专利名称：磁性细胞检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及磁性细胞检测，为此借助磁性标记物来标记待检测的细胞。
背景技术：
—方面,在细胞检测领域已知流式测量(Durchflussmessungen)。其能够基于磁性探测，然而却常常基于光学测试方法，例如散射光谱或荧光光谱。另一方面，已知作为验证方法的测试，其中为了验证特异性物质而进行反应。已知不同的标记法用于流式细胞仪以及用于化学验证方法。荧光标记物或待验证的抗原将通过抗体与待检测的细胞相连。例如由 Mujika 等人在 Phys.Stat.Sol 第(a) 205 卷，第 6 期，1478 页-1483 页(2008年)“Microsystem for the immunomagnetic detection of Escherichia coli 0157:H7”中公开的那样，其中通过固定在功能化表面上选择待检测的物质，而与该免疫磁性检测相反，磁性流式测量对测量信号有更高的要求。除了磁性标记的细胞，同样还一起流过未连接的标记物以及未连接标记物的聚集体，并且通过传感器发出信号。此外，并不总是给出标记细胞类型的唯一性。特别诸如肿瘤细胞的细胞类型在细胞表面上具有较大差异的表位浓度。从而得到用于一个细胞种类的MR信号的全谱。因此，至今仅对如下细胞实施流式细胞仪，即其在细胞表面上具有较高的表位密度。在所有其他情况中必须归溯到光学流量测量，然而其在关于测量器材结构方面相对磁性细胞检测而言是存在缺点的。为了在使用磁阻传感器的检测中从层流中得到足够大的信噪比，就必须使得待检测的细胞通过标记具有较高的磁矩。各个细胞的磁矩对于原位浓缩和通过外磁场的细胞引导也是很重要的。
发明内容
本发明的目的在于，给出一种用于磁性检测和标记细胞的方法，其造成细胞足够大的磁矩。此外，应该给出一个适用于此的测量设备。该目的通过根据权利要求1所述的方法以及根据权利要求12所述的设备得以完成。依据本发明的方法包括磁性细胞检测以及用于细胞特异性标记的标记步骤。待标记的细胞分配为一种细胞类型中，其在细胞表面上具有细胞特异性的表位。磁性标记物将通过抗体与细胞表面上的表位相连接。为了特异性标记而将磁性标记物通过第一抗体类型的抗体连接，其连接在第一细胞特异性表位类型的表位上。此外，其他磁性标记物将通过第二抗体类型的抗体在细胞上与第二细胞特异性的表位类型的表位相连。或者磁性标记物通过第四抗体类型的抗体与第一抗体类型的抗体相连，并且其再次在细胞上与第一细胞特异性的表位类型的表位相连。该方法允许细胞的特异性标记。通过标记来提高相对于其他细胞的磁矩。在通过第二抗体类型相连的附加磁性标记物的情况下，围绕细胞的磁性标记物密度将升高，这仅发生在如下细胞上，即其具有第一和第二表位类型的组合。此类标记相应地排除了因其他细胞导致的错误正信号，这些细胞例如仅具有第一或仅具有第二表位类型。其磁矩相应地非常小，因为仅具有第一抗体类型或者仅具有第二抗体类型的标记物能够与这些细胞相连。或者如下提高标记的选择性，即通过第四抗体类型与第一抗体类型的组合来进行其他的配合。第一抗体类型在此尤其是高度特异性的抗体类型，其与细胞的表位相连。该高度特异性的抗体类型例如保证了很低数量的错误连接。磁性标记例如能够通过较少的特异性第四抗体类型来实现。第一抗体类型的认知比表面上细胞特异性表位的认知有更少的缺陷。通过本发明的标记能够实现无需校准的磁性流式细胞仪。在本发明有益的实施方式中，通过额外的将磁性标记物经过第三抗体类型的抗体与第三细胞特异性表位类型的表位在细胞上相连，依该方法提高细胞的磁矩。