用于分析生物大分子复合物的方法及其用途

用于分析生物大分子复合物的方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的方法。特别地，该方法能够在适当波长下基于作为温度函数的荧光变化来确定所述复合物的最大稳定性，其中所述荧光变化反映出生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的状态。所述方法以作为温度的函数的二态或多态的解叠荧光曲线的确定为基础，根据多态的解叠模型来拟合所述曲线。此外，提供用于确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的计算机程序、计算机程序存储介质以及设备和系统。
【专利说明】用于分析生物大分子复合物的方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种确定生物大分子复合物(macromoleCUIar complexes)的组成(assembly)、均匀性和/或热力学稳定性的方法。特别地，该方法能够在适当波长下基于作为温度函数的荧光变化来确定所述复合物的最大稳定性，其中所述荧光变化反映出生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的状态。所述方法以作为温度的函数的二态或多态的解叠突光曲线(unfolding fluorescence curves)的确定为基础，根据多态的解叠模型来拟合所述曲线。此外，还提供用于确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的计算机程序、计算机程序存储介质以及设备和系统。
【背景技术】
[0002]大分子复合物，例如生物大分子复合物是不同或相同部分的超分子组成。例如生物大分子复合物是相同的或不同的生物分子，甚至是不同类型的生物分子的组成。这类生物分子包括蛋白质、核酸、脂质和糖。通常，该大分子复合物在存在于天然环境中的特定条件下形成，例如活生物体。所述大分子复合物对活生物体的生存至关重要，并且在各种生化途径中具有关键作用。从机理上来理解这些大分子复合物如何进行它们任务的关键是对它们的三维结构的认知。研究大分子复合物的结构、特别是其功能的一个主要障碍是其组合的复杂性和常见的所述结构的相对不稳定性，特别是当大分子复合物从自然环境中分离时。也就是说，在纯化过程中和在经纯化的状态下或在重组表达或合成制造时，大分子复合物的结构的确定及正确的构造(formation)组合是困难的。也就是说，现行的生物科学研究揭示大分子一般不会孤立地起作用，而是组织成超分子组合体。这些被称为大分子复合物或分子机器的组件(modules)是活性物种(active species),其进行对维持细胞内稳态必不可少的生化反应。分子机器或大分子复合物(以下称为大分子复合物或通常称作复合物)可分为三大类:仅由蛋白质组成的那些复合物、由蛋白质和核酸组成的复合物和整合膜复合物(integral membrane complex)。
[0003]不拘束于大分子复合物的本质，确定其三维结构以获得对在细胞内各自作用模式的机理性认识是必不可少的。为此，诸如“TAP-标记(TAP-tagging)”和重组多蛋白表达技术的最新进展已经使得许多大分子复合物的生化提纯在技术上变得可行。尽管在分离和重组细胞的分子机器能力方面上有巨大的进步，但仍然缺乏有关它们的结构信息。这一差距可能是因为这些复合物所固有的且限制纯化收率的生化复杂性。此外，大多数分子机器纯化前是不稳定的并且往往在构象上是异构体。然而，大多数的纯化方案会采用有限制的一组缓冲体系，例如磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲生理盐水(TBS)或HEPES缓冲生理盐水(HBS)。也就是说，纯化方案并没有配合最适宜于纯化的条件来进行生物大分子复合物的纯化，其中所述复合物以其在天然环境(即细胞环境)中的形式存在。
[0004]此外，经分离的大分子复合物通常是相当不稳定的，因此稳定化的复合物或稳定性改进的复合物是内在的需要。因此，在分离和纯化复合物的过程中，需要尽早一步地对许多纯化的大分子复合物，特别是生物大分子复合物的稳定性进行优化以使这些组成符合结构生物学以及适用于例如功能性的研究。
