纤丝病毒融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。所述融合蛋白用于免疫原性组合物以在人和非人动物中保护抵御纤丝病毒例如埃博拉病毒的感染。所述融合蛋白也用于诊断试验以检测纤丝病毒感染。
【专利说明】纤丝病毒融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及纤丝病毒(Filovirus)糖蛋白融合蛋白在预防和诊断纤丝病毒感染中的应用。
技术背景[0002]埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)是纤丝病毒科(Filoviridae)的成员，纤丝病毒科是分类为“A类”生物战剂的病毒家族，造成人和非人灵长动物中严重的出血热，发病率和死亡率高达 90%(Sanchez 等，Filoviridae:Marburg and Ebola viruses (纤丝病毒科:马尔堡和埃博拉病毒)，第1409-1448页，收录于D.M.Knipe, P.M.Howley, D.E.Griffin, M.A.Martin, R.A.Lamb, B.Roizman 和 S.E.Straus (编),Fields Virology(《费氏病毒学》)，第5版，宾夕法尼亚州费城的利平科特威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins) 2007)。4 - 10天的短培养期后，纤丝病毒感染个体突然发生与很多其他病毒感染相同的症状，包含发热、发冷、不适和肌痛。MARV在抗原性上稳定并仅存在一个种类，而EBOV更加可变并有五个种类。最近在2007年末在乌干达爆发了本迪布焦(Bundibugyo)EBOV(Towner 等，PLoS Pathog2008 年 11 月；4 (11): el000212),相较扎伊尔(Zaire)、苏丹(Sudan)或莱斯顿(Reston)的EBOV种，其与象牙海岸(Ivory Coast)种更加接近。扎伊尔EBOV (ZEBOV)通常与最高致死率相关联。非洲爆发和近期猪中EBOV爆发数目的增加(Normile Science2009年I月23日;323 (5913):451)，引起了牲畜可以把致死疾病传递给人的关注，这突出了开发疫苗和包含爆发在内的快速诊断测试的紧迫性。基于纤丝病毒糖蛋白(GP)的疫苗处于临床前和临床评价中，并且当前没有治疗剂来治疗纤丝病毒感染。由于对安全和有效的纤丝病毒疫苗的许可能需要数年，诊断和隔离感染的个体是当前限制爆发的主要方法。
[0003]当前开发了数个纤丝病毒疫苗候选，包含表达EBOV GP的重组腺病毒(Sullivan 等，PLoS Med2006 年 6 月；3 (6): el77;Sullivan 等，Nature2OO3 年 8 月 7H ; 424 (6949):681-4;和 Sullivan 等，Nature2000 年 11 月 30 日；408 (6812): 605-9)、重组副流感病毒(Bukreyev等，J Virol2007年6月；81 (12):6379-88)、重组委内瑞拉马脑炎病毒(Pushko 等，Vaccine2000 年 8 月 15 日；19 (I): 142-53)、重组复制型(Feldmann等，PLoS Pathog2007 年 I 月;3 ⑴:e2 和 Jones 等，Nat Med2005 年 7 月;11 (7): 786-90)和重组复制缺陷型(Halfmann等，J Virol2009年4月;83(8):3810-5)水泡性口炎病毒、和载有纤丝病毒GP的病毒样颗粒(Warfield等，Proc Natl Acad Sci U S A2003年12月 23 日；100 (26):15889-94 和 Warfield 等，J Infect Dis2007 年 11 月 15 日；196 增刊2:S430-7)。使用杆状病毒表达纤丝病毒GP的起始研究显示部分保护，可以对昆虫细胞中糖基化特性和GP的加工起作用(Mellquist-Riemenschneider等，Virus Res2003年4月；92 (2):187-93)。
[0004]尽管在这方面有进步，还需要开发针对纤丝病毒感染的新疫苗。本发明解决了这些和其它需求。
【发明内容】
[0005]本发明提供了包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。在典型的实施方式中，所述纤丝病毒糖蛋白片段是例如来自埃博拉病毒(特别是扎伊尔埃博拉病毒Mayinga株)的胞外结构域。所述免疫球蛋白多肽片段能是IgGl的免疫球蛋白重链恒定区多肽(即Fe片段)。在一些实施方式中，所述融合蛋白还包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之间的接头。本发明的示例性融合蛋白是由没有接头的SEQ ID NO:1和有FLAG标签接头的SEQ ID NO: 3所示的核酸序列编码。