优点如下，即针对细胞进行另外的选择，其也具有第一和第二表位类型的表位的组合，并且与待检测的细胞仅通过第三表位类型的表位相区别。此外，通过细胞表面上更高的标记物密度来提高细胞的磁矩。由此能够为正信号设置更高的阈值。在本发明其他有益实施方式中，在本方法中如下选择第二和/或第三抗体类型，即其并不在第二细胞类型上与表位相连。或者如下选择第二和/或第三抗体类型，即其仅与表位相连，该表位与待检测的细胞类型上的浓度并不相同。相应地，能够通过挑选抗体来进行选择，其保证了几乎仅仅检测待检测细胞类型的细胞。为了禁止对其他具有较低表位密度的细胞的横向选择性，特别地能够在细胞上实现具有多个针对不同表位的抗体的免疫标记。在本发明有益的实施方式中，通过在第二标记步骤中额外地将磁性标记物通过第四抗体类型的抗体与第一标记步骤的磁性标记物相连，依本方法提高细胞的磁矩。还能够如下提高标记物密度，即实现已经连接在细胞上的磁珠的第二标记。第四抗体类型的抗体对此必须特别地连接第一标记的磁珠。附加磁性标记物尤其与第一标记步骤的磁性标记物不同。这样显著提高了围绕细胞的标记物密度，并由此提高了细胞的磁矩。这样，提高通过各个细胞所引起的磁阻信号，并保证了较高的信噪比。在用于磁性细胞检测的方法中，有利地通过磁阻变化来测量特异性磁性标记的细胞。细胞的高磁矩尤其保证了能够如下来设定用于磁阻变化的下限值的最高值，即使得信噪比至少为2。信噪比尤其至少为3。在本发明另一有益的实施方式中，依该方法将用于磁阻变化的上限值设定为其最小值实现单一细胞检测。其优点如下，即较高的磁阻变化值并不会分配给各个细胞而是分配给了聚集体，并且作为错误正信号被排除掉。在本发明另一有益的实施方式中，借助流式细胞仪实现磁性检测。在此，尤其在流动的同时通过传感器测量特异性标记的细胞。例如在层流中引导细胞。流式细胞仪例如具有较高样品通量的优点。在本发明另一有益的实施方式中，在该方法中使用磁性标记物，其具有小于200nm的直径。还被称为磁珠的磁性标记物较小的尺寸具有如下优点，即其并不会由于大量抗体在各个大小的磁性标记物上的连接而导致产生聚集体。具有小于200nm直径的较小磁性标记物能够各自围绕细胞布置。在本发明另一有益的实施方式中，将在该方法中使用超顺磁性的磁性标记物。这将根据通过磁阻构成的可获取性例如相对于铁磁性珠是有益的。在本发明另一有益的实施方式中，依该方法在梯度磁场中引导细胞，并由此聚集在传感器上。磁性标记的细胞借助梯度磁场能够有目的的通过传感器转向。用于磁性细胞检测的依据本发明的设备具有传感器和分析单元。如下安排分析单元和传感器，即能够接受磁阻变化的谱图。在这里，将用于磁阻变化的下限值存储在该分析单元中，该下限值的最高达使得信噪比至少为3。额外的或者可选的，存储用于磁矩变化的上限值，该上限值最低使得可实施单独的细胞检测。两个阈值的组合对于测量的高特异性是格外有利的。单个细胞的正MR信号必须能够例如被未连接的标记物、聚集的标记物或其他磁性干扰场这样的背景效果衬托出来。为了减弱此类背景效果，单个细胞必须相应地达到阈值之上的磁阻变化。此外为了排除将例如已标记的细胞聚集体或磁性标记物更大的聚集体一起计算在内，还可以使用上限值。在本发明有益的实施方式中，所述设备包括引流系统，该设备以此适合于磁性流式细胞仪。此外，所述设备包括用于在引流系统中产生梯度磁场的物质。磁性标记细胞由此可在梯度磁场中积聚在传感器上。相应地，设置用于产生梯度磁场的物质。产生梯度磁场的物质可以是铁磁性条(Streifen)。
将以示例方式结合附图1至8进一步说明本发明的实施方式。图1示出单倍磁性标记细胞A。图2示出双倍磁性标记细胞A。图3示出关于由其所引起的磁阻变化的细胞A分布的示意图。图4示出磁性标记的细胞B/C。图5示出关于由其所引起的磁阻变化的细胞A、B和C分布的示意图。图6示出以不同磁性标记物双倍磁性标记细胞A。图7示出特异性标记的细胞A。图8示出具有以不同磁性标记物双倍标记的特异性标记的细胞A。
