Flc作为生物标记的制作方法

专利名称：Flc作为生物标记的制作方法
FLC作为生物标记本发明涉及肝脏疾病患者的新的生物标记，用于鉴别具有更严重疾病及更不良预后的对象。肝脏疾病是一种严重病症，当不予治疗时，最终导致需要肝脏移植，因此鉴别及评定肝脏疾病程度的可行性方法是有益的。如通过在许多慢性肝脏疾病中出现自身免疫抗体及高水平免疫球蛋白所证明的，已知在自身免疫性肝脏疾病中有异常B细胞激活。考虑到sFLC浓度在肝脏疾病中可升高，因此提供了疾病进展的病理学指征。
本申请人多年研究游离轻链作为测定患者广泛的单克隆丙种球蛋白病的方式。这种游离轻链在诊断中的应用参见书籍〃Serum Free Light Chain Analysis, FifthEdition (2008) A. R. Bradwell et al, ISBN 0704427028〃 所述。抗体包含重链和轻链。其通常双重对称，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，每条链均含有可变区和恒定区结构域。每对轻链/重链的可变结构域组合形成抗原结合位点，由此这两条链促成抗体分子的抗原结合特异性。轻链是两种类型，K和λ，任何给定的抗体分子是由任一种类型轻链产生但从来没有由两种类型而产生。在人体内产生的K分子是λ分子的大约两倍，但是在一些哺乳动物中是不同的。通常地，轻链附着于重链。然而，一些未附着的“游离轻链”在个体的血清或尿液中可检测到。游离轻链可以通过产生游离轻链表面的抗体而特异性鉴别，所述表面通常由于轻链与重链的结合而被隐藏。在游离轻链(FLC)中，这个表面被暴露，使其可以通过免疫学检测。检测K或λ游离轻链的可商购的试剂盒包括例如由 The Binding Site Limited, Birmingham, United Kingdom 生产的“Freelite ”，本申请人先前已经认识到确定游离κ /游离λ比率的量有助于诊断患者中单克隆丙种球蛋白病。其已经用于例如辅助诊断完整免疫球蛋白多发性骨髓瘤(MM)、轻链丽、非分泌的丽、AL淀粉样变、轻链沉积病、郁积性MM(smouldering MM)、浆细胞瘤和MGUS (未确定意义的单克隆丙种球蛋白病)。FLC的检测也例如用于辅助其它B细胞恶液质的诊断，及事实上作为尿凝溶蛋白(Bence Jones)蛋白质分析的替代选择以通常诊断单克隆丙种球蛋白病。常规地，寻找的是K或λ轻链之一的增加及因此出现的异常比率。例如，得自恶性浆细胞的单克隆倍增的多发性骨髓瘤，导致产生单一类型免疫球蛋白的单一类型细胞的增加。这样导致在个体中观测到的游离轻链K或λ的量增加。可以确定这种浓度增加，通常确定游离K与λ的比率并与正常范围相对比。这样有助于诊断单克隆疾病。此外，游离轻链测定也可用于随后患者疾病的治疗中。例如，可以对AL淀粉样变性治疗后的患者进行预后分析。Katzmann et al (Clin. Chem. (2002) ; 48 (9) : 1437-1944)论述了在诊断单克隆丙种球蛋白病中的游离K和游离λ免疫球蛋白的血清参照间期(reference interval)及诊断范围。通过免疫测定研究年龄在21-90岁之间的个体，并与通过免疫固定获得的结果对比以优化在具有B细胞恶液质的个体中检测单克隆游离轻链(FLC)的免疫测定。记录K和λ FLC的量及K / λ比率，确定参照间期，以检测B细胞恶液质。来自显然健康个体的血清中FLC的浓度受个体肾脏过滤和排泄FLC的能力的影响。在FLC清除受限的个体中，发现血清中FLC水平增加。因此，现在确信FLC是肾功能的良好标记。由于单体的FLCk分子(25kDa)与二聚体λ分子(50kDa)的大小不同，其在一起与例如肌酸酐(113kDa)相比是肾小球过滤的更好的标记。然而，与肌酸酐相反，FLC的产生可以是许多疾病的结果，因此血清FLC通常不被单独用作肾功能标记。然而，B细胞增殖/活性的标记是重要的，且因为B细胞与产生FLC相关，这在临床上是有用的。