[0006]本发明还提供包含本发明融合蛋白的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物还可以包含佐剂。
[0007]也提供了包含本发明融合蛋白编码核酸序列的核酸载体。示例性核酸序列示于SEQ ID NO:1。
[0008]本发明还提供了在患者中诱导对纤丝病毒感染的保护免疫反应的方法。所述方法包含给予患者免疫有效量的本发明免疫原性组合物。所述免疫原性组合物能包含本发明融合蛋白或其编码核酸分子。所述组合物能以任意多种途径给予。在一些实施方式中，所述组合物肌肉内给予。
[0009]本发明也提供了检测患者中纤丝病毒免疫反应的方法。所述方法包含使患者生物样品接触本发明融合蛋白，并且检测体液或细胞免疫反应。能使用ELISA、化学发光试验或荧光试验检测抗体。细胞免疫反应能通过检测IFN-Y、TNF-a、或其他细胞因子和细胞活化及增殖试验来检测。
[0010]本发明的另一方面是检测患者生物样品中抗纤丝病毒抗体(即中和抗体)的方法，所述患者用纤丝病毒糖蛋白Fe融合蛋白或其他免疫原免疫。这种方法包含使生物样品接触表达纤丝病毒GP的重组水疱性ロ炎病毒(VSV)(如扎伊尔埃博拉病毒Mayinga株)，并且评价易受纤丝病毒感染的细胞中残留的感染性。所述用于此试验的细胞能是Vero E6细胞。或者所述重组VSV颗粒能固定在固体支持物上，并且抗纤丝病毒抗体能使用标准方法例如ELISA、化学发光试验或荧光试验来检测。
[0011]定义
[0012]术语“佐剂”和〃免疫刺激剂〃在本文中互換使用，并且定义为ー种或多种引起免疫系统刺激的物质。本文中，佐剂用于增强对本发明融合蛋白的免疫反应。
[0013]本文使用的术语“氨基末端”(或“ N-末端”)和“羧基末端”(或“ C-末端”)表示多肽特别是本发明融合蛋白内的位置。本文允许时，涉及多肽或蛋白的特定序列或片段使用这些术语以表示附近或相对位点。例如，多肽中相对參照序列位于羧基末端的某些序列位于參照序列的羧基末端附近，但并不必需在完整多肽的羧基末端。
[0014]当用于序列的氨基酸残基位点吋，术语“对应”指当序列最优比对时，多个序列的对应位点。
[0015]术语“表达载体”指包含感兴趣多肽编码片段(如本发明融合蛋白)的线形或环形DNA分子，所述感兴趣多肽编码片段可选连接到提供转录的其他片段。这种其他片段包含启动子和終止子序列，并且也可以包含一个或多个复制起点、ー个或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来自细菌或病毒DNA，并且可以包含两者的元件。[0016]两个或更多个核酸或多肽序列(如本发明融合蛋白和其编码多核苷酸)背景下术语"相同的"或"相同性"指就最大对应性进行比较和比对时，相同或有特定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或亚序列，如使用下列序列比较算法之一或通过视觉检查测量。
[0017]本发明的两个核酸或多肽背景下的短语"基本相同"指就最大对应性进行比较和比对时，两个或更多个序列有至少60%，更优选65%，甚至更优选70%，仍然更优选75%，甚至更优选80%和最优选90-95%核苷酸或氨基酸残基相同性，如使用下列序列比较算法之一或通过视觉检查测量。优选地，基本相同存在于至少约50个残基长度的序列区域上，更优选至少约100个残基的区域上，并且最优选所述序列在至少150个残基上基本一致。在最优选的实施方式中，所述序列在编码区域的整个长度上基本一致。
[0018]对于序列比较，一般将ー种序列用作与测试序列比较的參照序列。使用序列比较算法吋，将测试序列和參比序列输入计算机，如果必要则指定子序列坐标，并指定序列算法程序參数。然后，序列比较算法根据指定的程序參数计算测试序列相对參比序列的序列相同性百分数。
[0019]可通过，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2:482 (1981),通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法，J.Mol.Biol.48:443 (1970)，通过 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法，Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444 (1988),通过计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星州麦迪逊(Madison, WI))科学大道575号，或视觉检查(通常參见，Current Protocols in Molecular Biology (《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编，Current Protocols (《新编实验指南》)，格林出版联合公司(GreenePublishing Associates, Inc)和约翰,利森出版公司(John Wiley&Sons, Inc.)合资公司，(1995增刊)(Ausubel))进行最优序列比对以便比较。