具体实施例方式图1、2、4以及6至8分别示出了细胞A、B、C的示意图，它们在表面上具有表位11、12、13。通过大圆圈来标明细胞表面。在以小圆圈所表示的表位11、12、13上连接有抗体21、22、23、24，其在示意图中被示出为Y形。在此，端部之一分别连接细胞表面上的表位11、12、13，并且另一端部连接磁性标记物M1、M2。以比表位11、12、13更大的圈来表示磁性标记物Ml、M2。然而，磁性标记物Ml、M2具有比细胞A、B、C小很多的直径。虽然附图尺寸并不成比例，但是示出了磁性标记物M1、M2对细胞A、B、C的正确尺寸比例。对于较大磁性标记物M1、M2的情况，其将会导致聚集和横向交联。也就是说，多个抗体21、22、23、24将围绕一个磁性标记物M1、M2排布并连接在其上，并且由此不再标记为单个的细胞A、B、C，而是产生抗体21、22、23、24的聚集体，细胞A、B、C和围绕非常大的磁性标记物的磁性标记物Ml、M2。图3和5分别示出了 一个示意图，其中针对磁阻变化MR对细胞的数量N进行作图，所述细胞产生MR信号。在图3中示出了细胞A的分布，在图5中示出了细胞A、B和C的分布。在后图中，细胞A引起比细胞B高很多的MR信号，并且细胞B的信号也比细胞C高得多。但分别也有重叠范围，在其中并不能够区分哪些细胞类型A、B、C引起了 MR信号。因此根据过去的经验值或者已知的分布来设置用于MR信号的阈值T。之后根据阈值T分为正事件和负事件。在图3的示意图中使用了上限值T2和下限值1\。MR信号在下限值T1之上将被评价为正信号。在上限值T2之下，则认定为单个检测。聚集体引起非常高的MR信号。图1首先示出了磁性标记最简单的形式。细胞A在细胞表面上具有大量的表位11、
12、13。表位类型的数量例如能够在细胞上包括大约500个表位。在借助连接在特异性表位类型11、12、13上的抗体21、22、23、24标记时，大约覆盖了 80%的表位。也就是说，存在游离的特征表位11、12、13，其也能够通过特异性的抗体21、22、23、24捕获磁性标记物Ml、M2。此类标记并不足够用于有效信号。也就是说，仅通过一种抗体类型21-24连接在细胞
A、B、C上的标记物Ml、M2并未如此大的提高细胞A、B、C的磁矩，以至于产生足够大的MR信号。也就是说，信噪比例如通过未连接的磁标记物Ml、M2对于明确的正信号来说是并不充足的。也就是说，标记的敏感度过低。此外，标记的选择性也过低。细胞B区别于细胞A的地方在于表面上表位11、12、13的数量和种类。但是抗体21-24还有可能错误地与表位11-13相连。还会出现细胞A、B不同，但正好在待标记的表位11中具有较大的一致性。例如细胞A和细胞B仅具有共同的表位类型11，但它在细胞表面上有近似相同的浓度。这样，细胞B同样通过具有抗体21的标记物Ml来标注，并且在尺寸上并不与细胞A相区别。图2再次示出细胞A，但其通过多个不同的抗体类型21、22、23来标记。提供具有不同抗体21、22、23的磁性标记物Ml以使用。其在细胞表面上与表位11、12、13相连。由此首先提高了细胞A的磁矩,其中，围绕细胞A的标记物Ml的数量翻倍,或者变成三倍,也就是说，提高了灵敏度。这样能够如图5所示，细胞A的MR信号相对于细胞B或C的MR信号明显提高，并显著高于细胞B和C的信号的阈值界限T来。此外，这样还实现了较高的选择性。虽然细胞B和C可能能够具有相近数量的第一表位类型11。