文献 专利文献[专利文献I]日本国特开2008-12490号公报

发明内容
发明所要解决的课题在日本国特开2008-12490号公报的方法中，在使用时必须对装置进行加热，使固化的油再次溶融。另外，由于在溶融的油中进行液滴移动操作，因此在以被封入的液滴作为母液滴而分离子液滴的时候，为了使母液滴在液滴移动操作时不动，需要另外利用电场的吸附力进行固定。由于需要这样的电场控制，所以在用于进行该公报记载的方法的装置中，必须设置电场产生机构，使装置的结构变得复杂。
在此，本发明的目的在于提供一种即使不采用电场操作等物理操作，也能够仅以磁场操作来进行液滴操作的液滴操作方法以及能够使用这种方法的液滴操作装置。用于解决课题的手段本发明的发明人在液滴封入介质中进行的液滴操作中，通过使用凝胶化的液滴封入介质，发现能达成上述本发明的目的，由此完成了本发明。本发明包括以下的发明。以下的发明针对于液滴操作装置。(I)一种液滴操作装置， 其是用于在液滴封入介质中输送液滴的液滴操作装置，其包括保持所述液滴封入介质的容器，由水系液体构成的液滴，相对于所述水系液体为不溶性或难溶性的凝胶状的液滴封入介质，包含在由所述水系液体构成的液滴中的磁性体粒子，和用于通过产生磁场而与所述磁性体粒子一同输送液滴的磁场施加机构。本发明的液滴封入介质是能够以液滴状态包含水系液体的介质。相对于水系液体为不溶性或难溶性，是指相对于25°C的水系液体的溶解度约为IOOppm 以下。上述液滴操作装置中的磁场施加机构，可以是其本身能够与输送面大致平行地移动的磁场施加机构，可以与输送面大致平行地设置多个。以下的发明是针对于对上述凝胶状的液滴封入介质的材料进行特定的形态。(2)根据(I)所述的液滴操作装置，所述凝胶状的液滴封入介质为向非水溶性或水难溶性的液体物质，混合选自由羟基脂肪酸、糊精脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯构成的组中的胶凝剂而进行制备的。(3)根据(I)或(2)所述的液滴操作装置，在所述液滴的输送路径上配置有另外的液滴。在上述方法中的另外的液滴形态的例子，可以示出在图I的(a)中，封入至凝胶状态的液滴封入介质中的由PCR反应液构成的液滴、由清洗液构成的液滴、以及由核酸提取液构成的液滴。(4)根据(I) (3)中任意一项所述的液滴操作装置，在所述液滴的输送路径上设置有温度梯度。以下的发明是针对于对液滴操作方法。(5)一种液滴操作方法，其是在液滴封入介质中操作液滴的方法，将所述液滴封入介质保持在容器中，
所述液滴由含有磁性体粒子的水系液体构成，所述液滴封入介质至少在液滴操作开始前为凝胶状态，在凝胶状态以及溶胶状态下相对于所述水系液体为不溶性或难溶性，在所述液滴操作中，包括利用磁场施加机构产生磁场，将所述磁性体粒子和所述液滴进行输送的工序。上述方法中的液滴输送形态的一个例子，如图2的(b)、(e)、(f)、(g)或(h)所示。在上述方法中，液滴操作开始后，包围移动的液滴的液滴封入介质可以是凝胶状态(如图2的(b)或(e))，也可以是溶胶状态(如图2的(g)或(h))。以下的发明是针对于特定了液滴的封入方法的形态。(6) 根据(5)所述的液滴操作方法，在所述液滴操作开始之前，准备容纳非水溶性或水难溶性的液体物质与胶凝剂的混合物的容器，在所述混合物中添加液滴，然后通过使所述混合物凝胶化，而将所述液滴封入在凝胶状的液滴封入介质中。除了上述形态以外，还可以在液滴封入介质凝胶化之后，通过将其暂时溶胶化而添加液滴来进行封入，也可以通过穿刺至凝胶状态的液滴封入介质中来进行直接注入而进行封入。(7)根据(5)或(6)所述的液滴操作方法，所述液滴为通过对另外的液滴产生所述磁场，使之在液滴输送路径上移动，由此从所述另外的液滴中分离而生成的液滴，所述另外的液滴为在同一容器内被封入至凝胶状态或溶胶状态的所述液滴封入介质中的所述液滴输送路径上的含有磁性体粒子的液滴。上述方法中的液滴分离形态的一个例子，如图2的(C) (e)的概略图所示。(8)根据(5)或(6)所述的液滴操作方法，所述液滴为通过对另外的液滴产生所述磁场，由此从所述另外的液滴中分离而生成的液滴，所述另外的液滴为在同一容器内被配置在凝胶状态的所述液滴封入介质上的含有磁性体粒子的液滴。在上述方法中的被配置在液滴封入介质上的另外的液滴的形态的一个例子，是图I的(a)以及(b)中的用网状表示的液滴。上述方法中的液滴分离形态的一个例子，如图2的(a) (b)的概略图所示。(9)根据(5) (8)中任意一项所述的液滴操作方法，所述液滴通过在凝胶状态或溶胶状态的所述液滴封入介质中移动，与在同一容器内被封入至所述液滴封入介质中的所述液滴输送路径上的另外的液滴合并。上述方法中的液滴合并的形态的一个例子，如图2的(a) (b)、(f) (g)的概略图所示。(10)根据(5) (9)中任意一项所述的液滴操作方法，在所述液滴输送路径上设有温度梯度。作为上述方法中的产生温度梯度的一个例子，可举出图1(b)中记载的陶瓷板以及与其一端相接的加热器。(11)根据(10)所述的液滴操作方法，所述液滴封入介质在同一容器内呈现所述温度梯度的高温侧的溶胶相和所述温度梯度的低温侧的凝胶相的两者。上述方法中的凝胶相以及溶胶相的共存形态例子，如图I (b)以及图2的概略图所示。在图2的(f)中，含有磁性体粒 子的移动中的液滴所位于的地点是相当于溶胶-凝胶转移点的温度地点，比该地点温度高的高温侧(接近加热器的一侧)的与输送面接触的液滴封入介质呈溶胶相，比该地点温度低的低温侧(远离加热器的一侧)的与输送面接触的液滴封入介质呈凝胶相。以下的发明，是针对于通过液滴操作对磁性体粒子及其吸附成分进行清洗的形态。(12)根据(9) (11)中任意一项所述的液滴操作方法，所述另外的液滴由清洗液构成，通过所述合并清洗所述磁性体粒子及其附着成分。作为在上述方法中的清洗形态的一个例子，是图2的(b) (C)所示的形态，在(C)中，磁性体粒子群进入的液滴是清洗液。以下的发明，是针对于通过液滴操作，对来自生物试样的核酸进行处理的形态。(13)根据(8) (12)中任意一项所述的液滴操作方法，通过在所述另外的液滴中含有细胞溶解液以及生物试样，而使来自所述生物试样的核酸吸附至所述磁性体粒子。以下是针对于通过液滴操作进行核酸扩增反应的形态。(14)根据(11) (13)中任意一项所述的液滴操作方法，所述另外的液滴由核酸扩增反应液构成；在溶胶状态的所述液滴封入介质中，使由通过所述合并而产生的反应混合物构成的液滴，移动至设有所述温度梯度的液滴输送路径上的实现核酸合成反应的开始以及维持的温度地点，进行所述反应混合物的温度控制。作为在上述方法中的温度控制形态的一个例子，如图2的(g) (h)所示以下是针对于通过液滴操作，在进行核酸扩增反应的同时，通过荧光检测对扩增产物进行检测的形态。(15)根据(14)所述的液滴操作方法，在所述核酸合成反应开始时，在由所述反应混合物构成的液滴以及所述液滴封入介质中，至少在所述液滴封入介质中含有荧光色素。作为根据上述的方法所产生的效果之一，例如，在上述核酸合成反应结束的时刻之前，都能够进行基于扩增产物的荧光检测。以下是针对于用于制作上述液滴操作装置的试剂盒。(16)一种试剂盒，其用于制作(I) (4)中任意一项所述的装置，包括保持所述液滴封入介质的容器，所述凝胶状的液滴封入介质，或者成为制备所述凝胶状的液滴封入介质的材料的非水溶性或水难溶性的液体物质以及胶凝剂，磁性体粒子，和磁场施加机构。上述试剂盒可以液滴封入至上述凝胶状的液滴封入介质的状态而被提供。另外，也能够提供使磁性体粒子包含在被封入的液滴中的状态。发明效果根据本发明，能够提供一种即使不采用电场操作等物理操作也能够仅以磁场操作进行液滴操作的液滴操作方法以及能够使用这种方法的液滴操作装置。尤其是，能够非常容易地从封入在凝胶状态的液滴封入介质中的含有磁性体粒子的液滴中，伴随磁性体粒子一同分离出微量的液滴。另一方面，若将液滴封入介质设为溶胶 状态，则含有所封入的磁性体粒子的液滴本身的移动也能容易地进行。根据本发明，由于在同一容器内也能容易地使凝胶状态和溶胶状态的液滴封入介质共存，因此以密闭状态进行伴随液滴的分离以及移动的一连串的操作都非常容易。例如，当在处理含核酸试样的一连串的操作中适用本发明的时候，对于从该含核酸试样中的核酸提取·纯化以及PCR，用一个简易的装置就能够进行。


图I是填充了液滴封入介质31的容器的立体图，(a)是在液滴封入介质31中，将液滴(分别由核酸提取液14、清洗液13以及PCR反应液12组成)封入起来，并把由分散有磁性体粒子的含核酸试样构成的液滴2，置于液滴封入介质31上的状态的视图；(b)是(a)的在容器上设置有盖45和基板(陶瓷板)43和加热器5，使其产生温度梯度状态的剖视图。图2为模式地表示在图I的容器中，通过(a) (g)进行核酸扩增反应的形态的图(a)由磁铁61的操作而从由分散有磁性体粒子的含核酸试样构成的液滴2中，连同磁性体粒子8—起探取含核酸试样以及(b)使其移动，(c)进行核酸提取，(d)使含有所提取的核酸的试样与磁性体粒子一起移动，(e) (f)清洗之后使核酸以及磁性体粒子与核酸扩增反应液12合并，(g)使反应液向核酸扩增所需要的温度地点移动。图3是表示在实施例I中使用图2的装置进行操作的一连串过程的照片。标记(a) (h)以及赋予照片中的要素的符号，分别相当于图2中表示的标记与符号。图4表示了液滴封入形态的其他的例子。图5是通过在实施例I中进行的核酸扩增反应而得到的扩增产物的利用电泳检测的结果。图6是在参考例I中，(a-1)向硅油中添加荧光色素的情况、(b_l)未添加的情况的用紫外线照射观察PCR反应结束后的荧光的图像。图7是在装满液滴封入介质3的容器4中封入的、由含有磁性粒子8的PCR反应液构成的液滴11，通过磁铁61使其移动来实施PCR，并且在PCR中用于实时地荧光检测PCR产物的机器构成的示意图。符号说明I封入液滴3液滴封入介质4 容器