[0020]适合測定序列相同性百分数和序列相似性百分数的示例性算法是BLAST和BLAST2.0 算法，分别描述于 Altschul 等(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul 等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开！犬得(http://ncb1.nlm.nih.gov/)。此算法包括:首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足ー些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。然后，沿各个序列在两个方向上延伸该字命中，直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言，采用參数M(—对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是〈O)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸:累积比对评分比其最大获得值降低X ;由于ー个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法參数W、T和X决定比对的灵敏度和速率。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)采用的默认值如下:字长(W)ll，期望值(E)10，M=5，N=-4，以及比较两条链。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用默认參数，字长(W) 3、期望值(E) 10、使用BL0SUM62评分矩阵(參见Henikoff和 Henikoff(1989)Proc Natl Acad Sci USA89:10915 (1989))。
[0021]除计算序列相同性百分数外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如，Karlin 和 Altschul，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小概率和(P (N))，它表明两个核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较时的最小概率和小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为该核酸与参照序列相似。
[0022]说明本发明两种核酸序列或多肽基本相同的进一步指标是第一种核酸编码的多肽与第二种核酸编码的多肽能发生免疫交叉反应，如下所述。因此，例如某多肽与第二种多肽的区别仅为保守取代时，该两种肽通常基本相同。两种核酸序列基本相同的另一指标是两种分子在严谨条件下互相杂交，如下所述。
[0023]“免疫球蛋白”是脊椎动物生物体中作为抗体功能的血清蛋白。各免疫球蛋白包含轻链和重链。各链包括恒定区和可变区。有5种类型的重链,表示为α、δ、ε、y和μ，其分别定义抗体类型IgA、IgD, IgE, IgG和IgM0人中，IgG由四个称为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的亚型组成。编码人和非人免疫球蛋白链的DNA序列为本领域熟知。
[0024]术语“免疫球蛋白重链恒定区多肽”表示野生型免疫球蛋白重链恒定区或其变体。IgG恒定区包含CH1、CH2、和Ch3结构域和铰链区。
[0025]“Fe片段”是与Fe受体相互作用的免疫球蛋白区对应的重链恒定区的片段。在IgG, IgA和IgD中，所述Fe区对应CH2，和CH3结构域和铰链区。在IgM和IgE，所述Fe区包含三个重链恒定区(Ch2，Ch3和Ch4)。
[0026]“可操作连接”指两个或多个DNA片段结合一起，从而就其预定用途协同作用。例如，编码序列在正确的读框中可操作连接到启动子，从而转录在启动子开始，并且通过编码片段进行到终止子。
[0027]“多核苷酸”是通常从5’读向3’末端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，且可分离自天然来源、体外合成、或由天然和合成的分子组合制备。当所述术语用于双链分子时，其用于表示整体长度，并且会理解为与术语"喊基对〃等同。