然而细胞B和C不具有或者比起细胞A以非常低的浓度具有第二和第三标记的表位12、13。图6再次示出了在细胞表面上具有表位11、12、13的细胞A，所述表位将细胞A与细胞B、C区分开来。在第一步骤中将磁性标记物Ml通过抗体21与表位11相连来实现磁性标记。在该情况中并不通过第二表位类型来实现第二标记，而是通过具有抗体24的附加标记物M2，所述抗体再次与磁性标记物Ml相连。这样提高细胞A的磁矩。选择性发生在抗体-表位-对21-11上。磁性标记物M2额外的连接比使用较大的磁性标记物更好。在提高标记物直径或体积时将增强聚集效应。在大于200nm直径的较大磁性标记物上连接有多个抗体，其将细胞A、B、C和磁性标记物Ml、M2横向交联。理想地，使用超顺磁性颗粒用于磁性标记，其具有小于200nm的直径。图7示出了提高标记选择性的另一种可能性。在此，首先在具有适配抗体21的细胞A的表面上标记第一表位类型11的表位。在该抗体21上再次连接有抗体24。该抗体24与磁性标记物M2相连。虽然由此并未相对于图1中的标记提高磁矩，然而通过两个抗体21、24的组合的连接是非常特异性的，这提高了 MR测量的选择性。为了提高敏感度，也就是说为了达到更好的信噪比，能够重又实现如已在图6中示出过的三明治标记类型。在图8中示出了该组合。在此为了更高的选择性，将第一磁性标记通过具有抗体24的标记物M2实施在特异性的抗体21上。磁矩在抗体24上将通过标记物Ml的第二标记得以提高，所述抗体24连接磁性标记物M2。优选地，标记在两个相随的标记步骤中进行。随后说明磁性流式细胞仪的示例过程。尤其在微流控中来实现。主要有三个运行步骤用于有效测量:1.磁性标记的细胞A原位聚集在传感器上，2.细胞引导，尤其引导磁性标记的细胞A流经传感器中，和3.借助磁阻构成检测磁性标记细胞A。尤其实现了在层流中的细胞运输，也就是说，细胞流过微流控装置。磁性标记的细胞A对此在外部磁性梯度场中受到一个力。该梯度场如下对齐，即细胞A在例如安装在管壁上或管壁中的传感器上流过。为了实现原位积累和细胞引导，磁性标记的细胞A必须具有足够高的磁矩。只有如此，其才能够在外部磁性梯度场中受到影响并转向。外部磁性梯度场例如为IOOmT或为在该量级中的值。为了实现检测具有磁阻构成的细胞A，磁性标记的细胞A具有较高的杂散磁场是必要的。仅当磁性标记的细胞A具有足够高的杂散磁场时，其在组分中才起到足够大的阻力变化MR。通过本发明方法，能够并不依赖于单位细胞表面上的表位浓度来如下标记细胞A、
B、C，就能够实施磁性流式细胞仪。单位细胞表面上的表位浓度典型的是在1000或者更多。在本方法中，特别可将超顺磁性颗粒用于标记，并且在细胞表面上如此浓密的安装，即磁矩并不依赖于细胞种类和其表位密度而适合于磁性流式细胞仪。通过较高标记物浓度和由此较高的磁阻信号MR能够使用足够高的阈值T用于正信号，以排除背景效应，否则该背景效应会作为错误正信号被获取。尤其能够实现组合的免疫磁性检测。尤此，细胞聚集还可在例如全血的媒介中进行，并且细胞引导还可能在梯度场中进行。尤其能够通过铁磁性条来产生梯度场，所述条能够安置在微流控装置中。
权利要求
1.用于磁性细胞检测的方法，所述方法具有用于特异性标记待检测细胞类型的细胞(A)的标记步骤，其中，磁性标记物(Ml、M2)通过第一抗体类型的抗体(21)连接在第一细胞特异性表位类型的表位(11)上，其特征在于，额外地 -第二 /其他磁性标记物(Ml、M2)通过第二抗体类型的抗体(22)连接在细胞(A)上的第二细胞特异性表位类型的表位(12)上，或者 -所述磁性标记物(Ml、M2)通过第四抗体类型的抗体(24)连接在第一抗体类型的抗体(21)上，并且再次连接在细胞(A)上的第一细胞特异性表位类型的表位(11)上。
