专利名称:制备供电子显微镜和荧光显微镜观察的生物样品的方法
制备供电子显微镜和荧光显微镜观察的生物样品的方法本发明涉及制备用于在电子显微镜和荧光显微镜下观察的生物样品的方法,所述方法包括:
提供生物样品,
通过高压冷冻将样品冷冻固定,
通过冷冻切片形成切片,
将切片置于电子显微镜的网格上,
在室温下进行免疫标记,和 用电子显微镜和荧光显微镜观察切片,
这种方法已知于 “Cryosection immunolabelling of difficult to preservespecimens: advantages of cryofixation, freeze-substitution and rehydration,,,D.Ripper 等,Biol.Cell (2008), pp 109-123,进一步称为 Ripper [I]。在TEM中,样品的薄切片 采用高能电子束照射。所述切片足够薄(通常小于lym,更具体地小于250 nm,最具体地小于80 nm)使得通常具有80 keV至300 keV能量(尽管已知其它能量也被使用)的部分电子能不受阻碍地穿过切片、部分电子被散射和部分电子被吸收,所有均归结于所述电子与所述切片的原子,更具体地为原子核的相互作用。由穿过切片的这些电子,在相机如C⑶或CMOS相机上,或例如在荧光屏上形成图像。应注意的是,采用精密聚焦束扫描薄切片,并观察有多少电子穿过切片或从切片反射也是已知的。在这种情况下,所述仪器通常被称为扫描透射电子显微镜。大多数TEM能够作为STEM操作,反之亦然。生物样品的对比度通常很小,这是由于大多数材料由具有低且类似数量的质子的原子组成。因此,常见的做法是用重金属,如铀(通过将切片暴露于醋酸双氧铀)和锇(通过将切片暴露于四氧化锇)标记切片,或通过蛋白质标记切片,其中电子致密材料(例如,银或金簇)附着于所述蛋白质上。就对组织成分的特异性、易于使用等而言,这些标签的每一种均具有其优点。例如:四氧化锇是众所周知的“颜色”脂类并从而提高例如细胞脂双层的可视性。正如前面所提到的,TEM能够使薄切片成像。为了制备这种薄切片,所述样品如细胞、细菌等必须被固定并切成小于I μ m,更具体地小于250 nm,最具体地80 nm的切片。一种形成切片的众所周知的方式为用玻璃刀或钻石刀切割样品。为实现成功切割,样品需被固化,或通过首先冷冻样品,或通过将样品嵌入塑料中将样品固化。当冷冻样品时,应避免冰晶的形成,因为这些晶体可导致样品的形态学的超微结构改变并且冰针可刺破或刺穿细胞膜。冰晶的形成可通过例如高压冷冻来避免,其中样品首先被加压到例如2100 bar的压力,然后通过例如带有液氮喷雾的喷射冷冻进行快速(冷却速度超过 IO4 K/s)冷却。例如,在“Practical Methods in High-PressureFreezing, Freeze-Substitutionj Embedding and Immunocytochemistry for ElectronMicroscopy”, Μ.K.Morphew, Laboratory for 3-D Fine Structure, Dept, of MCDBiology, University of Colorado, Boulder, Colorado,进一步称为 Morphew [2],特别是第5页的段落“A) Theory of freezing”中对高压冷冻做了综述。然后样品被称为玻璃化的样品并包含所谓的无定形冰,并且当处理得当时,将不显示冰晶。然而,无定形冰的加热诱导所述冰结晶成其许多晶形之一。Ripper [I]在其出版物的第 Il2 页段落“protocol for cryofixation-FScombined with thawed cryosection labeling”中描述了一种形成切片的方法。她描述了一种方法,在该方法中样品首先通过高压冷冻被冷冻固定,在含有0.1 %四氧化锇、0.1 -0.2%醋酸双氧铀和0.5%戊二醛的丙酮,以及0.5 - 1%甲醇和2 - 4%水中进行冷冻置换。应注意的是,电子显微镜的染色通常采用例如醋酸双氧铀或四氧化锇作为电子致密标记物或染料来完成,但是这些化学试剂也可作为一种固定剂。固定剂用于交联生物分子(蛋白质、脂双层等),因此这些固定剂不能例如在后续处理中除去。