41输送面5加热源61磁场施加机构8磁性体粒子。
具体实施例方式[I.液滴]本发明中所涉及的液滴是指一种液体团块，所述液体团块具有由形成液滴的液体的内外压力差、和基于构成液滴的液体的分子间力而产生的表面张力的平衡所确定的形状(大体上为球状或其变形形状)。
[1-1.水系液体]作为在本发明中形成液滴的液体，只要是相对于后述的液滴封入介质为不溶性或难溶性的水系液体即可，可以水、水溶液或悬浊液的形态提供。作为水系液体的构成成分，包括供给于能够适用于本发明的反应以及处理的任何成分。作为反应,例如可以是化学反应以及生物化学反应。作为化学反应,包括伴随在水系进行的化学变化的任何反应。作为物质变化，包括无论是化合、分解、氧化还是还原。作为生物化学反应，包括伴随生物体物质的变化的任何反应。例如可以是核酸、蛋白质、脂质、糖等生物物质的合成系统、代谢系统以及免疫系统。作为处理，与否伴随有物质变化无关，包括任何处理。作为物质变化，也无论是化学变化还是物理变化。例如可以举出以下处理在上述的反应和分析之前进行的预处理、细分(分离)处理、溶解处理、混合处理、稀释处理、搅拌处理、温度调节(加热以及冷却)处理等。作为更具体的例子，可以举出用于进行核酸扩增反应的核酸扩增反应液，含有需要扩增的核酸的试样，用于提取核酸的核酸提取液，用于清洗核酸的磁性体粒子清洗液以及用于游离核酸的核酸游离液等。以下，关于作为比上述更具体的例子所例举的水系液体以及供给水系液体的反应和处理，将在下面进一步说明。[1-1-1.核酸扩增反应液]对于本发明中的核酸扩增反应液，包括用于一般的核酸扩增反应的各种的要素，还至少包括需要扩增的核酸以及磁性体粒子。如后面所述，由于核酸扩增反应不是特殊限定的反应，所以用于核酸扩增反应的各种要素，基于后面例出的公知的核酸扩增法等，本领域的技术人员能够适当地决定。通常，包括MgCl2、KCl等的盐类、引物、脱氧核苷酸类、核酸合成酶以及pH缓冲液。另外，上述的盐类可以适当地变更使用其他的盐类。另外，有时会进一步添加二甲基亚砜等为了减少非特异性引发的物质。对于需要扩增的核酸的来源没有特殊的限定。另外，能够由含有另外准备的核酸的试样来进行适当的预处理和制备。作为该预处理，例如可以举出从含有核酸的试样中进行核酸提取的处理、对吸附了核酸的磁性体粒子进行清洗的处理、以及进行从磁性体粒子游离核酸的处理等、不受封入介质中含有的荧光色素的影响的处理。
作为含有需要扩增的核酸的试样，没有特殊的限定，例如可以是如动植物组织、体液、排泄物等的来自生物体的试样，细胞、原虫、真菌、细菌、病毒等核酸含有体。体液包括血液、髓液、唾液、乳汁，排泄物包括粪便、尿、汗，也可以是它们的混合。细胞包括血液中的白血球、血小板、或口腔细胞及其他的粘膜细胞的剥离细胞，也可以是它们的混合。另外，含有核酸的试样，例如也可以细胞悬浊液、均浆、与细胞溶解液的混合液等形态进行制备。而且，在本发明中，有时把含有核酸的试样的一种形态或把含有核酸的试样经过预处理而得到的试样，记述为含有核酸的液体。本发明的核酸扩增反应液中，除了上述成分，还可含有封闭剂。使用封闭剂可出于防止因核酸聚合酶向反应容器的内壁或磁性体粒子表面等吸附而导致失活的目的而使用。作为封闭剂的具体例子，例如可以是牛血清白蛋白(即，BSA)及其他的白蛋白、明胶(即，变性胶原蛋白)、酪蛋白以及聚赖氨酸等蛋白质、或肽(上述的任意一种都无论是天然还是合成)。 对本发明所涉及的核酸扩增反应，没有特殊的限定，例如，可使用PCR法(美国专利第4683195号说明书，美国专利4683202号公报，美国专利4800159号公报，美国专利4965188号公报)，LCR法(美国专利第5494810号公报)，Q β法(美国专利第4786600号公报)，NASBA法(美国专利第5409818号公报)LAMP法(美国专利第3313358号公报)，SDA法(美国专利第5455166号公报)，RCA法(美国专利第5354688号公报)，ICAN法(日本国专利第3433929号公报)，TAS法(日本国专利第2843586号公报)等。这些核酸扩增反应所需要的反应液的组成和反应温度，可由本领域的技术人员适当地进行选择。在实时核酸扩增方法中，用能够对双链DNA进行染色的荧光色素而标记扩增产物，由此能够观察到由加热该双链DNA而产生的荧光色素的变化。作为实时核酸扩增法的检测法，可例举出下列的方法。例如，在通过高特异性的引物而仅使目的目标扩增时，可采用使用SYBR(注册商标)GREEN I等的嵌入剂法。通过与双链DNA结合而发出荧光的嵌入剂，与通过核酸扩增反应而使合成的双链DNA结合，并通过激发光的照射而发出荧光。通过检测该荧光强度，能够对扩增产物的生成量进行监控。这个方法，不需要设计、合成相对于目标为特异性的荧光标记探针，可简便地利用于各种各样的目标的测定。另外，在需要对很相似的序列进行区别、检测的情况下，或在进行SNPs分型的情况下，采用探针法。作为一个例子，有将用荧光物质来修改5'末端，用猝灭物质来修改3'末端的寡聚核苷酸作为探针使用的TaqMan (注册商标)探针法。TaqMan探针，在退火阶段与模板DNA特异性杂交，但由于在探针上存在猝灭剂，所以即使照射激发光也会抑制荧光发光。在延伸反应阶段，利用TaqDNA聚合酶具有的5' —3'核酸外切酶活性，如果与模板杂交的TaqMan探针被分解，则荧光色素就会从探针处游离出，由猝灭剂产生的抑制被解除而使荧光发光。通过测量该荧光强度，能够监控扩增产物的生成量。以下叙述通过这样的方法而用实时PCR对DNA进行定量的原理。首先，将进行了阶段稀释的、浓度为既知的标准样品作为模板使用来进行PCR。然后，求出达到一定的扩增产物量的循环数(threshold cycle ;Ct值)。以该Ct值作为横轴，以初始的DNA量作为纵轴作图，制作出标准曲线。关于未知浓度的样品，也在同样条件下进行PCR反应并求出Ct值。从该值和前述的标准曲线，能够测量出样品中的DNA量。并且，若从热变性到退火进行激发光的照射，也能得到扩增产物的融解曲线。由核酸扩增反应产生的双链DNA，基于DNA的长度及其碱基序列而具有固有的Tm值。即，若使含有结合了荧光色素的DNA的液滴温度慢慢上升，则可观测到荧光强度急剧地减少的温度。如果查出荧光强度的变化量，其温度峰与基于碱基序列和长度而规定的Tm值大体上相符。由此，可从阳性数据从排除不是目的基因，而是例如产生引物二聚体而观测到的数据等(即，假阳性数据)。在基因检查中，由于因试样中的夹杂物而产生非特异反应的情况较多，所以排除这样的假阳性是很重要的。由此，也能够判断生成的扩增产物是否是标的基因固有。
[1-1-2.核酸提取液]作为用于进行核酸的提取的核酸提取用液，可以举出含有离液序列高的物质、EDTA, Tris HCl等缓冲液。作为离液序列高的物质，例如可以是盐酸胍，异硫氰酸胍，碘化钾，尿素等。从含有核酸的试样中进行核酸提取的具体方法，可以由本领域的技术人员适当地决定。在本发明中，由于在液滴封入介质内的核酸的搬运中使用的是磁性体粒子，因此核酸提取方法也优选采用使用磁性体粒子的方法。例如，参考日本国特开平2-289596号公报，能够实施从含有核酸的试样中使用磁性体粒子进行的核酸的提取、纯化的方法。[1-1-3.清洗液]作为清洗用液，只要是能够在核酸吸附在磁性体粒子表面的状态下，将含核酸试样中所含有的核酸以外的成分(例如蛋白质、糖类等)，或将预先进行了核酸提取等其他处理中所使用的试剂及其他成分溶解的溶液即可。具体例如可以是氯化钠、氯化钾、硫酸铵等高盐浓度水溶液，乙醇、异丙醇等醇水溶液等。清洗吸附了核酸的磁性体粒子的具体方法，本领域的技术人员也可以适当地决定。另外，吸附了核酸的磁性体粒子的清洗次数，本领域的技术人员可按在核酸扩增反应的时候不会产生所不希望的妨碍的程度而进行适当地选择。另外，出于同样的观点也可省略
清洗工序。由清洗液构成的液滴，可制备至少与清洗次数相同的个数。[1-1-4.核酸游离液]作为核酸游离液，可以使用水或含有低浓度的盐的缓冲液。具体可以用Tris缓冲液、磷酸缓冲液、蒸馏水等。从吸附了核酸的磁性体粒子上使核酸游离的具体方法，也可以由本领域的技术人员适当地决定。[1-1-5.其他的水系液体]关于上述以外的任何反应以及处理，各自的水系液体的组成，也能够由本领域的技术人员容易地决定。[1-2.液滴的量]