[0028]“多肽”是氨基酸残基通过肽键连接而成的聚合物，可为天然或合成产生。少于约50个氨基酸残基的多肽通常称为“寡肽”。
[0029]术语“启动子”在本文中就其本领域公知的意义使用以表示提供结合RNA聚合酶和启动可操作连接编码序列转录的包含DNA序列的基因部分。启动子序列通常在基因的5’非编码区。
[0030]“蛋白质”是包含一条或多条多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分，如糖基团。糖和其它非肽取代基可由产生蛋白质的细胞加入到蛋白质中，其会随细胞类型而变化。本文在其氨基酸主链结构方面定义蛋白；取代基例如糖基通常没有指定，但是可以存在。
[0031]本发明融合蛋白背景下术语"基本相似"指示多肽包含的序列与参照序列(如本文示例的GP-Fc融合)在超过10-20个氨基酸的比较窗口上有至少90%，优选至少95%序列相同性。序列相同性百分比通过在比较窗口中对比两种最佳比对序列而测定，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种序列。该百分比如下计算:通过测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列相同性百分比。
[0032]附图简要说明
[0033]图1是ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc蛋白的示意图和纯化。A)融合蛋白的示意图。所述ZEBOVGP-Fc融合蛋白包含ZEBOV GP胞外域，所述胞外域在C末端有FLAG肽标签，并且融合到人IgGl的铰链和Fe区。所述FLAG-Fc融合蛋白包含融合到人IgGl的铰链和Fe区的FLAG标签。B)融合蛋白的SDS-PAGE分析。蛋白A纯化的ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc制品通过变性SDS-PAGE在4-12%梯度胶中分析并用考马斯蓝染色。C) ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc的Western印迹分析。蛋白在变性条件下通过SDS-PAGE分解，转移到PVDF膜上，并且用ZEBOV特异性抗GPlmAbl3F6-l-2、抗Flag M2mAb或山羊抗人Fe Ab探测。ZEBOV GPl、GP2_FLAG_Fc和FLAG-Fc条带用箭头指示。蛋白和分子量标记物用kDa指示。
[0034]图2是ZEBOVGP-Fc融合蛋白的鉴定。A)蛋白A纯化的ZEBOVGP-Fc的FPLC分析。未消化的(灰色)或肠激酶消化的(蓝色)ZEBOVGP-Fc在非变性条件下通过Superdex200大小排阻柱，并且对38个收集的组分各记录280nm吸光度。表示ZEBOVGP-Fc、ZEBOV GP以及Fe的峰用箭头标记。约150kDa的峰表示肠激酶制品中的运载体蛋白。箭头显示分子量标准的移动，并且其分子量用kDa表示。B)肠激酶消化的ZEBOVGP-Fc蛋白的Western印迹分析。凝胶过滤峰组分(20和32)在变性SDS-PAGE中分开，转移到PVDF膜，用ZEBOV特异性抗GPlmAbl3F6-l-2或山羊抗人抗Fe抗体探测。凝胶中包含未消化的(U)或肠激酶消化的(D) ZEBOVGP-Fc 和 FLAG-Fc (Fe)作为标记。箭头指示 GPl、GP2_FLAG_Fc 和 FLAG-Fc 的移动。分子量标记的移动和其大小用kDa指示。
[0035]图3显示了已接种C57BL/6小鼠中抗ZEBOV GP抗体的分析。A)通过病毒颗粒ELISA的抗ZEBOV GP特异性抗体分析。小鼠用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接种，并且最终接种后2周获得血清样品。在用蔗糖纯化的经辐射ZEBOV颗粒、rVSV-ZEBOVGP或对照野生型VSV涂层的96孔板上滴定血清。各小鼠血清的终点稀释效价用点表示。B)小鼠血清与HEK293-ZEB0VGP细胞细胞表面所表达ZE`B0VGP结合的FACS分析。HEK293-ZEB0VGP或对照载体转染的HEK293细胞用小鼠血清(I μ I)和PE偶联的山羊抗小鼠IgG Ab染色，和通过流式细胞仪分析。各小鼠血清的柱状图用不同颜色显示，并且阳性对照抗GP mAbl3F6-l-2的柱状图用灰色虚线表示。为了使图简单，对两只不同小鼠(一只用ZEBOVGP-Fc (左图)接种，另一只用FLAG-Fc (右图)接种)的血清用相同颜色。