FLC产生是B细胞正调节的早期指征。在这个方面，其可以互补CRP的使用，所述CRP是炎症应答的T细胞介导的标记。高浓度的FLC可以是由于疾病病理学或者B细胞恶液质所致慢性肾脏疾病或者慢性B细胞激活的指征。因此，异常FLC测定结果可以是目前需要一些组合检验的许多疾病的标志。相反，当FLC测定结果正常时，表示良好的肾功能，无炎症及无B细胞恶液质迹象。本申请人研究了来自具有不同肝脏疾病的许多患者的样品。对比了特定肝脏疾病 的FLC浓度。示出FLC浓度明显高于公布的FLC水平。在针对肾功能校准之后，FLC值保持高于健康群体针对肾功能校准之后的FLC值的水平。本发明提供了一种鉴别可能患有肝脏疾病的对象或者确定先前确定患有肝脏疾病的对象预后的方法，所述方法包括检测来自所述对象的样品中游离轻链的量，其中较高量的FLC与该对象患有肝脏疾病的可能性增加或者肝脏疾病的预后不良的可能性增加相关。也就是说，较高水平的FLC表明该对象患有肝脏疾病或者该肝脏疾病的进展快于较低水平FLC的肝脏疾病。所述方法也可用于追踪(follow)此类疾病的治疗，例如，在治疗后FLC水平降低表示治疗是成功的。肝脏疾病特征在于肝脏细胞如肝实质细胞的超死亡率。肝脏疾病的根本原因与病毒感染相关，如肝炎、自身免疫病变如自身免疫性肝炎、物质滥用如乙醇性肝脏疾病或者隐匿性肝炎。肝脏疾病可以是包括乙醇相关肝脏疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性硬化性胆管炎、非酒精脂肪肝、原发胆汁性肝硬化(PBC)、隐匿性肝硬化、肉芽肿肝炎及非酒精脂肪性肝炎。典型地，FLC水平高于此而被认为是有意义的正常值是19. 4mg/L (对于κ FLC而言)、26· 3mg/L(对于λ FLC而言)及45. 7mg/L(对于总FLC而言)。所述FLC值可以针对肾功能校准，例如将FLC水平除以半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值。所述FLC可以是K或XFLC。然而，优选测量总FLC浓度，因为只检测κ FLC或入FLC可漏掉例如患者体内单克隆产生的一或另一种FLC的异常高水平。总游离轻链意味着样品中游离K轻链加游离λ轻链的总量。优选地，所述对象非必需具有B细胞相关疾病的症状。所述症状可包括复发感染，骨痛和疲劳。这种B细胞相关疾病优选不是骨髓瘤(如完整免疫球蛋白骨髓瘤，轻链骨髓瘤，非分泌性骨髓瘤)，MGUS，AL淀粉样变，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，Hodgkin’s淋巴瘤，滤泡中心细胞型淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病，套细胞淋巴瘤，前B细胞白血病或急性淋巴细胞型白血病。此外，所述个体典型不具有降低的骨髓功能。所述个体典型不具有在许多这种疾病中典型发现的异常K λ比率。
术语“总游离轻链”是指来自对象样品中K和λ游离轻链的量。所述样品典型是来自对象血清样品。然而，全血、血浆、尿液或其它组织或体液样品也可以潜在利用。典型地，所述FLC如总FLC是通过免疫测定确定的，如通过ELISA测定或者利用荧光标记的珠如Luminex 珠进行。例如，夹心测定使用抗体检测特异性抗原。该测定中使用的一或多种抗体可以用能将底物转变为可检测分析物的酶标记。这种酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶及本领域已知的其它酶。或者，其它可检测标签或标记可用于代替所述酶或者与所述酶一起使用。这些物质包括放射性同位素，本领域已知的各种有色及荧光标记，包括荧光素、Alexafluor、0regon Green、BODIPY、rhodamine recUCascade Blue、Marina Blue、Pacific Blue、Cascade Yellow、金；以及缀合物，如生物素(例如得自 Invitrogen Ltd, United Kingdom)。也可以使用染料溶胶(Dye sols)、化学发光标记、金属溶胶或者有色胶乳。一或多种这样的标记可用于本文描述的各个发明中的ELISA测定中或者本文描述的其它测定中、标记的抗体或试剂盒中。