作为完全被封入在封入介质中的液滴的量，例如可以为O. IyL 10 μ L或左右。[1-3.磁性体粒子]在本发明的方法中，为了因磁场的变动可使液滴移动，可以使磁性体粒子包含在液滴中。磁性体粒子，通常其表面具有亲水性基团。另外，磁性体粒子，最好是以使其包含在液滴中的形态预先封入在容器中的液滴封入介质中，如果是作为用于制作本发明的装置的试剂盒而被提供的情况，则也可以是包括在该试剂盒中的容器或液滴封入介质或者作为其材料另外添加的物品之一。磁性体粒子，只要是对磁有反应的粒子就无需特别地限定，例如可以是磁铁、Y -氧化铁、锰锌铁氧体等具有磁性体的粒子。另外，对于磁性体粒子，只要具有可与供给上述反应或处理的物质形成特异性结合的化学结构，例如氨基 、羧基、环氧基、抗生素蛋白、生物素、毛地黄毒苷、A蛋白、G蛋白、络合物化的金属离子，或者抗体的表面即可，也可以具有利用静电力、范德华力而表现与该物质特异性结合的形态的表面。由此，能够有选择地将供给反应或处理的物质吸附到表面上。作为磁性体粒子在表面具有的亲水性基团，例如可以是羟基、氨基、羧基、磷酸基、横酸基等。磁性体粒子，除了上述的以外，还可包括可由本领域的技术人员适当地进行选择的各种要素来构成。例如，作为表面具有亲水性基团的磁性体粒子具体的形态，优选可举出由磁性体与硅及/或阴离子交换树脂的混合物构成的粒子、以硅及/或阴离子交换树脂覆盖表面的磁性体粒子、介由氢硫基以具有亲水性基团的金覆盖了表面的磁性体粒子、含有磁性体并介由氢硫基在表面上具有亲水性基团的金粒子。作为在表面具有亲水性基团的磁性体粒子的大小，平均粒径可为O. Ιμπι 500 μ m左右。若平均粒径较小，则磁性体粒子容易以在液滴中分散的状态存在。作为磁性体粒子在市场上销售的例子，例如有作为东洋纺销售的Plasmid DNAPurification Kit MagExtractor-Plasmid-的构成试剂的 MagneticBeads。在作为这样的试剂盒的构成试剂销售的情况下，优选通过将含有磁性体粒子的产品原液用纯水(例如10倍量左右)使其悬浮来进行清洗。在这样的清洗中，在以纯水悬浮之后，可以通过离心操作而除去上清液来进行，可反复进行悬浮以及除去上清液。清洗后的磁性体粒子，能以分散在纯水中的状态而使用于本发明。这样的磁性体粒子通过被包入液滴内并进一步使磁场变化,能够与该液滴一起向磁场机构的移动方向移动。由此，液滴能够在保持液滴状态的同时进行移动。[2.液滴封入介质]作为液滴封入介质，使用相对于构成液滴的液体为不溶性或难溶性的化学惰性的物质。化学惰性物质是指在液滴的分选(分离)、混合、溶解、稀释、搅拌、加热、冷却等各种操作中，对构成液滴的液体没有化学影响的物质。本发明中的液滴封入介质更具体而言至少在液滴操作前是凝胶状态，并且在为该凝胶状态时以及超过凝胶-溶胶转化点而为凝胶状态时的两者情况下，相对于构成液滴的核酸扩增反应液均为不溶性或难溶性。在本发明中，通常使用向非水溶性或水难溶性的液体物质中添加胶凝剂而被凝胶化而得到的材料。另外，当在液滴封入介质中使后述的荧光物质溶解而使用的情况下，本领域的技术人员能够适当地选择能够溶解该荧光物质的材料。例如，作为具有某种程度的分子内极性的构成要素，有时优选具有苯基等的物质。具体来说，可采用二苯基二甲硅氧烷(diphenyIdimethicone)等含有苯基的娃油作为液滴封入介质的材料。另外，在用于制作本发明的装置的试剂盒中，可以该液体物质和胶凝剂已经混合以及凝胶化的状态提供，也可以是凝胶化前的该液体物质和胶凝剂作为分别的物品提供。[2-1.凝胶-溶胶转化点]若对液滴封入介质供给比凝胶-溶胶溶液转化点低的温度，则成为允许被封入在液滴封入介质中的液滴移动的不具有流动性的状态(即，凝胶状态)。为此，将液滴固定在任意的位置上，由此能够防止被封入的液滴向没有预料的方向移动。并且，能够一边这样地固定被封入的液滴，同时使包含在液滴中的磁性体粒子及其吸附物(具体是吸附在磁性体表面的、供给反应或处理的物质和液体)容易地进行移动。因此，即使是在互相接近的位置上配置封入液滴，封入液滴之间也不会混杂在一起，所以磁性体粒子及其吸附物可容易地在其封入液滴之间移动。另一方面，若对液滴封入介质供给比凝胶-溶胶转化点高的温度，则液滴封入介 质本身就成为有流动性的状态(即，溶胶状态)。由此，能够使该被封入的液滴移动。即使在液滴的体积与磁性体粒子总体相比较大的情况下，也能够进行那样的液滴整体的移动。这样的液滴封入介质，通过暴露在后述的温度变化区域中，如图1(b)所示，能够简单地实现在同一容器内使没有流动性的凝胶31的相和没有流动性的溶胶32的相双方共存的状态。溶胶-凝胶转化点，可设定为40 50°C。溶胶-凝胶转化点，可以根据油的种类、胶凝剂的种类和胶凝剂的添加量等条件进行变动。因此，该各条件可由本领域的技术人员适当地选择，以使得能够达到期望的溶胶-凝胶转化点。[2-2.非水溶性或水难溶性的液体物质]作为非水溶性或水难溶性的液体物质，可使用相对于25°C的水的溶解度大概在IOOppm以下、在常温(20°C ± 15°C )下为液体状的油。例如，可将由液体油脂、酯油，烃油以及硅油组成的组中的一种或两种以上组合起来使用。作为液体油脂，例如可以是亚麻油、山茶油、澳洲坚果油、玉米油、貂油、橄榄油、鳄梨油、山茶花油、蓖麻油、红花油、杏仁油、桂皮油、荷荷巴油、葡萄油、葵花籽油、杏仁油、菜籽油、芝麻油、小麦胚芽油、米胚芽油、米糠油、绵籽油、豆油、花生油、茶籽油、月见草油、蛋黄油、肝油、椰子油、棕榈油、棕榈核油等。作为酯油，例如可以是辛酸十六烷脂等辛酸酯、月桂酸己酯等月桂酸酯、肉豆蘧酸异丙酯、肉豆蘧酸辛基十二烷基酯等肉豆蘧酸酯、棕榈酸辛基等棕榈酸酯、硬脂酸异鲸醋酯等硬脂酸酯、异硬脂酸异丙酯等异硬脂酸酯、异棕榈酸辛酯等异棕榈酸酯、油酸异癸等油酸酯、己二酸异丙酯等己二酸酯、癸二酸乙酯等癸二酸酯、苹果酸异硬脂酸酯等苹果酸酯，三辛酸甘油酯、三异棕榈酸甘油酯等。作为烃油，例如可以是十五烷、十六烷、十八烷、矿物油、液体石蜡等。作为硅油，例如可以是二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷及其他的含有苯基的硅油、甲基含氢聚硅氧烷等。[2-3.胶凝剂]
作为胶凝剂，可从由羟基脂肪酸、糊精脂肪酸酯以及甘油脂肪酸酯组成的组中选出的油胶凝剂的一种或两种以上组合起来使用。作为羟基脂肪酸，只要是具有羟基的脂肪酸就没有特殊的限制。具体的例如可以是，羟基肉豆蘧酸、羟基棕榈酸、二羟基棕榈酸、羟硬脂酸、二羟基硬脂酸、羟基十七酸、蓖麻油酸、反蓖麻酸、亚麻酸等。在这些中特别优选的是羟硬脂酸、二羟基硬脂酸、蓖麻油酸。这些羟基脂肪酸，可以单独使用，也可以将两种以上合用。另外，作为这些混合物的动植物油脂肪酸(例如，蓖麻油脂肪酸、氢化蓖麻油脂肪酸等)也能够作为上述的羟基脂肪酸使用。作为糊精脂肪酸酯，例如可以是肉豆蘧酸糊精酯〔商品名称「>才〃一& MKL」，千叶制粉株式会社制〕、棕榈酸糊精酯〔商品名称「>才^一> KL」，「>才^一> TL」，均为千叶制粉株式会社制〕、(棕榈酸/2-乙基己酸)糊精酯〔商品名称「>才〃一 ATT」，千叶制粉株式会社制〕等。作为甘油脂肪酸酯，例如可以是甘油二十二烷酸酯、八硬脂酸甘油酯、二十烷酸甘油酯等，也可以将这些物质的一种以上组合使用。具体地可以举出含有20%的甘油二十二烷酸酯、20%的八硬脂酸甘油酯以及60%的固化棕榈油的商品名称“TAISET 26”〔太阳化 学株式会社制〕，含有50%的甘油二十二烷酸酯以及50%的八硬脂酸甘油酯的商品名称“TAISET 50”〔太阳化学株式会社制〕等。添加在非水溶性或水难溶性的液体物质中的胶凝剂的含量，可使用相当于该液体物质的总重量的例如O. I O. 5重量％、0. 5 2重量％、或I 5重量％的量的胶凝剂。然而，并不限定于此，本领域的技术人员可以对能达到期望的凝胶以及溶胶状态的程度的量做适当地决定。本领域的技术人员能够适当地决定凝胶化的方法。具体来说，可对非水溶性或水难溶性的液体物质进行加热，向加热后的该液体物质中添加胶凝剂，在胶凝剂完全溶解之后进行冷却。作为加热温度，可考虑所使用的液体物质以及胶凝剂的物性适当地决定。例如，优选有时设为60 70°C左右。胶凝剂的溶解可在平稳地混合的同时进行。冷却最好是缓慢地进行。例如，可用I 2个小时左右的时间进行冷却。例如在常温(20°C ±15°C)以下，优选将温度降到4°C以下就能够完成冷却。作为上述凝胶化的方法优选形态中的被适用的一种形态，例如，可使用上述例举的TAISET 26〔太阳化学株式会社制〕的形态。[2-4.液滴封入介质的形态]作为期望的凝胶以及溶胶状态的一个例子，可以举出实现前面所述的凝胶-溶胶转化点的程度。作为期望的凝胶以及溶胶状态的另外一个例子，可以举出可实现优选能够对完全被封入的液滴进行固定的凝胶状态的程度。作为优选的固定状态，可以举出至少基于重力程度的外力而封入液滴不移动的程度。所谓不移动，是指在容器底面的液滴的接触部分的位置，最好是几乎不变化的程度。作为期望的凝胶以及溶胶状态另外的一个例子，例举如下。S卩，如图1(b)所示，在凝胶状的液滴封入介质31上，放置含有10 1000 μ g左右的磁性体粒子的O. 05 5 μ L左右的液滴2(水溶液或悬浊液的形态)，如图2(a)所示，在从容器底面侧由磁铁61施加磁场的时候，在该液滴2中含有的磁性体粒子8对磁场作出反应，能与其吸附物一起沉淀到容器的底面。