[0005]通常已知蛋白质的稳定性取决于缓冲体系。pH、离子强度、在溶液中盐及其浓度、添加剂、配体和介电常数以及粘度会影响复合物的稳定性。确定任意的大分子材料稳定性的简单方法是在任意给定的溶质中测量其对温度的逐渐增加做出响应的解叠行为。这可以通过差示扫描量热法(DSC)或差示扫描光散射(DSLS)的方法来完成。第三种可能性是在存在染料的情况下进行热解叠，该染料的荧光性在极性环境中淬灭，而在解叠前当所述染料被暴露在例如蛋白质的疏水核心(hydrophobic core)的疏水环境中时强烈地发出突光信号。这种方法被称为热突光法(thermofluor method)或差示扫描突光法(DSF)。这些方法受限于高通量的设定并且也被用来在各种缓冲条件和小分子存在下确定单域蛋白质(single-domain proteins)的稳定条件。W02010/109204于近期描述了与确定热稳定性的分析方法有关的热荧光法。其中所述的方法可以确定单域蛋白质的稳定条件并仅是以确定所述蛋白质的解链温度TmS基础。然而，从中所确定的是在复合物(即多域蛋白质)中该蛋白质的各个部分可以独立地解链从而产生多个的TM。最近，Kopec J.，and SchneiderG.，J.Structural Biol.2011，do1: 10.1016/J.JSB2011.04.006 论述了基于荧光和光散射比较的方法以接近蛋白质-蛋白质复合物的形成和稳定。其中，已经应用DSLS和DSF方法以确定蛋白质的稳定条件。特别地，已将这两种方法的比较应用于蛋白质-蛋白质复合物的缓冲条件的优化。然而，其中所描述的方法还是仅以蛋白质-蛋白质复合物的Tm的确定为基础。
[0006]DSF的简单性和低样品要求使得用所述方法对于确定大分子复合物的稳定性来说尤为有用。然而，除了 Kopec等人的最近公开物(其中分析了蛋白质-蛋白质复合物)夕卜，基于每个单独的域/亚单元(subunit)会独立地解叠从而产生多相的解叠曲线，所述方法并未被认为可用于多域蛋白质和分子机器。这样的曲线不包含复合物稳定性的信息，而只包含各个组分的稳定性的信息。
[0007]因此，不断需要可以确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的方法和系统。所述方法对于确定所述大分子复合物的稳定条件(stabilizingconditions)来说应当是尤为可用的,从而可以对所述复合物进行进一步的功能分析。

【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供一种确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的新方法。已经被认知的是，计算大分子复合物明显的解链温度不足以分析其稳定条件(stabilizing conditions)并优化所述稳定条件。相比之下，要求通过以根据多态解叠模型(优选二态至六态的模型范围)拟合所述曲线的方式确定作为温度函数的样品表面的二态解叠荧光曲线来改进现有方法。根据解叠模型的物理参数，通过例如Levenberg-Marquardt算法来进行拟合以获得过渡性的解叠曲线。然后用最佳拟合曲线来进行进一步的处理，并且仅当与最佳拟合模型的数据差异小到可以忽略时假定二态的模型。
[0009]因此，第一方面，本发明提供了一种确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的方法。包括以下步骤:
[0010]-提供在包含缓冲体系和荧光染料的样品中的一种或多种生物大分子的复合物；[0011]-在热平衡后，以适用于测量所述样品荧光度的速率逐渐地增加所述样品的温度，从而在适当的波长下以荧光曲线的形式确定作为温度函数的荧光度，其中所述荧光反映出所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的状态；
[0012]-基于以下的方法计算所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性:
[0013]a)根据二态至六态模型的多态解叠模型，通过拟合所述曲线来确定样品的作为温度函数的表观二态解叠突光曲线(apparent two state unfolding fluorescence curve),例如通过确定基于Levenberg-Marquardt算法的解叠状态用来获得过渡曲线和X2的最小化并比较所述曲线来优化二态曲线；通过将所述曲线拟合至二态到六态模型的多态解叠模型来确定样品的作为温度函数的表观二态解叠荧光曲线，例如通过确定以用于获得过渡曲线和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法为基础的解叠状态并比较所述曲线来优化二态曲线；
[0014]b)计算二态模型中拐点处的所述过渡性曲线的斜率；
[0015]c)计算解链温度Tm和/或解叠焓Λ H。
[0016]此外，本发明提供一种确定生物大分子复合物(例如多态复合物)的稳定条件的方法，包括以下步骤:根据上述用于至少两个或多个不同样品的方法比较样品的组成、均匀性和/或热力学稳定性并确定该条件，其中存在最稳定的条件。