众所周知的固定剂为戊二醒。完成冷冻置换后,在_35°C的温度下在含2 - 4 %水和0.5 %戊二醛的丙酮中清洗样品以除去固定剂。然后在升高的温度和0.25 %戊二醛存在下将所述样品再水化,并在含有0.25 %戊二醛的水中再保存30-90分钟。再次在水中洗涤后,将所述样品进一步用常规的Tokuyasu冷冻切片、蔗糖/聚乙烯吡咯烷酮浸润、冷冻、冷冻切片和免疫标记处理。如本领域技术人员所已知的,使用上述方法形成切片需要数天,通常2天或更多。例如在低温下再水化样品需要数天。需要(尤其是对于临床诊断,特别是疾病的早期诊断)有一种缩短从(活的)样品到电子显微镜检查的时间的方法,优选缩短至8小时或更短(一个工作日)。应注意的是,所述的长处理时间对于卫生保健问题已经是长时间存在的问题,因此寻找更短处理时间的激励是很大的激励。对于临床诊断,特别是疾病的早期诊断,还需要对生物样品的相当大的区域进行分析以找到脱离稳态的相对低量的细胞。用电子显微镜观察是几乎不可能的。因此,已发展了突光显微镜分析大区域与电子显微镜放大样品的可疑部分的组合。突光显微镜用于检测和定位荧光染料,从而得到感兴趣区域的位置信息。发明人进一步注意到,根据Tokuyasu方法制备的样品不能被分析到令他们满意的程度,因为用来建立对电子显微镜来说必需的对比度的重金属淬灭了荧光显微镜中所使用的荧光染料。本发明旨在提供一种在较短的样品到观察(sample-to-1nspection)时间内,从生物样品形成染色切片的方法。本发明进一步旨在提供一种方法,在该方法中荧光染料未被淬灭。为此目的,本发明方法的特征在于,在低温下对固定在电子显微镜网格上的切片进行固定和/或染色。本发明基于以下认识:样品在低温下进行切片,随后的处理均发生在切片上,从而减少了化学品的浸润时间和/或扩散。例如,与常规方法的两天相比,冷冻置换在85分钟内进行。实验表明,根据本发明的方法,有可能在8小时或更少的时间内获得用于电子显微镜分析的切片,这对于卫生保健是重要的时间缩短。在本发明方法的一个实施方案中,在低温下进行固定和/或染色。
由于未染色/非固定的切片可在例如_150°C的低温下获得,因此对切片而不是样品进行染色和/或固定是可能的。区别在于,切片是薄的,而样品则厚得多,并因此染色/固定切片所需要的时间比染色/固定样品所需要的时间要短得多。在本发明方法的另一个实施方案中,该方法进一步包括切片的冷冻置换,然后将切片从低温状态移至室温,并对切片进行再水化。在此方法中,由发明人命名为VIS2FIXfs,其中FS指自由置换,附着于网格的切片经受冷冻置换,并加热。由于当从低温加热至室温时,没有或几乎没有水存在,故无冰晶形成。在冷冻置换避免进一步结晶前,进行自由置换优选的温度为-90°C或更低以避免形成结晶。在本发明方法的又一个实施方案中,冷冻置换包括用有机溶剂和固定剂的混合物代替水,更具体地用丙酮和固定剂的混合物代替水。通过用有机溶剂如丙酮代替水,样品可以被加热至室温而无冰晶形成。固定剂/染料也可以溶解在有机溶剂如丙酮中。在本发明方法的另一个实施方案中,该方法包括将冷冻切片置于基于冷冻水的固定剂上,随后解冻并通过熔化基于冷冻水的固定剂来固定切片,并且在融冰的温度下固定切片。在该实施方案中,切片被放置在冷冻的固定剂上,然后,与固定剂一起解冻。令人惊讶的是,实验显示,当根据该实施方案处理样品时,未观察到冰晶。在进一步的实施方案中,采用荧光标签(以能够使用荧光显微镜进行观察/导航)、电子致密标签(如含有选自金、银、钯、钼的重金属的标签)以用作用于电子显微镜的标签、或量子点(已知其既可以作为荧光标签也可作为用于电子显微镜的标签),将切片标记(优选在室温下)。在本发明的一个优选方法中,切片的观察在为电子显微镜和荧光显微镜组合的仪器,也称为iLEM(集成光和电子显微镜)上进行。本发明的一个方面的特征在于,执行该方法的处理设备包括用于容纳冷冻固定剂和/或冷冻置换介质和/或用于标记的液体的容器,以及盖子,运行时所述盖子位于所述容器的顶部,所述盖子包括针对可拆卸的容纳网格(accepting grid)的锁定装置。在处理设备中完成低温下的固定和/或染色,以及放置冷冻固定剂,随后解冻。标记也可以在该处理设备中完成。优选安装所述处理设备以处理加固的网格,即:用加厚的边缘将其安装,使网格更坚固。这种网格用于自动处理。 现使用附图对本发明进行阐明。为此:
图1示意性地示出了本发明方法的流程图,
图2示意性地示出了执行至少部分该方法的处理设备,
图3示出了 VIS2FIX方法的超微结构和roi的免疫金标记,以及 图4示出了针对LAMP2标记的VIS2FIXFS切片的iLEM图像。图1示意性地示出了本发明方法的流程图。如前文所述,本发明的目的是以这种方式进行样品分析,尽管越过水的重结晶的临界温度范围,但防止样品损坏。此外,本发明涉及以这种方式固定生物样品的方法,使得对于电子显微镜图像中良好的对比度所必需的重金属几乎不淬灭对于荧光显微镜成像所必需的荧光染料。本发明人已经发明了两种不同的、但密切相关的方法(称为VIS2FIX,用于玻璃化切片/两种固定剂)以解决目前所用方法的缺点。这两种方法的特征在于将冷冻切片静态粘附于网格上,随后采用方法固定切片,所述方法避免了生物样品的超微结构水平的可见冷冻损伤。此外,本发明的方法允许通过切片固定进行高压冷冻材料的免疫标记,导致重金属产生的荧光信号淬灭大大减少。此外,切片中的抗原表位的易接近性与Tokuyasu切片相似(Tokuyasu KT, J.Cell Biol.1973,51,551 -565,进一步称为 Tokayasu[3] ;GeuzeHJ et al.J.Cell Biol.1981,653-665,进一步称为Geuze[4]),这增加了有效标记的机率。由于所述方法的性质,准备时间比迄今为止所描述的任何方法要短得多,结果可以在8小时内得到。本发明的两条路线开始是相同的:
在步骤101中,提供样品,如(部分)细胞、细菌、生检等形式的生物样品。在步骤102中,通过高压冷冻将所述样品冷冻,从而导致玻璃化的样品不显示冰晶。高压冷冻本身为本领域技术人员已知。在步骤103中,在低温例如_150°C的温度下,将高压冷冻材料冷冻切片。在步骤104中,冷冻切片随后被粘附到TEM网格上,优选在例如Leica CRION防静电设备的帮助下静态地粘附。随后,在例如_90°C的温度下,将切片转移到FS (冷冻置换)室中,优选在自动冷冻置换单元中,如Leica AFS2,并且将切片面朝下放置在固定剂上。然后固定冷冻切片并升温至室温,优选在受控的温度速率下,并为(常规)免疫标记做准备。切片的固定可以通过两种方法来实现;VIS2FIXfs和VIS2FIXh方法。第一种切片固定方法,VIS2FIXfs (FS为冷冻置换),允许冷冻切片的冷冻置换。在步骤105中,冷冻切片中的水被有机溶剂如丙酮,和固定剂代替。由于这在-90°C时进行,因此当将温度升高到0°C时,切片中将不再存在水以形成冰晶。冷冻置换是生物材料高压冷冻后常见的应用技术,但由于在我们的方法中,体积要小很多(切片只有80 nm厚),因此可以进行得更快:与常规方法至少2天相比,时间少于85分钟。当将温度升高时,丙酮中的固定剂开始固定切片,因此当达到0°C时,其是稳定的。在步骤106中,样品随后从丙酮到水被逐步再水化,并且准备好:
步骤109免疫标记和
步骤110:用电子显微镜和荧光显微镜进行观察。使用VIS2FIXfs方法,新颖的组件之一在于可能对冷冻切片进行冷冻置换,并开发更短的但有效的冷冻置换方案。该方法的使用者可以改变冷冻置换方案的长度,并针对不同类型的生物样品对其进行优化,并且很重要的是,改变冷冻置换介质中的固定剂混合物的组成。在整个冷冻置换过程中,我们使用0.1 - 0.2%醋酸双氧铀(但是在再水化过程中要去除),并且四氧化锇和戊二醛存在时,浓度可以在0.1 - 0.5%之间变化。此外,在-60°C时可以将锇从冷冻置换介质中去除,以防止由该固定剂引起的对抗原性的任何不利影响(锇对抗原性的作用仅在温度高于-60°C时可观察到)。
第二种切片固定方法,VIS2FIXh(H为水化),允许在0°C下在亲水环境(PHEM缓冲液)中用固定剂以化学方法固定切片。在步骤107中,步骤104之后,在-90 V的温度下,粘附在网格上的冷冻切片被放置在冷冻的固定剂上。然后在步骤108中,固定剂和切片在例如40°C温度的炉子上熔化,直到固定剂的表面为液体。然后,在冰上固定切片10分钟,避光。该固定期和洗涤步骤之后,切片准备用于:
步骤109:免疫标记。与VIS2FIXFS方法类似,在此可能且易于改变固定剂的组成,这取决于使用者的需求。这种特定方法的一个很大的优势在于,当在固色剂混合物中使用四氧化锇时,可以观察到切片中保存的脂质。TEM样品制备的更传统方法或通常不固定脂质(如上述Tokuyasu [3]方法),或在如用冷冻置换将脂质固定前引起脂质的浸出。这使得脂类组学领域的技术人员对这种特定方法产生了极大的兴趣。由于切片未经冷冻保护或事先固定就被从_150°C转移至约0°C,故人们预期会看到切片上冰晶的超微结构效应诱导的损伤。细胞核中的异染色质是冷冻损伤引起的细胞中的第一个且影响最大的结构之一,但使用上述方法在此处或者细胞的其他部分未观察到损伤。对于这个令人惊讶和意外的发现,我们目前的解释是,也许形成的冰晶是如此小以至于其并没有严重影响或破坏细胞结构。在步骤110中,随后可采用荧光显微镜、组合的电子显微镜或荧光&电子显微镜,也被称为iLEM (集成光和电子显微镜)观察切片。两种VIS2FIX方法都需要,或至少是优选的,高压冷冻样品和/或高压冷冻机、冷冻切片机和冷冻切片相关的产品、使切片粘附于网格上的Leica CRION防静电装置(或实现这一点的类似设备或方式)、自动冷冻置换单元(AFS)和配件。目前,这些设备没有被集成并且个人观察过程和手动处理都必须进行。然而,本领域技术人员将很清楚,可以开发从高压冷冻切片开始到最终固定的集成的自动化系统。应注意的是,样品也可用聚焦离子束(FIB)进行冷冻切片,而不是用冷冻切片机。图2a示意性地示出了用于执行本发明方法的处理设备的横截面。图2示出了用于容纳冷冻固定剂和/或冷冻置换介质和/或用于标记的液体的容器(201),以及盖子(202),运行时所述盖子位于所述容器的顶部,所述盖子包括针对可拆卸的容纳网格(209a+209b)的锁定装置(203a+203b)。盖子有第一侧,其上可放置一个或多个网格,优选在凹槽(204a,204b)中,虽然这不是必需的。在低温下,存放切片的一个或多个网格被放置在盖子上。所述盖子具有以可拆卸方式容纳网格的装置。在该实例中,所述装置被描述为弹簧203a,其可以沿着轴203b旋转和移动。在一个旋转位置上,弹簧能够容纳/缠住网格,而在另一旋转位置上,弹簧靠在盖子202上且网格可以下降(当凹槽面向下时)或网格可以被装载(当凹槽面向上时)。应注意的是,移动(拆卸或装载网格)可以通过压力差来缓解,经管道(未示出)从凹槽处吹动网格或将其抽吸向内部产生所述压力差。该容器可以填充有液体,如冷冻置换介质或通过入口 205的固定剂。容器的温度可通过将其放置在低温液体(乙烷、液氮)中降低到低温温度。应注意的是,制造的容器可以包括通道,经此通道低温液体可以为此目的进行流通。容器包括一系列凹槽208a、208b,与凹槽204a和204b相对应。当这些凹槽被固定剂或冷冻置换介质填充且温度被调节到低温温度时,导致凹槽208a、208b容纳在低温下的冷冻置换介质或冷冻固定剂,盖子被放置在容器上且网格从盖子上释放。然后网格落到冷冻置换或冷冻固定剂上。然后将该装置被以受控的方式加热至室温。温度的控制可以通过集成的加热器206,或将处理设备放置在温度控制的环境中来实现。优选地,该容器包括温度测量装置207。通过对盖冲刷网格并激活锁定装置403a+403b,可以将网格返回至盖子中。达到室温或融冰温度后,可以通过将标记试剂添加到网格中完成标记。这可以在所述处理设备原位完成,但也可以在别处(易地)进行。锁定装置可以在网格-至-网格的基础上起作用,例如夹紧或锁存每个单独的网格,或可在全部数目的网格上起作用。图2b示意性地示出了从运行时面向容器的一面所看到的盖子的视图。图2b示意性地示出了具有8个凹槽204-1的盖子202。在其中一个凹槽中放置网格209,并且弹簧203a沿轴203b旋转至所述弹簧将网格容纳在凹槽中的位置。应注意的是,为更好地将网格保留在凹槽中,弹簧的端部可以具有更适合的形式,例如,以环的形式,或采取其它这样的措施以用于更好的和/或备选的容纳装置,这对本领域技术人员是显而易见的。此外,所述装置的运动可以基于不同的原理,如机械致动器、磁驱动,压电驱动等。本发明的这一方面的处理设备的优点是,它可以成为自动处理站的一部分,或可以包括控制器和致动器,以使其适合于自动化的样品处理。随后该设备优选适于处理带有加固边缘的稳健网格,如在美国专利号US7,034,316中所描述的。作为其应用的(非限制性的)实例,发明人提供了本发明方法的以下实例:
作为疾病(早期阶段)的标记物,尤其是癌症和心血管疾病的循环细胞
循环(血)细胞接触人类和动物体内的其他组织的所有类型的细胞。在这些接触中,循环细胞和“体”细胞之间发生“信息”的交换。这种信息交换可通过体细胞发送的分子信号来催化,其中分子被循环细胞上的受体蛋白识别,或体细胞产生的分子或外来体被循环细胞摄取。这两个过程均导致循环细胞中的信号传导过程发生变化,这些信号传导过程导致由这些信号传导过程所调控的基因转录的向上和向下调节。这些过程通常导致循环细胞的蛋白质谱发生改变。此外,(信号)分子可以被循环细胞摄取和内化(Hofman E,Thesis,第I章,2008,ISBN 978-90-393- 4905),这些过程也可以改变循环细胞的蛋白质谱。蛋白质谱的这些变化常影响循环细胞的形态和细胞表面抗原。细胞表面的蛋白质复合物也可发生变化,如二聚化,并因此导致细胞外受体的激活或失活。鉴于蛋白质谱的变化可通过蛋白质组技术监测,蛋白质谱没有明显的差异时也可以发生形态改变,正如新的复合物的形成或细胞内的复合物的降解。目前,以最小侵入方式取少量血液样品是可能的。小样品或多或少反映了发生在局部(在采样点和采样时间)的生物过程。如此收集的循环细胞量足以提供所述过程是否发生在取样区域的统计显著的答案,其预测某些细胞从它们的稳态状态偏离。到现在为止,这样的样品主要用于研究蛋白质和细胞计数,但是当循环细胞中的蛋白质复合物的形态变化或改变已经发生时则很少用。本发明允许分析形态变化以及这些细胞中及其表面上的复合物的变化。
实验结果
高压冷冻、切片和网格转移到AFS
来自白血病细胞系的THP-1人单核细胞购自ATCC(LGC Standards GmbH,WeselJI国),并根据供应商的指示进行培养。为了高压冷冻,细胞降速旋转(5分钟1200 rpm),沉淀物再悬浮于葡聚糖中(终浓度15%)。铜样品管中填充有细胞的葡聚糖悬浮液,并在约2000 bar的压力下采用Leica EM PACT进行高压冷冻。在切片前,冷冻管储存于液氮中。管被修整并在_150°C的温度下采用Leica EM UC6/FC6超薄切片机中的钻石刀进行切片,Leica CRION防静电装置设定为放电。在切片过程中,一种带状的、长的、看起来有光泽的、厚度为60-80纳米的切片在TEM网格上对齐。用Leica显微操作仪将网格(带有Formvar膜,碳涂敷且辉光放电)保持在与刀刃靠近的位置。当带足够长时,用Leica CRION防静电装置将其静态粘附到网格上。在此,通过试图将切片从网格上拿起,这应该是不可能的,来检查粘附是否成功,这是非常重要的。当使用VIS2FIXFS方法时,发现为实现有效的固定,切片应该至少80 nm厚。切片之后,网格被放置在存在于UC6的切片机室内的Leica蓝宝石盘(SD)容纳器中(SD冷冻置换单元的一部分),冷却到-150°C。SD容纳器可容纳24个这种用途的蓝宝石盘或网格。将所需数量的网格切片后,将带有网格的SD容纳器从切片机室转移至AFS2 (Leica自动冷冻置换单元)的FS室。在此,网格必须保持低温并防卫可在切片上形成冰晶的潮湿空气。预冷的罐(Leica通用容器)存在于切片机室中,其中一个冷环(Leica底板)位于底部。将带有网格的SD容纳器置于罐中,并用环形的Aclar箔覆盖(切自200μ m Aclar 嵌入式薄膜,Electron Microscopy Sciences。Aclar 箔的外直径为 3.5 厘米。其中心有一个洞,直径为9mm)。两个更冷的环被放置在顶部,最后是盘形的Aclar箔(直径3.5厘米)。然后罐被快速但小心地转移到AFS2中,冷却至-90°C。切片前,SD容纳器(放置在封闭的培养皿中)、罐、冷环和Aclars与切片机一起被冷却。一小片部分折叠带被粘在Aclar箔和培养皿盖的面上,作为把手发挥促进提升和移动的功能。VIS2FIXFS