作为期望的凝胶以及溶胶状态另外一个例子，可以举出溶胶状态的液滴封入介质具有5mm2/s 100mm2/s,优选5mm2/s 50mm2/s,例如20mm2/s左右(50°C )的运动粘度的程度。尤其是在进行需要接近100°C高温条件的核酸扩增反应的时候，优选采用具有这样的运动粘度的物质。如果低于5mm2/s，则在高温中液滴封入介质有容易挥发的趋势，另外，如果超过100mm2/S，则有容易阻碍因磁场的变化而产生的液滴移动的趋势。作为这样的液滴封入介质，作为优选物质的一种，例如可为在硅油中添加胶凝剂而成的物质。关于凝胶状态的液滴封入介质的物性，动态粘弹性中的存储粘弹性(storageviscoelasticity)E’，优选在常温(20°C ±15°C)下为10 lOOkPa，进一步优选为20 50kPa。[2-5.封入介质的量]关于液滴封入介质的使用量，可没有特殊的限定地决定可将液滴完全封入的足够的量。在本发明中，即使是在以往的方法(即，在核酸扩增反应开始时仅向液滴中添加荧光物质的方法)中不能充分地检测出扩增产物的程度的量也被允许。 具体来说，能够使用液滴容量的1000 50000倍或者20000 200000倍的液滴封入介质。设置为上述的范围，在操作性良好地输送液滴的方面优选。若超过上述范围，则为了形成适合PCR开始的温度环境而需要很多的时间，有在分析开始之前花费时间的趋势。例如，在本发明中，在至少在液滴封入介质中所含有荧光物质的形态中，当在液滴中进行核酸扩增反应的时候，即使是以在核酸扩增反应开始时仅向液滴中添加荧光物质的以往的方法不可能充分地检测出扩增产物的量，在本发明中也允许。例如，能够使用液滴容量的1000 10000倍或者5000 100000倍的液滴封入介质。如果低于上述范围，则有液滴内的荧光色素过多，因检测荧光时的背景上升而使S/N比下降的趋势。如果超过上述范围，则有从液滴内使荧光色素散逸、检测灵敏度下降的趋势。液滴封入介质被保持在容器中，具体地如图1(b)所示，并以接触输送面41的方式被填充。在这种情况下，关于容器中的液滴封入介质的填充高度H3 (填充厚度)，没有特殊的限定，可决定为能够将液滴完全封入的足够的量。通常，可将填充高度H3设定为被封入的液滴的高度Hl以上。另外，由于本发明中的液滴封入介质具有良好的液滴封入性，所以允许有如以下所述的形态。即，如图4(a)所示，也允许在容器中的液滴I不存在的区域的填充高度H3比被封入的液滴(被封入在容器中的体积最大的液滴)的高度Hl低的部分产生的形态。[3.荧光物质]荧光物质可至少包含在液滴封入介质中。在液滴中进行核酸扩增反应时优选这个形态。这时，最迟在核酸扩增反应开始时，至少在液滴封入介质中含有荧光物质。而且，本发明人确认了在核酸扩增反应的预处理也在相同的液滴封入介质内的另外的液滴内进行的情况下，即使从预处理的阶段开始就在该液滴封入介质中含有荧光物质，荧光物质也不会影响预处理。作为荧光物质没有特殊的限定，本领域的技术人员可以适当地决定在核酸扩增反应中用于核酸检测的物质。具体来说，例如可为SYBR(注册商标)GREEN I、溴化乙锭、SYTO (注册商标)_13、SYTO (注册商标)_16、SYTO (注册商标)-60 > SYTO (注册商标)-62 >SYTO(注册商标)-64、SYTO(注册商标)-82、Ρ0Ρ0(注册商标)-3、Τ0Τ0(注册商标)-3、BOBO (注册商标)-3、TO-PRO (注册商标)-3、YO-PRO (注册商标)-1、SYTOX Orange (注册商标)等。如果在核酸扩增反应的开始时刻,仅液滴中含有荧光色素分子,则荧光色素分子从液滴向液滴封入介质扩散，难于检测扩增产物。在本发明中，以对预期要扩散的荧光色素分子给与补充的目的，预先使荧光色素分子包含在液滴封入介质侧。荧光色素分子，在核酸扩增反应开始时，可仅包含在液滴封入介质中。这时，最初包含在液滴封入介质侧的荧光色素分子，首先渗透到液滴内，由此可以检测出核酸。另外，荧光色素分子还可在核酸合成开始时预先被包含在液滴和液滴封入介质的双方中。对具体的液滴中的荧光分子浓度和液滴封入介质中 的荧光分子浓度没有特殊的限定。例如，有时优选调整浓度以使得液滴中的荧光分子浓度比液滴封入介质中的荧光分子浓度高。其原因是，由于液滴封入介质中的荧光色素向液滴的渗透压力较高，所以把液滴封入介质侧的荧光色素浓度设定得较低，这样能够将液滴内的荧光色素浓度恒定化。如上所述，通过至少使荧光色素分子包含在液滴封入介质侧，能够保持液滴内的荧光色素浓度在维持核酸扩增反应的期间可稳定地进行扩增产物的检测的程度。这样，在本发明的方法中，能够适当地保持液滴内的荧光色素浓度，因此即使在核酸扩增反应结束的时刻也能有效地检测扩增产物。具体来说，能够把液滴封入介质中包含的荧光色素的浓度设为O. 01 O. 5 μ M。可进一步把该浓度范围的上限设为O. 2 μ Μ、O. I μ Μ、O. 05 μ M或O. 02 μ Mo另外，可进一步把该浓度范围的下限设为O. 02 μ Μ、0· 05 μ Μ、0· I μ M或O. 2 μ Μ。另一方面，包含在液滴中的荧光色素的浓度，可设定为O 20Μ。可进一步把该浓度范围的上限设为10μΜ、5μΜ、2μΜ、1μΜ*0.5μΜ。另外，可进一步把该浓度范围的下限设为0.5μΜ、1μΜ、2μΜ、5μΜ*10μΜ。设为上述范围是因为有在维持反应的期间能够容易稳定地进行扩增产物的检测的优点。在本发明中，例如，有时液滴封入介质中的荧光色素的浓度优选为O. 05
O.I μ Μ、液滴中的荧光色素的浓度优选为O. 5 μ M 2 μ Μ。[4.容器]关于容器，只要为能保持液滴封入介质的容器即可。另外，容器只要在其内壁上具有使液滴移动的(即，液滴可直接接触)输送面即可，对其形状没有特殊的限定，例如可以是如图4(a)所示的具有输送面41的基板43的结构，或者是如图1(b)所示的具有以与基板(陶瓷板)43上接触的方式设置并且具有输送面41的底材42，和围绕在该输送面41周围的壁44的结构。作为构成本发明的装置的一部分被提供的该容器，通过使其大小尽可能小型化而能够作为液滴操作用微装置或液滴操作用芯片而提供。另外，如图1(b)所示，通过进一步具有覆盖该壁44所包围的空间的盖45，可封闭该空间。该盖45，也可以使其整体或一部分能够开关，以便向容器内放入含有用于进行核酸扩增反应等处理的试剂或试样的液滴。反应容器如果为具有输送面的基板或底材和壁、或者有输送面的基板或底材和壁以及盖一体成形的结构，就能构建完全封闭体系，因此优选。构建完全封闭体系，由于能够防止处理中来自外部的污染，因此是非常有效的。
[4-1.材质]为基板或底材且作为具有输送面的材料的材质没有特殊的限定，但为了降低液滴在移动时的移动阻力，优选输送面为疏水性。作为能提供这样性质的材质，例如可以是聚丙烯、特氟隆(注册商标)、聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯等树脂材料。另一方面，作为采用基板上设置具有输送面的底材的容器时的基板，除了上述的材料以外，还可以采用陶瓷、玻璃、硅、金属等。在本发明中，作为基板或底材的材料，优选采用树脂，尤其是聚丙烯。在作为底材使用的时候，优选薄膜状。具体来说，厚度例如可以为3μπι以下的超薄薄膜。并且，在鉴于需要加温条件的反应或在处理中要求的耐热性、在液滴移动时所要求的疏水性、粘接性、加工性，廉价性等时，优选采用超薄聚丙烯膜作为底材。另外，与液滴以及液滴封入介质接触的输送面，其一部分可以具有对液滴有亲和物性的部分。例如，在该部分中能够预先实施使疏水性相对薄弱、使亲水性相对提高、使表面粗糙度相对提高的处理。若在这样的部分配置液滴，则即使在液滴封入介质具有流动性的情况下，也能够防止被封入的液滴无意中的移动。 [4-2.物性]在从反应容器外部或反应基板背面等进行液滴的吸光度、荧光、化学发光、生物发光、折射率的变化等测定的情况下，为了能进行光学检测等基板及底材优选为具有透光性的基板和底材。另外，优选使用具有在需要加温条件的反应或处理中也可保持与液滴的高接触角的表面的材料。具体来说，优选采用聚丙烯或具有聚丙烯以上的接触角的树脂。在基板表面上的液滴的接触角优选为95° 135°左右(25°C )。为了使液滴移动，与液滴以及液滴封入介质接触的输送面优选为平滑面，尤其优选表面粗糙度为Ra = O. I μ m以下。例如，在通过使永磁铁从容器底侧接近基板而使磁场变化产生液滴移动时，磁性体粒子在被推向基板的表面的同时进行移动，通过具有Ra =
O.I μ m以下的表面粗糙度，可充分具备磁性体粒子向永磁铁移动的追从性。[4-3.温度变化区域]在使液滴移动的输送面上设置有温度变化区域。温度变化区域设置有温度梯度，以使得沿着输送面上的液滴输送路径而连续地变化温度。温度梯度，例如将加热源5与容器底面或如图1(b)中记载的那样的与容器底面相接的基板43的一部分接触，通过以一定温度加热而形成。由此，在基板表面或底材表面上，能形成具有热源正上方的地点为最高温并具有随着远离热源而温度下降的温度梯度的温度变化区域。通过使磁场变动，能够将液滴移动、配置到该温度变化区域内的、对于所实施的反应或处理所需要的温度地点。另外，可通过仅使液滴移动，将液滴中的液体温度迅速地调节为该地点的温度。因此，即使在所实施的反应或处理需要温度变化的时候(例如，在进行核酸扩增反应的时候)，可仅通过液滴的移动就能够迅速且容易地使液滴的温度升温以及降温。加热源被设定为所实施的反应或处理所需要的温度中的最高温度以上。另外，在将与加热源接触的一侧作为高温侧而形成的温度梯度的低温侧，也可以设置散热片或冷却风扇等冷却源。通过设置冷却源，能够加大在温度变化区域内形成的温度梯度。