[0017]此外,本发明的方法允许配体结合(ligand binding)的筛选,对去稳定的或抑制复合物形成的或稳定化的或促进复合物形成的化合物的筛选，或对确定配体对由一个生物体相对于另一个生物体分离出的复合物的专一'I"生(specificity)的筛选。
[0018]另一方面，本发明提供一个用于实施本发明方法的以具有程序代码的计算机可读形式存在的计算机程序。而且，本发明提供了一种用于确定生物大分子复合物(例如多态复合物)的组成、均匀性和/或热力学稳定性的系统，该系统是基于DSF，其包括DSF装置和包含根据本发明的用于实施本发明方法的软件或计算机程序的数据处理单元。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1示出了缓冲条件对DSF曲线的影响的比较和电子显微图像。次优的缓冲条件揭示了多相的解叠曲线(前两行)。在最佳的缓冲条件下获得二态的解叠曲线(第三行)。在这些条件下不能再在EM图像上观察到聚集体(aggregates)。
[0020]图2示出了在不存在或存在dATP或ATP的情况下的GroEL/GroES复合物的形成。如图所示，在存在dATP或ATP的情况下形成GroEL/GroES复合物。
[0021]图3示出了用50mM EDTA80S核糖体处理后会变得不稳定并且不再显示出二态的解叠状态(behaviour)(中图)。pH6时在咪唑和IOmM MgCl2中稳定状态最佳(右图)。
[0022]图4示出了对由13个不同的不含半胱胺酸的球蛋白域以及较小的具有3个半胱胺酸的N端非球蛋白(nonglobin)域组成的BGHb (Biomaphalaria glabrata的血红蛋白，haemoglobin of Biomaphalaria glabrata)作出的复合物形成方面的分析。
[0023]图5示出了根据本发明所执行的步骤流程图。
[0024]图6示出了基于本发明的不同的选择步骤所选择或排除的曲线。参考图5所示的流程图所标识的步骤。【具体实施方式】
[0025]第一方面，本发明涉及确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的方法，其包括以下步骤:
[0026]-提供在包含缓冲体系和荧光染料的样品中的一种或多种生物大分子的复合物；
[0027]-以适于测量所述样品的荧光度的速率逐渐增加所述样品的温度，从而在合适的波长下以荧光曲线的形式确定作为温度函数的荧光度，其中所述荧光度反映出所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的状态；
[0028]-基于以下方法计算所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性:
[0029]a)根据二态至六态模型的多态解叠模型，通过拟合所述曲线来确定作为温度函数的样品表观二态解叠突光曲线，例如通过确定基于Levenberg-Marquardt算法的解叠状态用来获得过渡曲线和X2的最小化并比较所述曲线来优化二态曲线；通过将所述曲线拟合至二态到六态模型的多态解叠模型来确定样品的作为温度函数的表观二态解叠荧光曲线，例如通过确定以用于获得过渡曲线和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法为基础的解叠状态并比较所述曲线来优化二态曲线；
[0030]b)计算二态模型中拐点处的所述过渡性曲线的斜率；
[0031 ] c)计算解链温度Tm和/或解叠焓Λ H。
[0032]本文所用术语“ X2最小化”是Levenberg-Marquardt算法的一部分(NumericalRecipes,第三版,第十五章,第799页)。
[0033]此外，术语“解叠过渡的拐点”被定义为复合物的解链点(melting point)。
[0034]本文所用术语“R2”是指实验曲线符合模型的程度。当R2在0.999以下时，优选将该曲线摒弃。优选R2尽可能接近I。
[0035]所述突光染料优选为溶剂化显色(solvatochromatic)的染料。溶剂化显色的染料是一种在极性溶剂中其荧光发射会淬灭的染料，而当置于疏水性溶剂的环境时所述染料会发出强烈的突光。
[0036]也就是说，当由升温而导致逐渐解叠时，生物大分子复合物的疏水性残基的溶剂暴露(solvent exposition)出现,并且同时由于疏水性溶剂环境的存在度不断增加使溶剂化显色染料的荧光发射信号增加。本领域技术人员非常了解适合的荧光染料。