夹心型测定的构建为本领域熟知。例如，将特异于FLC的“捕获抗体”固定在底物上。所述“捕获抗体”可以通过本领域熟知的方法固定在底物上。通过“捕获抗体”FLC与底物结合，样品中的FLC由“捕获抗体”结合。未结合的免疫球蛋白可以洗去。在ELISA或夹心测定中，结合的免疫球蛋白的存在可以通过使用标记“检测抗体”确定，所述检测抗体特异于感兴趣的FLC的与结合抗体所结合的不同部分。流式细胞计量术可用于检测感兴趣的FLC的结合。这个技术为本领域熟知，例如是进行细胞淘选。然而，其也可用于检测标记的颗粒，如珠，以及测量其大小。许多教科书描述了流式细胞计量术，如 Practical Flow Cytometry, 3rd Ed. (1994), H. Shapiro, AlanR.Liss,New York, and Flow Cytometry, First Principles(2nd Ed.) 2001, A.L.Given, Wiley Liss0结合抗体之一，如特异于FLC的抗体，与珠结合，所述珠如聚苯乙烯或乳胶珠。将所述珠与样品及第二种检测抗体混合。所述检测抗体优选用可检测标记进行标记，所述标记结合样品中被检测的FLC。这样当存在被测定的FLC时产生标记的珠。本文描述的特异于其它分析物的其它抗体也可以用于检测这些分析物。然后将标记的珠通过流式细胞计量术检测。不同的标记，如不同的荧光标记可用于例如抗游离K和抗游离λ抗体。其它测定如通常已知的肝功能检测可以与这种方法组合使用。或者或另外，不同大小的珠可用于不同抗体，例如对于不同的标记特异性抗体。流式细胞计量术可区分不同大小的珠，及因此可快速确定样品中每种FLC或其它分析物的量。另一种方法使用与例如荧光标记的珠结合的抗体，所述珠如可商购的Luminex 珠。不同的珠用于不同的抗体。不同的珠用不同的荧光团混合物标记，，因此使得可以通过突光波长确定不同的分析物。Luminex珠得自 Luminex Corporation, Austin, Texas, UnitedStates of America。优选地,使用的测定是比池法(nephelometry)或池度测定法(turbidimetry)。检测λ或κ-FLC的比池法和池度测定法(nephelometric and turbidimetric assay)为本领域已知，但是不是针对总FLC的测定。其具有最佳测定灵敏性，λ和K FLC浓度可以单独确定或者一个测定获得总FLC。这种测定包含抗K与抗λ FLC抗体的比率典型为60:40，但是也可以使用其它比率，如50:50。抗体也可以是游离λ和游离K轻链混合物的抗体。可以将总FLC的量与标准的预先确定的值对比，以确定该总量是否高于或低于正常值。例如，血清中FLC量高于50mg/L的患者示出显著降低的存活力。先前已经生产出测定试剂盒用以单独测量K和XFLC，以计算比率。其已经常规用于已经呈现出疾病症状的个体中。优选地，所述测定能确定样品中FLC，优选总FLC，例如大约lmg/L-100mg/L，或者lmg/L-80mg/L。期望在众多个体中检测血清FLC浓度而不需要在不同稀释度再测定样品。 优选地，所述方法包括使用免疫测定检测样品中总游离轻链的量，例如通过使用抗游离K轻链和抗游离λ轻链抗体或其片段的混合物进行检测。这种抗K :抗λ抗体的比率可以是50:50。与FLC结合的抗体或片段可以通过使用标记的抗体或片段直接检测，或者使用抗游离λ或抗游离K抗体的标记的抗体间接检测。所述抗体可以是多克隆或单克隆抗体。可以使用多克隆抗体，因为其允许待检测的相同类型轻链之间的一些可变性，因为其是针对相同链的不同部分产生的。多克隆抗体的产生在例如W097/17372中描述。本发明还提供了例如用于本发明方法中的FLC测定试剂盒。