另外，即使采用树脂那样的热传导性低的材料作为基板或底材的材料，也同样能够将在温度变化区域内形成的温度梯度变大，因此可以进行在窄的区域内的局部温度调节。若这样地把浓度梯度设定得较大，在所实施的处理中，即使在要求有二种以上的比较大的温差的温度条件的时候，也能够在较短的液滴移动距离内完成处理。这就能够进行高效率的处理，另外，还能够使反应容器小型化。[5.磁场施加机构]关于带来用于使液滴移动的磁场变化的磁场施加机构或磁场移动机构，没有特殊的限定。作为磁场施加机构，能够使用永磁铁(例如铁氧体磁铁或钕磁铁)或电磁铁等的磁力源。磁力源可以使容器内存在的液滴中分散的磁性体粒子向输送面侧凝聚的状态，配置在容器的外侧。由此，磁力源隔着容器的输送面对磁性体粒子产生磁场，可捕捉磁性体粒 子群以及含有磁性体粒子群的液滴。作为磁场移动机构，例如，可以采用以能够保持磁性体粒子的凝聚形态的状态，使磁场向输送面方向移动的机构。例如，如图4所示，可以采用能够使磁力源(例如磁铁61)本身与输送面41大体上平行地进行机械移动的机构62。利用磁力源61，隔着容器的底面而被捕捉的磁性体粒子群8以及含有其的液滴11，能够追随磁力源的移动而在输送面41上移动。由此，能够进行封入液滴的移动、将封入液滴作为母液滴的子液滴的分离以及封入液滴与封入液滴的合并。另外，作为磁场移动机构，优选还具有能够切断或减弱向磁性体粒子的磁场的机构。磁场的切断或减弱的程度可为凝聚的磁性体粒子群能够在液滴中分散的程度。例如，可采用通电控制机构。再例如，可采用可将隔着输送面而配置在容器外侧的磁铁向与该输送面大体垂直方向移动的机构。通过使该磁铁远离输送面，能够切断或减弱磁场。由此，可在封入液滴中使磁性体粒子群分散，将吸附在磁性体粒子上的成分充分地暴露在构成封入液滴的液体中。此外，还可具有能够控制磁场变化的装置。例如，通过具备能够使磁力源进行振幅运动的功能，能够作为搅拌器代用品。由此，可容易地进行液滴之间的混合和搅拌。另外，作为能使磁场在输送面方向上移动的机构并且不伴随上述那样的磁力源本身的机械移动的例子，可以采用大体上与输送面平行并以一维或二维配置的电磁铁阵列以及通电控制机构。如果向电磁铁通电,则可以捕捉液滴,如果停止向电磁铁通电,则可通过切断磁场而使液滴移动、磁性体粒子分散成为可能，通过控制向电磁铁的通电，可以进行磁场变化的控制。这样不伴随磁力源的机械移动的形态，本领域的技术人员可以参照日本国特开2008-12490号公报适当地进行实施。[6.荧光检测机构]荧光检测机构不是特殊被限定的机构，只要是本领域的技术人员就能够容易地进行选择。如果举一个例子的话，则如图7所示，使用由发光部73、照相机(CCD照相机)72、同轴反射系统74以及个人电脑(PC) 71构成的机构，从发光部73通过光缆74进行向安装在CCD照相机72上的同轴反射系统75的入射，通过同轴反射系统75的镜头组能够进行向反应容器内4的液滴11的照射。通过CCD照相机能够把检测出的电信号实时地向PC发送，并能够跟踪液滴的荧光强度的变化。这对于在本发明进行检测实时核酸扩增反应等可变化的荧光强度的反应或处理时是合适的。作为发光部可采用LED、激光、灯等。另外在检测中从廉价的光电二极管到以更高灵敏度作为目标的光电倍增管等各种受光元件可没有特殊的限定地进行利用。若以进行实时核酸扩增反应等核酸相关反应或核酸相关处理的情况为例的话，例如以SYBR(注册商标)GREEN I为例子，则由于该色素与双链DNA特异性结合，在525nm附近产生荧光，因此CCD照相机能够对目的波长以外的光用滤光片进行剪切，在CCD元件的受光面上检测出光。另外，若以进行核酸扩增反应的情况为例的话，供给至核酸扩增反应的液滴的荧光观测可在进行利用DNA聚合酶的延伸反应(通常为68 74°C左右)的温度地点照射激发光，并以在该地点使液滴停止的状态在暗室内进行。此外，若将激发光的照射范围扩大到从进行热变性的温度地点开始至进行退火的温度地点为止，则在使液滴移动的同时能够得到扩增产物的融解曲线。
[7.液滴以及磁性体粒子的操作]液滴封入介质以液滴可在液体封入介质中存在的方式被保持在反应容器内。有时将完全存在于液滴封入介质中的液滴记为封入液滴。在本发明的液滴操作中，能够进行液滴向液滴封入介质中的封入(7-1)、封入液滴的移动(7-2)、从被封入的母液滴中分离子液滴(7-3)以及封入液滴之间的合并(7-4)。而且，在本发明中，为了构建所适用的反应体系或处理体系，可分别准备必要的要素。作为进行这样的形态的情况，可举出优选将供给该反应或处理的酶、催化剂和特定的试齐U，在其反应或处理之前预先与其它要素隔离，由此防止降低活性。例如可举出为了构成核酸扩增反应液而分别准备所需要的要素的情况。这时，可预先将核酸聚合酶(例如，用于以热启动方式实施的耐热性聚合酶等)等酶或特定的核酸扩增用试剂，在反应开始之前与其他的核酸扩增用试剂隔离。作为该形态的其它例子，可举出将供给反应或处理的试样，在反应或处理开始之前预先进行隔离的情况。也可以在该隔离期间对该试样进行预处理。例如可举出供给扩增反应的核酸作为含有核酸的生物试样被提供。在这些情况下，可将含有为构建反应体系或处理体系所必须的要素的一方的水系液体配置在输送路径上，并根据上述方法将含有该另一方的水系液体配置所述输送路径的其它位置上。这时，被隔离的一方要素和另一方要素可通过封入液滴的移动以及封入液滴之间的合并，或者如果从被封入的母液滴中可分离子液滴，则通过该分离以及封入液滴之间的合并，来使其混合。另外，与上述形态不同，还可利用上述方法将含有为构建反应体系或处理体系所必须的要素的一方的水系液体配置在输送路径上，将含有该另一方的水系液体不封入至液滴中，而是以液滴状态预先置于凝胶化状态的液滴封入介质上。这时，被隔离的一方要素和另一方要素可通过采用7-1-2的封入法使其混合。[7-1.液滴的封入][7-1-1.基于液滴添加的封入法]液滴的封入可在液滴操作开始之前，在进行了使胶凝剂溶解在被收容在容器中的液体物质中的混合液的制备之后，通过滴加需要形成液滴的溶液等进行添加，之后通过冷却该混合液并使之凝胶化来进行。液滴的封入还可在液滴操作开始之前，在向溶胶状的液滴封入介质中滴加液滴之后，通过供给凝胶-溶胶转化点以下的温度而使液滴封入介质凝胶化来进行。另外，还可通过穿刺至凝胶状态的液滴封入介质中而直接注入水系液体来进行。根据以上的方法，进行在液滴封入介质中的液滴的完全封入、固定化，另外，在被固定化的情况下也容易保存。例如，如图1(a)所示，被封入的液滴12、13以及14位于输送路径上，并以接触容器4内壁的输送面41的方式被配置。在液滴的封入中，也可以实行下面的方法。例如，如图4(b)所示，在多孔板等多孔装置9上铺设薄的底材42，当填充液滴封入介质3时，由于封入介质3的重量，铺设在该孔上面的底材会向下弯曲，能够形成低洼的部分。通过在该低洼的部分配置液滴1，即使在液滴封入介质3还具有流动性的情况下，也能够阻止滴加的液滴I无意中的移动。并且，在封入多个液滴的时候，由于能缩短液滴之间的间隔，因此也能够使容器小型化。
[7-1-2.基于封入介质上的液滴与封入液滴合并的封入法]在利用上述方法将含有为构建反应体系或处理体系所必须的要素的一方的水系液体配置在输送路径上，并将含有该另一方的水系液体以液滴状态预先置于凝胶化状态的液滴封入介质上的情况下，按下述操作使两要素混合。在没有流动性的凝胶状的液滴封入介质上以液滴状态放置液体时，例如，如图1(b)所示，在液滴封入介质31的上面的一部分上利用按压或切削等而设置凹坑，在该凹坑中能够放置液体2。通过形成这样的凹坑，能够防止置于液滴封入介质31上的液体2无意中地蔓延和移动。对于凹坑的深度D2没有特殊的限定。例如，优选凹坑最深的地方不要达到输送面41的程度。或者，也可以是不要达到接触输送面地已被封入的液滴高度的程度。具体来说，凹坑的深度D2有时只要为约Imm左右就足够了。通过对液滴封入介质供给溶胶-凝胶转化点以上的温度，液滴封入介质可以溶胶化并呈现出流动性，含有该另一方要素的液滴，在液滴封入介质中沉淀到容器底面。沉淀的液滴，通过与含有已经被封入的一方要素的液滴合并，使一方要素与另一方要素混合，共存在一个封入液滴中，由此成为能够供给反应或处理的状态。为了使含有另一方要素的液滴与含有一方要素的液滴合并，可在含有一方要素的液滴被封入的位置的正上方放置含有另一方要素的液滴。或者，只要在含有一方的另一方的要素的液滴与含有另一方的要素的液滴中的至少任意一方中含有磁性体粒子，就能够使在容器的底面的、与含有一方要素的液滴被封入的位置不同的位置上使含有另一方要素的液滴沉淀，通过施加磁场的变化而使含有磁性体粒子的液滴移动，由此能够使两液滴合并。另外，液滴封入介质保持凝胶状态，如图2(a)所示，液滴封入介质31保持凝胶状态，使磁力源(磁铁)61接近容器4,产生从输送面41侧向液滴封入介质31上的液滴2方向的磁场，由此，可在保持该液滴2放置在液滴封入介质31上的情况下将磁性体粒子8向输送面41方向分离。这时，被分离的磁性体粒子8由于磁力成为集合体，成为集合体的磁性体粒子群将其吸附的物质以及若干液体引领到其周围。换句话说，将如图1(a)所示的液滴2作为母液滴，分离出如图21(b)所示的含有磁性体粒子的子液滴lib。被分离出的子液滴11b，沿着磁场的引导，在破坏凝胶的三维结构的同时从液滴封入介质31中通过，并沉降到容器输送面41上(图2(b))。