换言之，公知的适用于热突光分析的突光染料包括:宝石橙(sypro orange)、硫代肌苷(thioinosine)、N-亚乙烯基腺苷(N-ethenoadenosine)、间型霉素、丹酰衍生物(dansyl derivatives)、荧光素衍生物、6-丙酰基-2-( 二甲基氨基)-萘(PRODAN)、2_苯胺基萘和N-芳基氨萘磺酸衍生物(N-arylamino-naphthalene sulfonate derivatives),例如 1-苯胺萘 _8_ 横酸(1，8-ANS)、2-苯胺萘-6-磺酸(2，6-ANS)、2-氨基萘-6-磺酸、N，N-二甲基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-2-氨基萘、N-环己基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-2-氨基萘-6-磺酸、N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸、N-(邻甲苯酰基)-2-氨基萘-6-磺酸、N-(间甲苯酰基)-2-氨基萘-6-磺酸、N-(对甲苯酰基)-2-氨基萘-6-磺酸、2-(对甲苯氨基萘)-萘-6-石黄酸(2- (p-toluidinyl) -naphthalene-6-sulfonic acid) (2, 6-TNS)、4_ ( 二氰基乙烯基)久洛利啶(DCVJ)、6_十二酰基-2-二甲基氨基萘(LAURDAN)、6-十六酰基-2-( ((2_(三甲基胺基)乙基)甲基)氨基)萘氯(6-hexadecanoyl-2- (((2- (trimethylammonium) ethyl)methyl) amino) naphthalenech loride) (PATMAN)、尼罗红、N-苯基-1-萘胺、1，1- 二氰基-2-[6_( 二甲基氨基)萘-2_基]丙烯(DDNP)、4，4’ - 二苯胺基-1，1-联萘-5, 5- 二横酸(4, 4，-dianilino-1, l-binaphthyl-5, 5-disulfonic acid) (b1-ANS)和DAPOXYL 衍生物(Molecular Probes, Eugene, Oreg.)。
[0037]在一项实施方式中，所述染料为购自Molecular Probes Inc.公司的宝石橙(sypro orange) ?在一项实施方式中，在波长530nm处测量突光度。
[0038]用于测量发射光的合适的仪器包括装有在适当波长处发射和测量光的任意第二代的实时 PCR 系统，例如购自 Applied Biosystems 的 7900HT fast real-time PCR 系统和购自 Biorad 的 CFX96real_time PCR 仪器。
[0039]通常运行的温度约为:例如基于384个孔板(well block),从20°C~100°C使用约为0.020C /sec的温度梯度，但如果需要也可以从40~100°C。在使用7900HT系统的情况下，基于384个孔板的最小升降温速率(ramp rate)可例如为0.02°C /sec(l%的功率)。该系统中基于384个孔板的最大升降温速率可例如为2V /sec.(100%的功率)。因此，适合的升降温速率范围为约0.02~约2V /sec。
[0040]在一项实施方式中，同时分析2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、94、96、100、150、200、250、300、350个或更多个例如384或1024个蛋白质样品。所述仪器可
结合自动装置使用以进一步地自动化所述过程并且无需人为干预就可增加可处理的样品的数量。 [0041]所述方法优选以DSF (差示扫描荧光法)为基础。DSF可用作高通量的筛选技术，其产生大量的需要翻译的数据，从而要求数据分析的自动化。优选地将归因于错误信号的数据组或曲线滤出。这些错误的信号或测量包括归因于气泡、移液错误、染料结晶或大分子复合物的部分聚结等的错误结果。此外，该方法优选包括用于数据归一化的背景扣除(background subtraction)。这一方面,在另一项优选的实施方式中将作为温度的函数的荧光曲线归一化以获得过渡曲线，其中将所述曲线最低的局部最小值设定为O并将最高的最大值设定为1000，而位于由这两个数据点所定的范围之外的实验值被从所述曲线的计算中排除。
[0042]荧光的增加等同于大分子复合物的解叠是公认的。
[0043]因此，下一步需要根据多态的解叠模型来拟合作为温度函数的样品的荧光曲线，所述多态的解叠模型包括二态、三态、四态、五态和六态。在稳定条件下会获得一个表面二态解叠荧光曲线。这些经拟合的曲线也被称为过渡曲线。例如，通过使用Levenberg-Marquardt-算法和最小化X2来进行拟合。此外，优选基于对二态的R2的确定来测定用于优化二态曲线的相似度。
[0044]此外，在优选的实施方式中，所述方法包括:计算二态模型中拐点处过渡曲线的斜率，并附加地或任选地，优选计算温度Tm和/或解叠焓ΛΗ。本领域技术人员熟知适用于计算各个参数的装置和方法。
[0045]此外，在进一步优选的实施方式中，所述方法包括步骤:使用缓冲体系的ΛΡΚα/Τ值来确定解叠过渡曲线的拐点处的实验pH值，其用于示出作为温度函数的适当波长的荧光曲线。