所述试剂盒可检测样品中FLC总量。所述试剂盒可以组合本发明方法的使用说明书。可以是所述测定试剂盒适合检测样品中低于25mg/L、更优选低于20mg/L或大约10mg/L、低于5mg/L或4mg/L量的总游离轻链(FLC)。校准材料(calibrator material)典型测量范围是1-lOOmg/L。所述测定试剂盒可例如是浊度测定试剂盒。优选所述试剂盒是免疫测定试剂盒，包含FLC的一或多种抗体。典型地，所述试剂盒包含抗K和抗λ FLC抗体的混合物。典型地，使用50:50的抗游离K和抗游离λ抗体的混合物。使所述试剂盒适合检测样品中l-100mg/L或优选
l-80mg/L量的总游离轻链。也可以使用能结合FLC的抗体片段，如(Fab)2 *Fab片段。所述抗体或片段可以例如用上述标记进行标记。可以提供标记的抗免疫球蛋白结合抗体或其片段以检测与FLC结合的抗游离λ或抗游离Κ抗体。所述试剂盒可包含校准液，以使得校准测定可以在指定范围校准。所述校准液优选含有预先确定浓度的FLC,例如100mg/L-lmg/L,低于25mg/L,低于20mg/L,低于10mg/L,低于5mg/L或者lmg/L。也可以通过优化包被在乳胶颗粒上的抗体及“阻断”蛋白质的量及通过优化补加试剂如聚乙二醇(PEG)而使得所述试剂盒更为合适。所述试剂盒可包含例如FLC的多个标准对照。所述标准对照可用于确认FLC或产生的其它成分的浓度的标准曲线。这种标准对照证实先前校准的标准曲线对于使用的试剂和条件是有效的。其典型在基本与对象样品测定的同时使用。所述标准可包含低于20mg/L、更优选低于15mg/L、低于大约10mg/L或低于5mg/L FLC的一或多个标准，以使得所述测定可以检测较低浓度的游离轻链。所述试剂盒也可包含针对一或多种标记的一或多种抗体或者其它测定，所述标记选自GAM、CRP、胆红素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、肌酸酐、白蛋白、INR、AST和ALT，优选GAM、CRP、胆红素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、白蛋白和/或INR。这种抗体和测定为本领域已知且可商购。所述测定试剂盒可以是浊度测定试剂盒或比浊法试剂盒。其可以是ELISA，流式细胞计量术，荧光、化学发光或珠类型测定或测验片(dipstick)。这种测定为本领域已知。所述测定试剂盒也可包含本发明方法的使用说明书。该说明书可包含被认为是正常值的总游离轻链的浓度的标示，例如低于此或高于此，则表明存在肝脏疾病的可能性增加或降低。这个浓度可以如上述定义。本发明通过仅是举例的如下附图
进行描述。图I示出肝脏疾病中总血清FLC浓度。中位值用黑色线条表示。图2示出在肝脏疾病中根据肾脏损伤情况校准之后的FLC水平。中位值用黑色线 条表示。图3示出死亡的及已知存活的患者中总游离轻链(κ + λ，mg/L)及总免疫球蛋白(IgG, IgA和IgM)的水平对比。图4示出肝脏疾病患者中总游离轻链水平(K + λ，mg/L)，分开突出显示死亡及保持存活的患者，自取样品直至200111。空心符号表示已经死亡的患者，实心符号表示已知存活的患者。中位值用黑色线条表示。图5示出肝脏疾病中高于和低于50mg/L游离轻链水平的Kaplan-Meier存活分析，存活时间以月表示。图6是使用单独的可商购的抗游离K和抗游离λ测定试剂盒与使用组合的抗λ和抗K游离轻链抗体的总FLC测定试剂盒获得的总FLC浓度之间的对比。数值以mg/L表示，血清游离轻链总和在X轴表示，总游离轻链在I轴表示。肝脏疾病方法来自80个具有肝脏疾病的患者的血清样品得自英国伯明翰大学医院。所述患者具有多种肝脏疾病，包括乙醇相关肝脏疾病、自身免疫性肝炎、自身免疫性硬化性胆管炎、非乙醇性脂肪肝、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、隐匿性肝硬化、肉芽肿肝炎及非乙醇性脂肪性肝炎。