作为这种形态的具体例子，被置于液滴封入介质上的液滴，只要是由含有磁性体粒子和需要扩增的核酸的试样构成的液体即可。这时，子液滴以包含由含有磁性体粒子以及吸附在其上的核酸的试样组成的液体的状态而得到。沉淀的子液滴11b，通过与已经被封入的含有一方要素的液滴14合并，使一方要素与另一方要素混合，共存在一个封入液滴Ilc中，由此成为可供给核酸扩增反应或其预处理的状态。[7-2.被封入的液滴的移动][7-2-1.溶胶状态的液滴封入介质中的液滴的移动]在具有流动性的溶胶状态的液滴封入介质中被封入的含有磁性体粒子的液滴，在液滴输送路径中移动的原理如下。即，如图2(g)以及(h)所示，当从容器的输送面41向容器内部的方向使磁铁61接近等而产生磁场，并通过使磁场沿与容器的输送面41大体平行地移动而使磁场发生变化时，含有磁性体粒子的液滴Ilg在液滴内磁性体粒子向移动方 向一侧集中，使液滴总体向该移动方向运动的力起作用。由于在本发明中使用的磁性体粒子表面的亲水性，当磁性体粒子在液滴输送路径中移动时，牵引力传递至形成液滴的水，而且，如果基板上的液滴的接触角足够大、输送面的表面粗糙度足够小、液滴封入介质的运动粘度足够低、磁场移动的初速度足够慢，则磁性体粒子就不会克服液滴的表面张力而从液滴中飞出，能使液滴总体移动。例如，当输送面上的液滴的接触角为105° (250C )、输送面表面粗糙度为Ra =
O.I μ m、液滴封入介质的运动粘度为15mm2/s(25°C )时，例如在将水中含有粒径为3 μ m、500 μ g的量的磁性体粒子的磁性体粒子分散液3 μ L封入在液滴封入介质中，并且使铁氧体制的永磁铁从容器外侧靠近的情况下，若以IOcm/秒以下的初速度使磁铁移动，则磁性体粒子不会克服液滴的表面张力而从液滴中飞出，可使液滴总体移动。这时，能以最高速度IOOcm/秒使液滴总体移动。使含有磁性体粒子的液滴移动的条件，可通过设定形成液滴的水系液体的组成、磁性体粒子的粒径和使用量、输送面上的液滴的接触角、输送面表面粗糙度、液滴封入介质的运动粘度、磁场强度、磁场的变化速度等参数而再现性良好地进行实施。只要是本领域的技术人员，就能够在确认含在液滴中的磁性体粒子的行为的同时，调整各参数来实施。而且，在这样的形态下能够使其移动的液滴的体积，本领域的技术人员可以适当地决定，但例如使用10 1000 μ g的磁性体粒子的时候,可设定为O. 05 μ L 5 μ L。[7-2-2.凝胶状态的液滴封入介质中的液滴的移动]由于凝胶状态的液滴封入介质具有凝胶独特的特性，所以可在其本身不具有流动性的状态下使封入的液滴移动。凝胶状态的液滴封入介质中的被封入的含有磁性体粒子的液滴，能够在破坏液滴封入介质的凝胶的三维结构的同时，在液滴输送路径上移动。例如，在溶胶状态下的输送面上的液滴的接触角为105° (25°C )、输送面的表面粗糙度为Ra = O. I μ m、凝胶状的液滴封入介质的运动粘度为15mm2/s (25°C )的情况下，例如在把水中含有粒径为3 μ m、500 μ g的量的磁性体粒子的磁性体粒子分散液3 μ L封入液滴封入介质中，并且使铁氧体制的永磁铁从容器外侧靠近的时候，若以IOcm/秒以下的初速度使磁铁移动，则磁性体粒子不会从液滴中飞出，可使液滴总体移动。这时，能以最高速度IOOcm/秒使液滴总体移动。
在于凝胶状态的液滴封入介质中使液滴移动的形态中，磁性体粒子搬运液滴的体积，多为在磁性体粒子周围附着的程度的很少量。例如，在使用100 500 μ g的磁性体粒子的时候，仅为IyL 5μ L左右。这个形态适于在以通过磁性体粒子搬运为目的成分仅为吸附在磁性体粒子表面的成分的情况等，磁性体粒子所吸引的液滴量越少越好的情况。[7-2-3.在温度变化区域上进行移动的时候]这样地使封入液滴本身移动的形态，优选用于需要使封入液滴的液温变化的情况。当通过在液滴输送路径上设置温度梯度而使输送面具有温度变化区域的时候，将封入液滴本身向构成封入液滴的溶液内可进行的处理所需的温度地点移动，由此可迅速且容易地调整液温。因此本发明有用于例如，在进行要求二种以上的较大温差的温 度条件的核酸扩增反应的情况。例如，在上述的核酸扩增反应中，在PCR法、LCR法、TAS法等中，需要将由从两到三个较大温差的温度条件构成的温度循环进行多次反复。如使用本发明的方法，则可如图2(g)以及(h)所示那样，对由具有上述亲水性表面的磁性体粒子、扩增目的核酸、荧光色素、含有核酸扩增反应所需要的物质的核酸扩增反应液构成的封入液滴Ilg施予磁场的变化，使液滴移动到核酸扩增反应的各工序所需要的温度地点，在各自的温度地点配置必要的时间，由此能够简单地实现核酸扩增反应的复杂的温度条件。另外，若将荧光色素至少包含在液滴封入介质中，则能够良好地检测出扩增产物，因此也能够实时地观测在液滴内的核酸扩增反应(实时核酸扩增)。另外，关于本发明，即使用户有可能采用的反应或处理所必需的温度遍及多种，也能够灵活地对应，例如，虽然SDA法、Q β法、NASBA法、ICAN法、ICAT法、RCA法等是在从37度到65度左右的范围内的某一温度条件下进行的等温扩增反应，但随着扩增对象不同而最佳温度不同。当在本发明的方法中使用这些核酸扩增方法时，通过仅在液滴的温度被控制在根据扩增对象的最佳温度的地点上配置液滴的简单操作，在采用哪种方法的情况下都能够实现优选的扩增效率。[7-3.从被封入的母液滴中的磁性体粒子以及附随的子液滴的分离][7-3-1.溶胶状态的液滴封入介质中的子液滴的分离]作为溶胶状态的液滴封入介质中的上述移动形态的变形形态，可举出移动的封入液滴为将另外液滴作为母液滴而分离的子液滴的形态。该另外的液滴是在同一容器内被封入在液滴封入介质中的液滴。在这个形态中，对被封入的该另外的液滴中所包含的磁性体粒子施加磁场，使其在输送路径上移动，由此不会使被封入的母液滴总体移动而抽出并分离磁性体粒子群。这时，被分离的磁性体粒子群将吸附在其上的物质以及一些来自液滴的液体(子液滴)引领到它的周围。例如，与可进行上述移动的诸条件相比，通过磁性体粒子的含量相对于母液滴较少、输送面上的液滴的接触角相对较小、输送面表面粗糙度相对较大、液滴封入介质的运动粘度相对较高、或者磁场变化的初速度相对较快等条件的变化，从含有磁性体粒子的母液滴中能够分离出磁性体粒子以及附随于它的子液滴。通过加大上述例示的条件的变化幅度等，能够加大附随于磁性体粒子的子液滴的体积。关于子液滴的分离，也与上述的液滴的移动同样，只要是本领域的技术人员就能够在确认液滴中含有的磁性体粒子的行为的同时调整各参数进行实施。
在这个形态中，由于液滴封入介质为溶胶状并具有流动性，因此被封入的母液滴本身不被固定。由于这个缘故，上述的诸条件越接近液滴本身的移动的条件，就越容易在液滴封入介质中运动，从母液滴中的磁性体粒子以及附随于它的子液滴的分离就越有困难的趋势。在这样的情况下，例如，可在输送面上的输送路径的一部分上，设置相对于液滴具有亲和物性的位点。例如，通过在该位点实施相对地减弱疏水性，相对地提高亲水性，或相对地提高表面粗糙度的处理，可防止配置在该位点上的母液滴无意中的移动。另外，即使在基板上所期望的地方，对被封入的母液滴从下方另外施加不移动的磁场等电场控制，也能得到同样的效果。[7-3-2.凝胶状态的液滴封入介质中的子液滴的分离]另一方面，如图2(c) (e)所示，从被封入在凝胶状的液滴封入介质31中的含有磁性体粒子的母液滴Ilc中，也可在液滴封入介质31保持不具有流动性的凝胶状态下，分离出磁性体粒子以及附随于它的子液滴lie。该形态，根据的是如图2(a) (b)所示的、从置于液滴封入介质31上的含有磁性体粒子的母液滴2中，分离出磁性体粒子以及附随于它 的子液滴Ilb的形态的同样的原理。S卩，被分离的磁性体粒子由磁力形成为集合体，成为集合体的磁性体粒子群引领吸附在它上面的物质以及若干液体(图2(e))。换句话说，把被封入的液滴Ilc作为母液滴，分离出含有磁性体粒子的子液滴He。分离出的子液滴He，能够沿磁场的引导在破坏液滴封入介质31的凝胶的三维结构的同时在输送路径上移动。另一方面，与磁性体粒子群相比，某种程度容量较大的封入液滴(即，母液滴lie)由于被凝胶状封入介质固定，而不能与磁性体粒子群一起移动。由于这个缘故，磁性体粒子8与附随在它上面的子液滴lie —起被分离，母液滴停留在原来的位置上(图2(d)、(e))。因此，不需要采用如在使用具有上述的流动性的液滴封入介质时所进行的那样的、为防止封入液滴无意中的移动的方法(电场控制等)，就能够非常容易地从母液滴中分离出含有磁性体粒子的子液滴。由此，凝胶状态的液滴封入介质配置液滴的自由度非常高。而且随之也能够高自由度地决定液滴输送路径。另外，如所述那样，在凝胶状态的液滴封入介质中使液滴移动的形态中，磁性体粒子搬运的液滴的体积，多为附着在磁性体粒子周围的程度的很少的量。由于这个缘故，在由磁性体粒子搬运作为目的成分仅为吸附在磁性体粒子表面的成分的情况下，在凝胶状态的液滴封入介质中从母液滴中分离出子液滴的形态将多余的液体成分的追随限制在最小限度，能够高精度地进行磁性体粒子吸附成分的分离，因而优选。[7-4.封入液滴与含有磁性体粒子的封入液滴的合并]通过向由在同一容器内的另外的封入液滴构成的液体中供给含有磁性体粒子的液滴，能够进行封入液滴之间的合并。封入了该另外的封入液滴的液滴封入介质，对是凝胶状还是溶胶状没有要求。通过液滴之间的合并，能够进行构成液滴的成分的混合、溶解、稀释等。若例举本发明适用于通过多种试剂的混合而进行的反应的情况，则可通过使含有该多种试剂中的一方的试剂和磁性体粒子的封入液滴移动，与含有另一方试剂的封入液滴合并(或者，在输送面有温度变化区域的情况下，进而向适合于该反应的温度地点移动)，而能够进行反应。同样地，也能够使得到的反应生成物进而与其他的试剂进行反应。