2.根据权利要求1所述的方法,其中，经过额外地将磁性标记物(Ml、M2)通过第三抗体类型的抗体(23)连接在细胞(A)上的第三细胞特异性表位类型的表位(13)上来提高所述细胞㈧的磁矩。
3.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，如下选取第二和/或第三抗体类型(22、23)，即其在第二细胞类型(B/C)上并不连接表位，或者仅连接浓度不同于待检测细胞类型(A)上表位的表位。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，在第二标记步骤中经过将额外的、尤其是与第一标记步骤的磁性标记物(M1、M2)不同的磁性标记物(M2、M1)通过第四抗体类型的抗体(24)连接在第一标记步骤的磁性标记物(M1、M2)上来提高细胞(A)的磁矩。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，通过磁阻变化(MR)来测量所述特异性磁性标记的细胞(A)。
6.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，如下设置用于磁阻变化(MR)的下限值(Tl)，其最高为使得信噪比至少为3。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，如下设置用于磁阻变化(MR)的上限值(T2)，其最低为实现单个细胞检测。
8.根据前述权利要求中任意一项所述用于磁性流式细胞仪的方法，其中，在流动通过传感器期间、尤其在层流流动中获取所述特异性标记的细胞。
9.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，使用具有小于200nm直径的所述磁性标记物(Ml、M2)。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，使用超顺磁性的所述磁性标记物(Ml、M2)。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中，所述细胞在梯度磁场中运行，并聚集在传感器上。
12.具有传感器和分析单元的用于磁性细胞检测的设备，其设计如下，即用于接收磁阻变化(MR)的谱图，其中，将用于磁阻变化(MR)的下限值(Tl)储存在所述分析单元中，该下限值(Tl)最高为使得信噪比至少为3，和/或储存用于磁阻变化(MR)的上限值(T2)，该上限值最低为使得可以进行单独细胞检测。
13.根据权利要求12所述的用于磁性流式细胞仪的设备具有流体引导系统和用于在流体引导系统中产生梯度磁场的介质，其中，如下设计所述介质，即磁性标记的细胞通过梯度磁场可聚集在传感器上。
14.根据权利要求13所述的设备，其中，所述用于产生梯度磁场的介质是铁磁性条。
全文摘要
本发明涉及磁性细胞检测，特异性标记细胞。其中，将磁性标记物通过第一抗体类型的抗体与第一细胞特异性的表位类型的表位相连接来标记待检测的细胞类型。此外，将第二/其他磁性标记物通过第二抗体类型的抗体与细胞上的第二细胞特异性的表位类型的表位相连，或者磁性标记物通过第四抗体类型的抗体与第一抗体类型的抗体相连，并且其进而与细胞上的第一细胞特异性的表位类型的表位相连。
文档编号G01N33/50GK103201040SQ201180053147
公开日2013年7月10日 申请日期2011年10月28日 优先权日2010年11月3日
发明者O.海登, M.J.赫尔劳, S.F.特德 申请人:西门子公司