[0046]特别优选的是，以非线性地拟合解叠过渡曲线的斜率为基础来计算ΛΗ。在这种情况下，△ H表示全部解叠焓和离解焓的加权平均值。[0047]为了进一步的分析，本发明的方法包括确定生物大分子复合物(例如多肽复合物)的稳定条件，对于来说，包括以下步骤:正如本发明的方法所确定的，比较至少两个或多个不同的样品的样品组成、均匀性和/或热力学稳定性，并在最稳定的状态出现时确定该条件。
[0048]优选将用于确定最稳定的状态的曲线启发性地(heuristically)分类以用于确定预定参数。也就是说，本发明的方法可以确定生物大分子复合物的最稳定的状态。因此，这种方法特别适用于确定所述复合物的稳定缓冲条件(stabilizing bufferconditions),特别是用于这些复合物的分离和技术分析。
[0049]在一项优选的实施方式中，所述复合物包括蛋白质、核酸、糖和/或脂质。例如可检查蛋白质/蛋白质复合物的组成、均匀性和热力学稳定性。此外，发明人成功地分析了蛋白质-核酸复合物。
[0050]在另一项优选的实施方式中，将曲线启发性地分类以确定预定参数。特别地，优选按下列顺序来选择预定参数:得出多相解叠模型拟合实验数据的结果，拟合该结果以优化二态模型、二态模型的解叠焓△ H、二态模型的Tm、最佳拟合模型的ΛΗ、最佳拟合模型的^以及在过渡曲线的最低局部最小值和最高局部最大值下方的封闭区域。
[0051]因此，通过使用高通量的方法能够容易且方便地确定生物大分子复合物的稳定和不稳定状态。
[0052]该方法可用于不同的用途。例如通过使用本发明的方法能够筛选配体结合。也就是说，通过观察和比较荧光曲线，能够确定配体与所述复合物的结合。此外，该方法可以用于筛选去稳定或抑制复合物形成的化合物。另一方面，本发明的方法可以用于筛选稳定或促进复合物形成的化合物。此外，本发明可以在不同的生物体之间确定与复合物结合的配体的专一性。这在例如开发抗生素或其它化合物的领域内会令人特别感兴趣，所述抗生素或其它化合物应能在一个生物体内起效，而在另一个生物体中则不会起相同的效果，例如对病原体有效而不对主体有效。
[0053]本发明方法的另一个优`势在于，其适用于高通量的筛选反而却仅需少量的样品。
[0054]令人惊讶的是，已确定可以通过应用差不扫描突光技术(differential scanningfluorimetry technology)来分析由各种组分(例如至少2种、3种、4种或更多种不同的组分)组成的生物大分子复合物。因此，能够提供这些生物大分子复合物以用于新的活性成分的筛选方法，例如有这些大分子复合物参与的新疗法。
[0055]另一方面，本发明提供一种存储于计算机可读介质的计算机程序，其具有用于实施本发明方法的程序代码。本发明还提供一种计算机程序，当其在计算机上运行或被加载在计算机上时，会使计算机执行本发明的方法。
[0056]此外，本发明提供了包含本发明的计算机程序的计算机程序存储介质。
[0057]另一项实施方式涉及包含计算机可读存储介质的装置，该存储介质包含用于执行本发明方法的计算机指令。
[0058]最后，本发明提供了一种用于确定生物大分子复合物(例如多肽复合物)的组成、均匀性和/或热力学稳定性的系统，该系统以差示扫描荧光法和包含根据本发明的用于实施本发明方法的软件或计算机程序的数据处理单元为基础。
[0059]不受理论的束缚，热荧光测定法是基于所用染料的环境依赖性荧光。例如尽管作为合适的荧光染料的代表的SYPRO橙在极性环境中表现出较低的量子产率，但是在疏水环境中变成了超荧光。测定过程中，在升温的情况下蛋白质解叠并暴露出疏水性斑点(patch)从而导致荧光的增加。当温度进一步上升时，随后通过快速的聚集隐藏了先前暴露的疏水性斑点，从而导致荧光信号的降低。至此，通过曲线的非线性回归(non-linearregression)将所获得的DSF曲线i全释成一个简单的Boltzmann模型以确定突光增加过程中的拐点。这确定了蛋白质的解链温度并且被用作单链蛋白稳定性的结果读出(readout)(Niesen, F.H., et al.，(2007)，2，2212-2221)。不过仅解链温度的读出对于蛋白质复合物来说是不够的。在W02010/109204中也得到证实，确定复合物、多域蛋白质、蛋白质的单独部分可以独自地解链从而出现多个Tm。
[0060]假设上述的方法能够于任意的时间点在溶液中找到三种不同种类的染料:具有最大荧光值Ftl的游离的染料，具有最大信号Fn的与天然状态蛋白质相结合的染料，表示所有的天然蛋白质是原生的且与染料结合的，以及与解叠的蛋白质结合的染料，即F?。可将在每个时间点测量的荧光信号表示为由这三种染料所发出的信号部分的总和:
[0061]F = f/N+f/u+Fo (1)
[0062]其中&和分别为解叠蛋白质状态和未解叠蛋白质状态的分数。因为相比于蛋白质，染料大量的，所以Ftl在实验过程中不会改变，并且通过基线实验可将其在实验中简单地扣除。因此，在下文中可以忽略F。。