另外，本发明适用于与核酸有关的处理和反应的情况例举如下。可以由含有核酸或磁性体粒子的液体构成的封入液滴作为母液滴，使通过对磁场施加变化而分离的子液滴与由进行以核酸扩增反应为首的处理的液体构成的另外的封入液滴进行合并。作为另外的封入液滴，可以举出由核酸提取处理液构成的液体、由清洗液构成的液体、由核酸游离处理液构成的液体等。若例举进行核酸提取处理的情况，则如图2(b)所示，在液滴封入介质31中，使含有磁性体粒子以及附随于它的核酸及其他的成分的小液滴Iib移动，并与由核酸提取液构成的另外的封入液滴14合并(图2(c))，由此，可进行包含在小液滴Ilb中的核酸成分的提取。进而，通过施与磁场的变化，如图2(d)和(e)所示，从由与小液滴Ilb合并的核酸提取液构成的封入液滴Ilc中，被提取的核酸与小液滴Ile —起附随于磁性体粒子而分离，并向液滴封入介质31中移动。进行清洗处理的情况也相同地在封入介质中，使含有磁性体粒子以及附随于它的核酸的另外的小液滴移动，与由清洗液构成的另外的封入液滴合并，由此可进行磁性体粒子的清洗。通过进行磁性体粒子的清洗，能够进行吸附于磁性体粒子的核酸的清洗。进而 通过施予磁场的变化，可从由清洗液构成的封入液滴中，使被清洗的核酸与小液滴一起附随于磁性体粒子而分离，并向封入介质中移动。在进行核酸游离处理时候也是同样的。含核酸试样，或根据需要经过上述的核酸提取处理、清洗处理以及/或核酸游离处理的小液滴，与由核酸扩增反应液构的液滴合并(图2(f)，(g))。由此，能够得到由含有需要扩增的核酸和磁性体粒子的核酸扩增反应液构成的液滴Hg。使所得到的液滴Ilg移动至温度变化区域中的核酸扩增反应开始温度的地点(图2(h))，由此能够开始核酸扩增反应。如上所述，包括核酸扩增反应以及与其相关的预处理的一连串的处理，在完全密闭的体系中进行。并且，通过使磁性体粒子包含在封入液滴内并分散、为了移动而使其凝聚、在凝胶内的各液滴间以及期望的温度地点间移动，而能够简便地进行这些处理。实施例以下例举实施例对本发明进行更详细的说明。[实施例I]作为含核酸试样，使用的是口腔擦拭液以及细胞溶解液的混合液。口腔擦拭液，是使用棉棒刮拭探取口腔粘膜细胞，并在ImL的蒸馏水中悬浮而制备。通过将25yL的口腔擦拭液与含有最终浓度为2M的硫氰酸胍的细胞溶解液混合，制备出50 μ L的混合液。清洗液作为200mM氯化钾以及50mM Tris盐酸(pH8. O)的混合溶液而制备。关于PCR反应液，制备含有O. 125U的TaqDNA聚合酶(Takara Bio公司制)、各500nM浓度的β肌动蛋白检测用引物、500μΜ浓度的dNTP、I OmM浓度的氯化镁、I OmM浓度的Tris-盐酸缓冲液(ρΗ9·2)以及O. 2% (重量比)牛血清白蛋白(SIGMA制)的混合液。而且，β肌动蛋白检测用引物的序列是，5’-TGGCATCGTGATGGACTCCGGTGA-3’(序列号I)以及 5’ -GCTGTAGCCGCGCTCGGTGAGGAT-3’ (序列号 2)。关于容器，使用了在聚碳酸酯制的框上粘贴了厚度为2. 8μπι的聚丙烯膜作为底材的结构。为了制备液滴封入材料，在硅油(信越silicone KF-56)中以1% (重量比)添加12-羟硬脂酸(和光纯药)，并加热至90°C，使完全与硅油混合。将混合后的油，以使油层的厚度(填充高度)为3mm的方式放入容器中。然后，把油温度降到约60°C，在图1(a)和(b)所示的油放置清洗液的20 μ L液滴3个、PCR反应液的I μ L液滴I个。通过放置到油至室温为止，而使油总体凝胶化。如图1(b)所示，在凝胶化了的油表面的一部分上形成Imm左右的凹坑，在该凹坑中添加含有IOOyg磁性娃粒子(东洋纺制磁珠MagExtractor-genome-)的细胞溶解液以及口腔擦拭液50 μ L0用厚度为3mm的聚碳酸酯板盖上容器。如图1(b)所示，用电加热器加热厚度为Imm的氧化铝陶瓷板的端部，当在陶瓷板表面形成稳定的温度梯度的时刻放置容器，为了让容器内的油也形成同样的温度梯度，再放置10分钟。放置后，容器中的油存在由在陶瓷板上形成的温度梯度而溶胶化了的部分和保持凝胶化的部分的两者。包围着PCR反应液的油区域以及比它温度高的高温侧是溶胶状态，低温侧的包围着清洗液的油区域是溶胶状态。本实施例的油的凝胶-溶胶转变温度是约 50。。。 如图2(a) (h)所示那样进行了利用磁铁的液滴操作。在本实施例中采用的是使用了娃粒子和离液序列高的(chaotropic)盐的核酸的分离法(日本国特开平2-289596号公报)。首先，使磁铁垂直地以2mm/秒的速度向上方移动，如图2(a)以及(b)所示，通过靠近陶瓷板而从由含有磁性硅粒子的细胞溶解液以及口腔擦拭液的混合液构成的液滴中，使磁性粒子集合体向下方油层中分离。添加在该混合液中的硫氰酸胍使包含在口腔擦拭物中的口腔粘膜细胞溶解，并使游离的核酸吸附在磁性粒子表面上。如图2(b)以及(C)所示，使磁铁向高温侧移动，将磁性硅粒子以最初的清洗液清洗。清洗操作是为了从磁性硅粒子的集合体中去除阻碍PCR反应的核酸以外的试样源成分和硫氰酸胍而进行的。并且，如图2(c)至(f)所示，磁铁向高温侧使磁性硅粒子移动，使之通过由3个清洗液构成的液滴。此后,如图2(g)所示,磁性娃粒子集合体与由PCR反应液构成的液滴合并。围绕着由PCR反应液构成液滴的油因靠近加热器而温度较高而形成溶胶化，含有磁性粒子的PCR反应液本身可与磁性粒子一起随着磁铁的操作而移动。从最后的清洗液中分离出的磁性硅粒子集合体，虽然伴随有少量的清洗液的氯化钾和Tris-盐酸缓冲液(pH8. O)，但那些成分不会对酶反应有很大妨碍。如图2(h)所示，用磁铁使在图2(g)得到的液滴在施加了温度梯度(具体是从94°C到60°C )的陶瓷板上移动。这时，根据94°C、2秒，60°C、I秒，72°C、5秒的温度程序，通过磁铁移动而使液滴进行往返运动(40个循环)，由此完成PCR反应。表示在本实施例中进行的上述一连串的操作过程的照片如图3所示。在图3中的记号(a) (h)以及照片中的要素所带的符号，分别相当于图2中的符号。将反应终止后的液滴供给给琼脂糖凝胶电泳，确认了来自β肌动蛋白基因的扩增产物(151碱基)(图5)。这样，通过由磁铁在输送面上(底材面上)使由磁性粒子以及PCR反应液构成的液滴移动的简便操作，不用在容器内设置物理的流体控制机构，在一个容器中的一个输送面上，就能够连贯地进行利用磁性体粒子的试样的分离、清洗、从试样中的核酸提取以及利用PCR的目的基因的扩增。
下面的参考例I以及2，是至少在液滴封入介质中含有荧光色素并进行核酸扩增反应的例子。在液滴封入介质中，使用了非凝胶状的材料(即，不包含胶凝剂的材料)。本发明人已经确认，即使在使用本发明的凝胶状液滴封入介质的情况下，也能够得到与下列参考例同样的结果。[参考例I]作为具有亲水性表面的磁性体粒子，使用了作为由东洋纺销售的Plasmid DNAPurification Kit MagExtractor-Genome-试剂盒的构成试剂的 Magnetic Beads (以下仅称为磁性硅珠)。上述试剂盒内的磁性硅珠，预先将原液在10倍容量的纯水中悬浮，将通过500Xg、l分种的离心操作除去上清液的操作反复进行5次，由此进行清洗。然后，使磁性硅珠在纯水中悬浮，调整纯水中的磁性硅珠的含量，以使得同一硅珠干燥重量换算为IOOmg(dry)/mL。PCR反应液的组成为50mM的氯化钾、IOmM的Tris盐酸缓冲液(pH9. 5)、5mM的氯化镁、0·6μΜ 的 β 肌动蛋白检测用 PCR 引物(Forward) (Applied Biosystems 制造)、0· 6 μ M 的β肌动蛋白检测用PCR引物(Reverse) (Applied Biosystems制造)、以及O. 75U的耐热性DNA聚合酶(宝酒造制Ex Taq DNA Polymerase)。进而,为了防止由于DNA聚合酶向基板表面、磁性体粒子、油界面等的吸附而造成的失活，添加O. I (wt) %的牛血清白蛋白。该PCR反应液中含有3ng的人标准基因组DNA精制品(Roche制造)，以及以干燥重量换算为10 μ g/μ L的浓度的磁性硅珠。反应容器的底材采用了厚度为2. 8μπ 的聚丙烯膜(王子特殊纸7 > 7 7 >EM-501k)，并填充了硅油(信越化学性KF-56)。在由PCR反应溶液构成的液滴中，以产品原液的一万倍稀释浓度，添加了Invitrogen公司制的SYBR(注册商标)GREEN I。另外，在硅油中，相对于产品原液以5万倍稀释浓度，添加了 SYBR (注册商标)GREEN I。若纯化基因扩增产物，则伴随纯化可观察到荧光色素在结合了双链DNA时产生的荧光。根据本参考例，所进行的PCR反应的结果如图6所示。图6(a-l)为在硅油中添加了荧光色素的情况、(b-Ι)是将没有在硅油中添加荧光色素的情况的将PCR结束后的SYBR(注册商标)GREEN I的荧光，用紫外线照射观察到的图像。回收在聚丙烯制的管中的液滴，通过紫外线照射，只在向硅油中添加了荧光色素时的(a-Ι)中观察到了信号。这个信号，作为来自SYBR(注册商标)GREEN I的波长为472nm的黄绿色荧光而被观察到。在另一方的(b_l)中也产生了基因扩增，但几乎没有观察到荧光。而且，在(a-Ι)以及(b-Ι)的各自的情况下的基因扩增物的琼脂糖凝胶电泳结果在(a-2)以及(b-2)中示出。如(a-2)以及(b_2)所示，无论在哪种情况下，基因扩增都正常地完成了反应。[参考例2]除了分别使用SYBR-Green I, YO PR0-1 以及 SYT0_13(均为 Invitrogen 公司制造)的荧光色素、分别改变荧光色素的液滴侧浓度和油侧浓度而进行PCR的情况以外，进行了与上述参考例I相同的操作。液滴供给至PCR开始前的荧光强度，和供给至PCR开始后的荧光强度的差，在表I 3中示出。表I示出的是使用了 SYBR-Green I的情况的结果，表2示出的是使用了 YO PR0-1的情况的结果，表3示出的是使用了 SYT0-13的情况的结果。