[0036]图4显示用已接种C57BL/6小鼠血清的rVSV-ZEBOVGP中和。Vero E6细胞中，使用IOOpfu的rVSV-ZEBOVGP进行空斑减少试验，所述rVSV-ZEBOVGP用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接种小鼠的5倍稀释血清处理。计算各小鼠血清的中和百分比，作为相较未处理rVSV-ZEBOVGP的空斑数目下降。数据显示了各小鼠血清稀释的重复样品中的平均中和百分比I，和条线表不标准偏差。
[0037]图5显示用ZEBOVGP-Fc接种的BALB/c小鼠中的体液免疫反应。4只BALB/c小鼠用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc免疫。最后接种后2周收集血清样品。A)按照图3A所述在用rVSV-ZEBOVGP涂层的平板上通过病毒颗粒ELISA完成抗ZEBOV GP特异性抗体分析。B)用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接种的BALB/c小鼠血清的rVSV-ZEBOVGP中和。1/10稀释血清的平均中和通过使用如图4所述重复样品的空斑减少试验来测定。数据显示各样品内平均中和的平均百分比(n=4)，和条线表示标准偏差。ZEBOVGP-Fc-和FLAG-Fc-接种小鼠血清中和之间的差异是统计学显著的(**，P ≤0.01)。
[0038]图6显示用ZEBOVGP-Fc接种的BALB/c小鼠中的细胞免疫反应。图5中经接种BALB/c小鼠脾细胞在最终免疫后8天收集，用融合蛋白或肽刺激，并且用APC标记的抗CD8mAb染色细胞表面，和用PE标记的抗IFN- y mAb进行细胞内染色。生成IFN- Y的CD8+T细胞百分比通过⑶8+脾细胞门控的流式细胞仪测定。A)点图分析来自用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc接种和用ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc刺激的代表性小鼠的CD8+脾细胞。表达CD8和IFN-Y的双阳性脾细胞在矩形盒中显示，并且数目表示盒中IFN-Y-阳性⑶8+细胞的百分比。B-E)柱状图表示来自用ZEBOVGP-Fc (B，D)或FLAG-Fc (C，E)接种和用Fe融合蛋白(B, C)或合成肽(D，E)刺激的小鼠脾细胞中IFN- Y -阳性CD8+细胞的百分比。脾细胞用Fe融合蛋白ZEBOVGP-Fc或FLAG-Fc、或ZEBOV GP特异性或对照合成肽刺激。数据显示表达IFN- Y的总⑶8+细胞的平均百分比(n=4只小鼠)，和条线表示标准偏差。用ZEBOVGP-Fc和FLAG-Fc刺激的ZEBOVGP-Fc-接种小鼠中IFN- Y -阳性⑶8+脾细胞百分比差异有统计学显著性(*，ρ=0.01)。
[0039]图7显示了针对ZEBOV致死攻击的ZEBOVGP-Fc保护小鼠。小鼠用ZEBOVGP-Fc (实心三角)或FLAG-Fc (空心正方形)接种，并且最后接种后2周，用1，OOOpfu的小鼠适应性ZEBOV攻击。对各接种组的存活百分比结果作图(每组n=8只小鼠)。
[0040]图8显示了用ZEBOVGP-Fc融合蛋白接种的豚鼠血清中病毒颗粒ELISA的实验结果。7只豚鼠(GP-Fcl-GP-Fc7)用含ZEBOVGP-Fc的QS-21佐剂接种。2次加强后动物放血，并且通过病毒颗粒ELISA分析血清的抗ZEB0VGP抗体。所有动物发展出高效价的抗ZEB0VGP抗体。
[0041]图9显示了用对照Fe片段接种的豚鼠血清中病毒颗粒ELISA的实验结果。7只豚鼠(Fcl-Fc7)用仅含Fe片段的QS-21佐剂接种。2次加强后动物放血，并且通过病毒颗粒ELISA分析血清的抗ZEB0VGP抗体。没有动物发展出抗ZEB0VGP抗体。
[0042]图10显示了用ZEBOVGP-Fc接种豚鼠血清的扎伊尔埃博拉假型病毒中和。扎伊尔埃博拉病毒假型用来自接种有ZEBOVGP-Fc或单独Fe片段的豚鼠的血清中和。相较免疫前血清，测定中和百分比。所有ZEBOVGP-Fc接种动物发展出抗ZEBOV中和抗体，而没有Fe接种动物发展出抗ZEBOV中和抗体。图11显示三只猕猴中抗埃博拉病毒抗体的分析。接种前，三只猕猴的血清通过病毒颗粒ELISA测试抗埃博拉病毒的GP抗体。猴子都没有抗埃博拉病毒抗体。
[0043]图12显示了用ZEBOVGP-Fc接种的猕猴发展出抗埃博拉病毒抗体。用ZEBOVGP-Fc (GP-Fcl和GP_Fc2)接种的2只猴子的血清包含如病毒颗粒ELISA所评价的高效价抗埃博拉病毒抗体，而仅用Fe片段(Fe)接种的对照猴的血清没有发展出抗埃博拉病毒抗体。