将Leica流通环(截断以最小化高度至±6 mm)放置在Leica试剂槽(截断以最小化高度至±1 cm)中。在AFS2中,在-90°C时将带有流通环的试剂槽放置于罐(Leica通用容器)中三个冷环(Leica底板)的顶部。在此温度下,将3 mL含固定剂的预冷至_90°C的干燥的丙酮(Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri,美国)用移液管移至流通环中,并用Aclar箔(直径3.5 cm)覆盖。选择丙酮作为FS介质是因为样品中的磷脂的保留高于用甲醇时磷脂的保留。使用的固定剂为0.1 %醋酸双氧铀、0.1 -0.5%戊二醛和0.2-0.5%四氧化锇/丙酮。切片后,SD容纳器中的网格被转移到如上所述的FS室。使用预冷的弯曲细尖钳子(类似于盖片钳),小心地使每个网格漂浮在位于环的一个流动室内的固定剂表面上,其中切片面朝下。一个流通环最多可容纳10个网格,但最多只有三个带固定剂的流通环可以被放置在如上所述的AFS2中。由于丙酮的低表面张力,网格最后沉入溶液中至流通室的底部。一旦最后一个网格被放置完成,就开始冷冻置换程序。如果需要的话,固定剂组成可以在冷冻置换期间的任何时候改变。为了实现这一目标,将大部分固定剂从流通环的中心去除,其后可以进行一些洗涤步骤。在这里,重要的是不要让网格变干。随后,将新的固定剂添加到带网格的流通环中。从_90°C到_60°C,当固定剂由0.1 %醋酸双氧铀和0.2%四氧化锇/丙酮组成时,可以达到良好的形态,其随后被替换为0.1 %醋酸双氧铀和0.2%戊二醛/丙酮。在冷冻置换过程结束时,当温度达到(TC时,将网格用如上所述的0.2%戊二醛/干燥丙酮(每个洗涤步骤约3 mL)洗涤5次或更多。随后的再水化步骤(TC时在AFS2中进行,1-2分钟内进行7个连续步骤。0.2% GA/95%丙酮、0.2% GA/90%丙酮、0.2% GA/80%丙酮、0.2% GA/70%丙酮、0.2% GA/50%丙酮、0.2% GA/30%丙酮以及最终 0.2% GA/10%丙酮/水。再水化后,流通环中的网格用水洗涤3次。用细尖钳子将网格从流通环中去除,且网格的背面用稍微湿润的滤纸干燥。最后,将网格I分钟内洗涤7次同时浮于置于一条石蜡膜上的水滴上。此时,网格准备用于免疫标记或储存以供以后使用。这些部分可以类似Tokuyasu切片的方式储存。为了储存,将网格立刻在位于冰上的甲基纤维素和2.3M蔗糖的 0.1M PHEM 缓冲液(由 60 mM PIPES,25mM HEPESUOmM EGTA 和 2mM MgCl 组成,pH 值调整为6.9)的1:1混合物液滴上孵育。然后将网格轻轻地从粘性液滴中抽出,并放置在带切片的石蜡膜覆盖的载玻片上且液滴朝下。将带网格的载玻片置于玻璃培养皿中,用石蜡膜密封,并贮存于4°C。VIS2FIXH
在冰上,在0.1M的PHEM缓冲液中制备含有0.05-0.5%四氧化锇、0.2%醋酸双氧铀和
0.2%戊二醛的2 mL固定剂。最终体积为800 μ L的固定剂被置于所述试剂槽中(截断以最小化到I厘米的高度),覆盖槽的底部。然后所述试剂槽被转移到AFS2 (设定在-90°C ),并放置在罐中3个冷环的顶部,被Aclar箔覆盖(直径3.5厘米)。固定剂立刻冷冻。网格被转移到如上所述的AFS2,将预冷的细尖钳子轻轻放置在冷冻固定剂上,其中切片面朝下。然后带网格的试剂槽被放置在冷却的培养皿中以保护其免受空气影响。然后可以将其从AFS2取出并将其放置在40°C热板上,用玻璃培养皿(直径9厘米)覆盖。当轻轻将培养皿沿热板环绕时,固定剂熔化。一旦固定剂的表面变为液体,通常历时4-5分钟,网格开始浮动。然后含固定剂和网格的培养皿被迅速置于冰上,避光,并另外固定10分钟。最后,将网格从固定剂中移去,I分钟内在水滴中清洗10次,并为免疫标记或储存作准备(如上面所述)。透射电子显微镜(TEM)和集成的激光和电子显微镜(iLEM)的免疫标记
对于免疫TEM,VIS2FIX固定的切片中自由醛基采用0.02M甘氨酸的0.1M PHEM缓冲液2分钟内洗涤5次进行淬灭。通过用封闭缓冲液孵育15分钟,阻断切片与抗体的非特异性结合,其中封闭缓冲液包含1% (w/v)BSA(牛血清白蛋白)的0.1M PHEM缓冲液,随后用在封闭缓冲液中稀释的一级抗体(小鼠单克隆抗F1DI, I:100, Stressgen BiotechnologiesCorp., British Columbia,加拿大)孵育 I 小时。用 0.1 % (w/v) BSA 的 0.1M PHEM 缓冲液洗涤5次后,将切片用桥接抗体兔抗小鼠Ig (1:200在封闭缓冲液中,Dako, Glostrup,丹麦)孵育20分钟。