[0063]假设由平衡常数1(=4/%来表示简单的二态模型，这推导出:
[0064]
【权利要求】
1.一种确定生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的方法，包括以下步骤: -提供包含缓冲体系和荧光染料的样品中的一种或多种生物大分子的复合物； -在热平衡后以适用于测量所述样品的荧光的速率逐渐地增加所述样品的温度，从而在适当波长下确定作为温度函数的荧光强度，其中所述荧光强度反映出所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的状态； -基于以下方法计算出所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性: a)根据二态至六态模型的多态解叠模型，通过拟合所述曲线来确定样品的作为温度函数的表观二态解叠荧光曲线，例如通过确定以用于获得过渡曲线和X2的最小化的Levenberg-Marquardt算法为基础的解叠状态并比较所述曲线来优化二态曲线； b)计算二态模型中所述过渡性曲线在拐点处的斜率； c)计算解链温度Tm和/或解叠焓ΛH。
2.权利要求1所述的方法，其中计算所述复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的步骤包括根据所述曲线的第一部分中明显的负斜率确定待丢弃的曲线。
3.权利要求1或2所述的方法，其中归一化作为温度函数的所述荧光曲线用于获得过渡曲线，其中将所述曲线最低的局部最小值设定为O并将最高的最大值设定为1000，将处于由这两个数据点所定的范围之外的实验值从所述曲线的计算中排除。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用缓冲体系的ApKaA值来确定所述解叠过渡的曲线的拐点处的实验PH值，所述曲线示出适当波长的作为温度函数的荧光强度。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所述解叠过渡的斜率来计算所述ΔΗ。
6.确定例如多态复合物的生物大分子复合物的稳定条件的方法，包括步骤:对于至少两个或多个不同样品，比较根据方法权利要求1~5中任一项所确定样品的组成、均匀性和/或热力学稳定性，并且在最稳定条件出现时，确定该条件。
7.权利要求6所述的方法，其中将所述曲线启发性地排序以获得预定参数。
8.权利要求7所述的方法，其中按下列顺序选择所述预定参数:实验数据的R2、优化的二态模型的R2、二态模型的解叠△ H、二态模型的Tn1、最佳拟合模型的ΛΗ、最佳拟合模型的Tffl以及在所述过渡曲线的最低局部最小值和最高局部最大值下方的封闭区域。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中预先丢弃具有高光散射强度的曲线。
10.前述权利要求中任一项所述的方法用于确定所述复合物的去稳定条件的用途。
11.前述权利要求中任一项所述的方法用于筛选配体结合，用于筛选稳定化、去稳定化或抑制复合物形成的化合物，用于确定配体对由一个生物体相对于另一个生物体分离出的复合物的专一性用途。
12.前述权利要求中任一项所述的方法用于确定允许进一步分析和处理所述复合物的缓冲条件的用途。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述曲线以差示扫描荧光法(DSF)为基础。
14.前述权利要 求中任一项所述的方法，其中所述计算是由软件来实现的。
15.一种存储于计算机可读介质上的计算机程序，具有用于实施权利要求1~14中至少一项所述方法的程序代码。
16.一种计算机程序，当其在计算机上运行或加载于计算机时，使计算机运行权利要求1~14中至少一项所述的方法。
17.一种计算机存储介质，包含权利要求15或16所述的计算机程序。
18.包含计算机可读存储介质的设备，所述计算机可读存储介质包含用于实施权利要求I~14中至少一项所述的方法的程序指令。
19.一种用于确定例如多态复合物的生物大分子复合物的组成、均匀性和/或热力学稳定性的系统，其中所述系统以差示扫描荧光法为基础，包括用于差示扫描荧光的装置和包含权利要求15或16中任一项用于实施权利要求1~14中至少一项所述的方法的软件或计算机程序的数据处理 单元 。
【文档编号】G01N33/68GK103797367SQ201180073278
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2011年9月6日 优先权日:2011年9月6日
【发明者】H.斯塔克, A.查里, D.哈兹尔巴赫, J-M.柯维斯 申请人:马克斯.普朗克促进科学协会