[0044]图13显示用ZEBOVGP-Fc接种猕猴血清的埃博拉假型病毒中和。用ZEBOVGP-Fc接种的猕猴GP-Fcl和-2和仅用Fe片段接种的对照猴Fe的血清在包含Vero E6细胞单层的96孔板中通过终点稀释试验测试抗埃博拉病毒中和抗体。初次免疫(疫苗)后3周收集血清，动物用对应病毒加强，并且加强(第一次加强)后3周收集血清。相较免疫前血清，测定中和百分比。ZEBOVGP-Fc接种的猴发展出抗埃博拉病毒中和抗体，而用Fe对照接种的猴没有发展出中和抗体。
[0045]发明详述
[0046]本发明显示了包含融合到免疫球蛋白多肽片段的纤丝病毒糖蛋白(GP)片段的融合蛋白经历了天然GP中观察到的剪切和加工。本文显示的结果清楚指出所述GP融合蛋白不需要病毒载体或组装成病毒样颗粒，本身就足以诱导对纤丝病毒感染的保护，并且用作针对纤丝病毒感染的安全和有效的亚基疫苗。
[0047]如下面详细所示，哺乳动物细胞中表达的融合到免疫球蛋白片段(如人IgGl的Fe片段)的纤丝病毒GP (如ZEBOV GP)胞外结构域经历复杂的翻译后修饰，包含天然GP中观察到的弗林蛋白酶切割和同源三聚体形成。用纤丝病毒GP-1gG融合体接种会保护小鼠抵御扎伊尔EBOV的致死剂量攻击。本文所述结果显示所述纤丝病毒GP-1gG融合体不需要病毒载体或组装成病毒样颗粒，就足以诱导对纤丝病毒感染的保护，并且显示了纤丝病毒GP-1gG融合体用作针对纤丝病毒感染的安全和有效的亚基疫苗。
[0048]纤丝病毒GP-免疫球蛋白融合蛋白
[0049]埃博拉病毒和马尔堡(Marburg)病毒组成纤丝病毒科(Filoviridae)。有5种埃博拉病毒:扎伊尔(模式种)、苏丹、莱斯顿、本迪布焦和象牙海岸。有一种马尔堡病毒。所示糖蛋白(GP)是构成病毒颗粒表面突起的唯一结构蛋白，所述突起调节病毒通过受体结合进入易感宿主细胞。GP是研究最多的纤丝病毒蛋白，不仅由于其在病毒进入和发病机制中的重要性，而且也因为是疫苗开发的首要靶标。
[0050]纤丝病毒颗粒包含约19kb长的负链RNA基因组，编码7个结构蛋白和I个非结构蛋白(Volchkov等，Adv Virus Res2005;64:359-81)。包膜糖蛋白(GP)存在于病毒颗粒表面突起上，并且对受体结合、病毒进入和免疫起作用(Feldmann等，J Gen Virol2001年 12 月;82 (Ptl2):2839-48 和 Takada 等，Proc Natl Acad Sci U S A1997 年 12 月 23日；94 (26): 14764-9)。 所述纤丝病毒GP是来自基因4的I型膜整合糖蛋白，经历涉及GP的N-末端和近膜部分之间弗林蛋白酶切割和二硫键形成的复杂加工。病毒包膜和感染细胞的膜上存在的成熟跨膜GP由两个亚基形成:通过二硫键共价连接到GPlN末端的膜锚定GP2,其包含高ο-糖基化的粘蛋白样结构域(Volchkov等，Proc Natl Acad Sci U S A1998年 5 月 12 日；95(10):5762-7)和 Jeffers 等，J Virol2002 年 12 月;76(24):12463-72)。大量的GPl在从GP2亚基释放后于细胞中脱落。另外，与GPl共有氨基末端295氨基酸的非结构可溶糖蛋白(sGP)缺少跨膜锚，并且形成二硫键连接的同源二聚体，其由EBOV而不是 MARV 感染的细胞生成(Feldmann 等，Curr Top Microbiol Immunol 1999; 235:1-21)。
[0051]编码纤丝病毒GP的很多基因被克隆，并且描述于文献(见例如W02006/037038)。技术人员能容易克隆所需基因或使用前述基因。表1提供了来自各种埃博拉和马尔堡病毒亚型的示例性GP序列的GenBank 登录号汇总。
[0052]表1
【权利要求】
1.ー种包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述纤丝病毒糖蛋白片段是胞外结构域。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述纤丝病毒糖蛋白片段来自埃博拉病4。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊尔埃博拉病毒Mayinga 株。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白多肽片段是免疫球蛋白重链恒定区多肽。
6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白是IgGl。
7.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之间的接头。
8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白有如SEQID N0:2所示的序列。
9.ー种包含如权利要求1所述的融合蛋白的免疫原性组合物。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