将切片在0.1% BSA的0.1M PHEM缓冲液中2分钟内洗涤5次,接着用蛋白 A 金标记(Cell Microscopy Centre, University Medical Centre Utrecht,在封闭缓冲液中孵育20分钟)。15分钟内在0.1 M PHEM缓冲液中洗涤10次后,通过1%戊二醛孵育5分钟来稳固标记。去除缓冲液和戊二醛,切片用水滴洗涤10次达I分钟,并用2%草酸双氧铀的水溶液(pH 7)染色5分钟。此后,立刻将切片在水中洗涤两次。最后,切片被嵌入置于冰上的0.4%醋酸双氧铀/1.8%甲基纤维素中。iLEM的相关标记采用类似的方案进行。使用小鼠单克隆抗LAMP2(1:150,BDBiosciences Pharmingen, San Diego, California,美国)作为一级抗体。蛋白 A 金孵育步骤后,网格在2分钟内用0.1 % BSA的0.1M PHEM缓冲液洗涤5次,随后用Alexa 488 Fluor共轭的山羊抗兔抗体(1:200, Invitrogen, Carlsbad, California,美国)孵育45分钟。切片在2分钟内用0.1M PHEM缓冲液洗涤5次,并用4%甲醛(用戊二醛作为固定剂可能会导致切片的自动荧光增加)固定15分钟。然后在水中I分钟内洗涤10次并用2%草酸双氧铀接着用2%醋酸双氧铀染色5分钟。在染色步骤之间在水中立刻洗涤切片两次。最后,切片被洗涤并嵌入置于冰上的1.8%甲基纤维素中。成像
切片在集成的激光和电子显微镜(iLEM)上成像;Tecnai 12 120 kV透射电子显微镜(FEI公司,Eindhoven,荷兰)。此iLEM有定制设计的激光扫描荧光显微镜,安装在其侧端口之一上,直接面向样品台。在TEM运行期间,荧光显微镜从TEM柱略微缩回,并且不会干扰TEM成像或运行。TEM图像在80 kV下用安装于底部的TEMCam_F214 (Tietz视频和图像处理系统,Gauting,德国)CO)相机记录。激光扫描显微镜配备有488 nm的Bluephoton单模激光器(Omicron Laserage Laserprodukte GmbH,Rodgau-Dudenhofen,德国)和雪崩光敏二极管(APD)检测器。此ILEM的荧光显微镜采用LabView 8.0中由A.V.Agronskaia博士定制设计的软件运行。图3和4的图例
图3:VIS2FIX方法的超微结构方面和roi的免疫金标记。(a) VIS2FIXFS固定后,月旨滴(LD)的中性脂质核心消失,(b) VIS2FIXH后,观察脂质核心的液滴内部存在的密度,(c)VIS2FIXFS切片上ER固有蛋白PDI的免疫金标记(15 nm),(d) VIS2FIXH切片上PDI的免疫金标记(10 nm)。请注意,在c)和d)中,全细胞质和细胞核(N)中保存完好的异染色质。Ly:溶酶体;G:高尔基体;M:线粒体;Mv:多泡体。a)和b)中的标尺代表300 nm, c)和d)中为500 nm。图4:针对LAMP2标记 的VIS2FIXFS切片的iLEM图像。(a)用免疫金和免疫荧光(见在线方法)针对LAMP2标记的切片上50 μ m2区域的荧光图像,(b)在a)中用白方框表示的区域的荧光信号覆盖到同一区域的TEM图像上,(c)在b)中用黑方框表示的区域的较高倍放大的TEM图像。注意溶酶体的过度标记。a)中的标尺代表10 μ m,b)中为I μ m,和c)中为500 nm。文献
[1]D.Ripper et al., ^Cryosection immunolabelling of difficult to preservespecimens: advantages of cryofixation, freeze-substitution and rehydration〃,Biol.Cell (2008) pp 109—123.[2]Μ.K.Morphew, "Practical Methods in High-Pressure Freezing,Freeze-Substitution, Embedding and Immunocytochemistry for Electron Microscopy〃.Laboratory for 3-D Fine Structure, Dept, of MCD Biology, University ofColorado, Boulder, Colorad0.[3]Κ.T.Tokuyasu, 〃A technique for ultracryotomy of cell suspensions andtissues", J Cell Biol.1973 May I; 57 (2):551-565。