检测评估包括血清FLC 浓度，K 和 λ (Freelite, The Binding Site, Birmingham, UK)。通过加上κ FLC和λ FLC的数值计算总FLC浓度、血清FLC浓度。将数值与确立的正常范围进行比较(κ :3. 3-19. 4mg/L, λ :5. 71-26. 3mg/L,比率:0. 26-1. 65)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C用作测量肾损伤情况(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定，The Binding Site, Birmingham, UK)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C结果用于针对肾损伤情况校准FLC值。将该FLC浓度除以半胱氨酸蛋白酶抑制剂C值以提供肾损伤校准值。检测免疫球蛋白IgG、IgA&IgM(本领域已知的标准检测)。Spearman Rank相关分析用于检测sFLC与免疫球蛋白浓度之间的相关性。结果79/80样品具有正常FLC比率。然而，在39%的患者中sFLC浓度高于总和的正常范围(图I)。根据肾功能标准化的数据表明34%的患者具有升高的SFLC，与肾功能损伤无关。一些组中的个体具有特别高的sFLC浓度，在乙醇性LD中一致性地检测到最高水平(中位浓度59. 9mg/L,范围 20. 4-256. 4mg/L)。肝脏疾病中校准的FLC水平在图2中示出。尽管不是在所有情况中，但是观测到sFLC浓度与IgG(r=0. 68，P<0. 0001)和IgA(r=0. 56，Ρ〈0· 0001)之间的相关性，但是与IgM(r=0. 28，Ρ〈0· 0001)的相关性较差。给出的相关值是在针对肾功能损伤校准FLC浓度之后计算的。已经进行了存活与FLC及肝功能其它标记水平的进一步分析(见例如图3)。已经死亡的肝脏疾病患者与已知存活的肝脏疾病患者中B细胞或肝功能各个成员的对比在下表I中示出。表I变量Mann-Whitoey
____Hft__
IOL0.0001::____
ClP0.007
BiiiM__0.0012
半Il氨酸蛋&_抑制剂C__0-0001__
IR酸 W0.15 NS=
ι ι <0.0001
INR0.0004
Γ AST0.45 NS---
ALT0.21 NS
III:小板数 —(>:02—
MELD 得分0.009缩写K+L -总游离κ和游离λGAM-总免疫球蛋白(IgA，IgG，IgM)CRP-C反应蛋白INR-国际标准化比率(凝血时间测量)AST -天冬氨酸氨基转移酶ALT -丙氨酸氨基转移酶MELD得分-末期肝脏疾病得分模型图4示出已经死亡的患者与已知存活的患者对比。图5示出在已经死亡及保持存活的那些患者中评估FLC水平(>50mg/L)的Kaplan-Meier存活分析,分析示出在较低浓度的FLC,存活率增加。Cox回归分析示出FLC高于50mg/L是死亡的显著标记(危害比4. 09，P=O. 008)。讨论血清FLC在肝脏疾病中特别是在乙醇相关的肝脏疾病中多克隆地升高。这仅部分是由于降低的清除率所致，主要是由于增加的产量所致。在许多但不是全部患者中，增加的sFLC产量与增加的免疫球蛋白浓度相关。基于此，sFLC是肝脏疾病中免疫激活的灵敏标记，并且可以是诊断和监测炎症/免疫介导的肝脏疾病患者的有效生物标记。测定试剂盒本发明的方法可利用如下测定试剂盒进行。所述测定试剂盒确定了患者样品例如血清中存在的总游离κ加游离λ轻链的数量。这可以通过用50:50混合的抗游离κ和抗游离λ轻链绵羊抗体 包被IOOnm羧基修饰的乳胶颗粒而实现。在下文例证的测定中，总游离轻链的测量范围是l-80mg/L。然而，可以等同考虑其它测量范围。抗游离κ和抗游离λ抗血清是使用本领域已知技术产生，在本例中是在绵羊中产生。一般的免疫处理在WO 97/17372中描述。.