11.ー种核酸载体，所述载体包括含有纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段的融合蛋白的编码核酸序列。
12.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述纤丝病毒糖蛋白片段是胞外结构域。
13.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述纤丝病毒糖蛋白片段来自埃博拉病毒。
14.如权利要求13所述的核酸载体，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊尔埃博拉病毒 Mayinga 株。
15.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述免疫球蛋白多肽片段是免疫球蛋白重链恒定区多肽。
16.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述免疫球蛋白是IgGl。
17.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述核酸载体还包含纤丝病毒糖蛋白片段和免疫球蛋白多肽片段之间接头的编码核酸序列。
18.如权利要求11所述的核酸载体，其特征在于，所述融合蛋白的编码核酸序列有SEQID NO:1所示的序列。
19.一种诱导患者中对纤丝病毒感染的保护免疫反应的方法，所述方法包含给予患者免疫有效量的如权利要求9所述免疫原性组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述免疫原性组合物肌肉内给予。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法还包含给予含有第二纤丝病毒抗原的免疫原性组合物的步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第二抗原通过重组病毒载体表达。
23.一种诱导患者中对纤丝病毒感染的保护免疫反应的方法，所述方法包含给予患者免疫有效量的如权利要求11所述核酸载体。
24.一种检测患者中对纤丝病毒免疫反应的方法，所述方法包含使患者的生物样品接触如权利要求1所述的融合蛋白，并且检测免疫反应。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述检测免疫反应的步骤包含检测生物样品中抗体和融合蛋白结合的步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述检测抗体结合的步骤通过ELISA、化学发光试验或荧光试验进行。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述检测免疫反应的步骤包含检测细胞免疫反应的步骤。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述检测细胞免疫反应的步骤通过检测IFN-Y 或 TNF-α 进行。
29.一种检测患者生物样品内中和抗体的方法，所述方法包含使生物样品接触易受纤丝病毒感染的细胞和表达纤丝病毒GP的重组水疱性口炎病毒(VSV)。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述重组VSV还表达荧光蛋白。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述重组VSV表达埃博拉表达GP。
32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述埃博拉病毒是扎伊尔埃博拉病毒Mayinga 株。
33.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述易受纤丝病毒感染的细胞是VeroΕ6细胞。
34.一种检测患者生物样品中抗纤丝病毒抗体的方法，所述方法包含使生物样品接触结合在固体支持物上的重组VSV，并且检测结合重组VSV的抗纤丝病毒抗体。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述抗纤丝病毒抗体使用ELISA、化学发光法或荧光法检测。
【文档编号】G01N33/50GK103596587SQ201180063188
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2011年10月28日 优先权日:2010年10月28日
【发明者】G·卡普兰, K·孔多鲁, J·杰奎斯, S·巴瓦利, S·布拉德福特 申请人:健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府, 美国陆军传染病医学研究所