权利要求
1.制备用于在电子显微镜和荧光显微镜下观察的生物样品的方法,所述方法包括: 提供生物样品, 通过高压冷冻将样品冷冻固定, 通过冷冻切片形成切片, 将切片置于电子显微镜网格上, 在室温下进行免疫标记,和 用电子显微镜和荧光显微镜观察切片, 其特征在于: 对安装在电子显微镜网格上的切片进行固定和/或染色。
2.如权利要求1所述的方法,其中在低温下进行固定和/或染色。
3.如权利要求2所述的方法,其进一步包括切片的冷冻置换,然后将切片从低温状态移至室温,随后再水化。
4.如权利要求2所述的方法,其中所述冷冻置换包括用有机溶剂和固定剂的混合物代替水,更具体地用丙酮和固定剂的混合物代替水。
5.如权利要求3所述的方法,其中所述代替在低温下,更具体地在低于_90°C的温度下,最具体地在_90 °C的温度下进行。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述方法进一步包括将冷冻切片置于基于冷冻水的固定剂上,随后解冻并通过熔化基于冷冻水的固定剂来固定切片,和在融冰的温度下固定切片。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述标记包括用荧光标签标记。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述标记包括用电子致密标签标记,更具体地标签包括选自金、银、钯、钼的重金属。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述标记包括用量子点标记。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述电子显微镜和荧光显微镜组合在一台仪器上。
11.如权利要求3-5中任一项所述的方法,其中将含锇材料用作固定剂和/或电子致密染料,并且在_60°C或更低的温度下将锇从冷冻置换介质中移除,从而避免抗原性。
12.用于实施权利要求1-11中任一项所述方法的处理设备,所述设备包括: 容器(201),用于容纳冷冻固定剂和/或冷冻置换介质和/或用于标记的流体, 盖子(202),运作时所述盖子位于所述容器的顶部,所述盖子包括用于可拆卸的容纳网格(209a, 209b)的锁定装置(203a + 203b)。
13.如权利要求12所述的处理设备,将其安装以处理带有加固边缘的网格(209a,209b),所述网格适于自动化处理。
14.如权利要求2-5中任一项所述的方法,其中所述固定和/或染色在根据权利要求12-13中任一项所述的处理设备中进行。
15.如权利要求6中任一项所述的方法,其中所述置于基于冷冻水的固定剂上和所述解冻发生在根据权利要求12-13中任一项所述的处理设备中。
16.如权利要求14或15中任一项所述的方法,其中所述标记发生在根据权利要求12-13中任一项所述的处理设备中(图1)。
全文摘要
本发明涉及一种制备用于在电子显微镜和荧光显微镜下观察的切片的方法。通常这些切片通过例如Tokuyama方法制作,该方法涉及在低温下进行冷冻置换和固定。问题是由于化学品(有机溶剂和固定剂)的扩散速率极低,从样品到切片需要花费大量时间。本发明包括将样品在低温下切片然后固定。由于所述切片比样品(通常>1μm)薄得多(例如100nm或更少),从样品到准备好观察的切片所花费的总时间小于8小时。这使得在一个工作日内获得卫生保健相关的结果成为可能。
文档编号G01N1/42GK103201609SQ201180045177
公开日2013年7月10日 申请日期2011年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者E.范东塞拉尔, M.卡雷曼(MatthiaKarreman), H.格里岑, T.弗里普斯, U.吕肯 申请人:Fei公司