使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将抗κ和抗λ抗血清稀释为相等浓度。组合这些抗体以产生包含50%抗κ抗体和50%抗λ抗体的抗血清。将抗体包被在羧基修饰的乳胶珠上，包被荷载为IOmg/批(10mg/lot)。这是通过使用标准程序实现的。见例如 “Microp article Reagent Optimization:A laboratoryreference manual from the authority on microparticles，，Eds:Caryl Griffin, JimSutor, Bruce Shull. Copyright Seradyn Inc, 1994 (P/N0347835 (1294)所述。这个参考文献还提供了关于使用聚乙二醇(PEG)优化测定试剂盒的详细描述。将组合的抗体与使用可商购的κ和λ Freelite 试剂盒(得自Binding SiteGroup Limited, Birmingham, United Kingdom)获得的结果进行对比。这种 Freelite 试剂盒在单独的测定中确定κ游离轻链的量和λ游离轻链的量。总FLC试剂盒用于产生曲线，所述曲线通过使用受控的浓度确认。校准曲线能在l-80mg/l总游离轻链之间获得。在下表的结果中，所述结果是针对游离轻链(KFLC)、λ游离轻链(LFLC)和总FLC获得的，使用的是κ Freelite 、λ Freelite 和总游离轻链测定。这些结果是针对15个不同的正常血清样品测定的。通过浊度测定法测量的结果在下表和图2中示出。初步的结果表明使用基于抗K和抗λ游离轻链抗体的总游离轻链测定的原理是切实可行的。结果
权利要求
1.鉴别可能患有肝脏疾病的对象或者对先前经鉴别患有肝脏疾病的对象的预后进行确定的方法，所述方法包括检测来自所述对象的样品中的游离轻链的量，其中较高量的FLC与所述对象患有肝脏疾病的可能性增加或者肝脏疾病预后不佳的可能性增加相关。
2.权利要求I的方法用于追踪对象中肝脏疾病的治疗，例如在治疗后较低水平的FLC表示治疗起作用。
3.权利要求I或2的方法，其中游离轻链的量是样品中总游离轻链的量。
4.权利要求1-3的方法，其中所述FLC是在来自对象的血清样品中确定的。
5.权利要求1-4的方法，其中总FLC是使用抗游离轻链的抗体通过免疫测定确定的。
6.权利要求5的方法，其中所述抗体是抗游离K轻链抗体和抗游离λ轻链抗体的混合物。
7.权利要求1-6的方法，其中所述方法包括通过比浊法或者浊度测定法检测FLC的量。
8.权利要求1-7的方法，其中所述对象不具有B细胞相关疾病的症状。
9.用于权利要求1-8的方法中的测定试剂盒，其另外包含用于该方法的说明书。
10.权利要求9的测定试剂盒，其另外包含正常值，使用所述测定试剂盒获得的FLC的浓度与该正常值对比指示对象中肝脏疾病的危险增加。
11.权利要求9或10的测定试剂盒，另外包含一或多种抗体，所述抗体针对选自GAM、CRP、胆红素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、肌酸酐、白蛋白、INR、AST和ALT的一或多种标记。
全文摘要
本发明提供了一种鉴别可能患有肝脏疾病的对象或者确定先前经鉴别患有肝脏疾病的对象的预后的方法，所述方法包括检测来自所述对象的样品中的游离轻链的量，其中较高量的FLC与所述对象患有肝脏疾病的可能性增加或者肝脏疾病预后不良的可能性增加相关。本发明还提供了用于这种方法中的测定试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102906569SQ201180023843
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月16日 优先权日2010年3月17日
发明者A·布拉德韦尔, R·休斯 申请人:结合点集团有限公司