而且，液滴容量都设为3 μ L，反应液的组成为25mM的Tris-HCl (pH8. 3)、8mM的MgCl2^O. 2% (w/V)的牛血清白蛋白、O. 125U/y L 的 Ex Taq DNA 聚合酶(Takara Bio 公司制)、250μΜ的dNTP，各IyM的人β -肌动蛋白基因检测用引物。人β_肌动蛋白基因检测用引物的序列是，5’-CATCGAGCACGGCATCGTCACCAA-3’(序列号 I)以及5，-GCGGGCCACTCACCTGGGTCATCT-3，(序列号 2)。将510 μ g的磁珠(东洋纺MagExtractor(R)-Plasmid-)添加在3 μ L的液滴中。作为液滴封入介质，使用了信越化学制的硅油KF-56。PCR反应工序，是按照Τ. Ohashi,
H.Kuyama, N. Hanafusa and Y. Togawa Biomed. Microdevices, 9,695 (2007)中记载的条件进行的。S卩，PCR循环将热变性(95°C，0. 5秒)，退火(60°C，1秒)以及延伸反应(72°C，5秒)作为I个循环，共进行了 40个循环。将设置在该液滴正下方、容器外的磁铁以每秒
I.Icm的速度，从基于温度梯度的95°C到60°C的地点之间使由含有磁珠的上述反应液构成的液滴移动，由此，实现了上述的PCR循环。使用冷却CXD照相机(SBIG公司制ST-402ME)，通过从油中的液滴正上方，以最高灵敏度5秒钟曝光摄影进行了液滴的荧光强度的测量。激发光源使用了 470nm蓝色LED，激发光侧带通滤波器使用了 475nm/40nm,以及检测侧的带通滤波器使用了 535nm/45nm。关于数据，使用了图像分析软件ImageJ，将液滴总体的荧光量作为相对荧光强度来计算，将从PCR后的荧光强度减去PCR前的荧光强度(即，背景部分)的值作为数据值。在本实施例中,还判明了各色素都在液滴侧浓度为O. 5 2 μ Μ、油侧浓度为O. 05 O. I μ M附近是最佳条件。另外，当预先没有在油侧添加色素的时候，没有观察到明显的荧光强度的上升。另一方面，还判明了只要预先至少在油侧存在色素，则即使在液滴侧不添加荧光色素，也能够检测出扩增核酸的荧光。[表I]SYBR Green I 液滴侧色素浓度(μ Μ)
-I O I0.5 I 1 I2 I 5 I10 I 20
IOO-18 -34-89 -145' -278-450
0.01_48_32_-9-25-123-241
I0.0278 90.................................~35........................................-6-34 -89............................- 78 0.05t S6~178 ............202 78_12—10.................-60
I0.1267345 356207 67 20 .............................z33
*0.2176150 89 ' 67_3422 17
0,5 丨124!1031§0123191 -2.21-I
数玀值Ψ位为相对焚(reΠuoriiscent UnitJ[表2]YO PR0-1液滴侧色素浓度(μ Μ)
Q Γ I O I 0.5 I 1 I 2 I 5 I 10 I 20
-5O7 ........................11 Im 4r23...........................-356
發 0.0170123 ~ 167203170—45 -177
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[表3]SYT0-13液滴侧色素 浓度(μ Μ)

权利要求
1.一种液滴操作装置， 其是用于在液滴封入介质中输送液滴的液滴操作装置， 其包括 保持所述液滴封入介质的容器， 由水系液体构成的液滴， 相对于所述水系液体为不溶性或难溶性的凝胶状的液滴封入介质， 包含在由所述水系液体构成的液滴中的磁性体粒子，和 用于通过产生磁场而与所述磁性体粒子一同输送液滴的磁场施加机构。
2.根据权利要求I所述的液滴操作装置，其特征在于， 所述凝胶状的液滴封入介质为向非水溶性或水难溶性的液体物质，混合选自由羟基脂肪酸、糊精脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯构成的组中的胶凝剂而进行制备的。
3.根据权利要求I所述的液滴操作装置，其特征在于，在所述液滴的输送路径上配置有另外的液滴。
4.根据权利要求I所述的液滴操作装置，其特征在于，在所述液滴的输送路径上设置有温度梯度。
5.一种液滴操作方法，其是在液滴封入介质中操作液滴的方法， 其特征在于， 将所述液滴封入介质保持在容器中， 所述液滴由含有磁性体粒子的水系液体构成， 所述液滴封入介质至少在液滴操作开始前为凝胶状态，在凝胶状态以及溶胶状态下相对于所述水系液体为不溶性或难溶性， 在所述液滴操作中，包括利用磁场施加机构产生磁场，将所述磁性体粒子和所述液滴进行输送的工序。
6.根据权利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述液滴操作开始之前，准备容纳了非水溶性或水难溶性的液体物质与胶凝剂的混合物的容器，在所述混合物中添加液滴，然后通过使所述混合物凝胶化，而将所述液滴封入在凝胶状的液滴封入介质中。
7.根据权利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴为通过对另外的液滴产生所述磁场，使之在液滴输送路径上移动，由此从所述另外的液滴中分离而生成的液滴， 所述另外的液滴为在同一容器内被封入至凝胶状态或溶胶状态的所述液滴封入介质中的所述液滴输送路径上的含有磁性体粒子的液滴。
8.根据权利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴为通过对另外的液滴产生所述磁场，由此从所述另外的液滴中分离而生成的液滴， 所述另外的液滴为在同一容器内被配置在凝胶状态的所述液滴封入介质上的含有磁性体粒子的液滴。
9.根据权利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴通过在凝胶状态或溶胶状态的所述液滴封入介质中移动，与在同一容器内被封入至所述液滴封入介质中的所述液滴输送路径上的另外的液滴合并。
10.根据权利要求5所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述液滴输送路径上设有温度梯度。
11.根据权利要求10所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述液滴封入介质在同一容器内呈现所述温度梯度的高温侧的溶胶相和所述温度梯度的低温侧的凝胶相这两者。
12.根据权利要求9所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述另外的液滴由清洗液构成，通过所述合并清洗所述磁性体粒子及其附着成分。
13.根据权利要求8所述的液滴操作方法，其特征在于， 通过在所述另外的液滴中含有细胞溶解液以及生物试样，而使来自所述生物试样的核酸吸附至所述磁性体粒子。
14.根据权利要求11所述的液滴操作方法，其特征在于， 所述另外的液滴由核酸扩增反应液构成， 在溶胶状态的所述液滴封入介质中，使由通过所述合并而产生的反应混合物构成的液滴，移动至设有所述温度梯度的液滴输送路径上的实现核酸合成反应的开始以及维持的温度地点，进行所述反应混合物的温度控制。
15.根据权利要求14所述的液滴操作方法，其特征在于， 在所述核酸合成反应开始时，在由所述反应混合物构成的液滴以及所述液滴封入介质中，至少在所述液滴封入介质中含有荧光色素。
16.一种试剂盒，其用于制作权利要求I所述的装置， 包括 保持所述液滴封入介质的容器， 所述凝胶状的液滴封入介质，或者成为制备所述凝胶状的液滴封入介质的材料的非水溶性或水难溶性的液体物质以及胶凝剂， 磁性体粒子，和 磁场施加机构。
全文摘要
本发明提供一种即使不采用电场操作等物理操作，也能够仅用磁场操作来进行液滴操作的液滴操作方法以及能够使用这种方法的液滴操作装置。用于在液滴封入介质中输送液滴的液滴操作装置，包括保持所述液滴封入介质的容器4，和由水系液体构成的液滴12、13、14，和相对于所述水系液体为不溶性或难溶性的凝胶状的液滴封入介质31，和包含在由所述水系液体构成的液滴中的磁性体粒子8，和用于通过产生磁场而与所述磁性体粒子一同输送液滴的磁场施加机构61。并且，还提供一种使用上述的装置，在保持于容器中的液滴封入介质中对液滴进行操作的方法。
文档编号G01N37/00GK102859367SQ20118001988
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月2日 优先权日2010年4月28日
发明者大桥铁雄 申请人:株式会社岛津制作所