利用大肠杆菌yiat蛋白质的靶蛋白的表面表达方法
【专利摘要】本发明涉及靶蛋白的表面表达载体、将利用上述载体的靶蛋白表达在细胞表面的方法及利用上述表面表达载体的靶蛋白的改性方法，上述载体包含DNA，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合。根据本发明，能够以稳定且高效的方式使高分子量的外源蛋白表达在细胞表面，从而有用地利用于蛋白质阵列、抗体制备、生物转化过程及外源蛋白的改性。
【专利说明】利用大肠杆菌YIAT蛋白质的靶蛋白的表面表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及靶蛋白的表面表达载体、将利用上述载体的靶蛋白表达在细胞表面的方法及利用上述表面表达载体的靶蛋白的改性方法，上述载体包含DNA，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合。
【背景技术】
[0002]细胞表面表达指， 使蛋白质或肽等与适当的表面锚定基序(ancho ring motif)相融合，并从原核细胞至真核细胞表达在各种细胞的表面的一种技术(Lee S.Y.etal.，Trends Biotechnol.,21:45，2003)。这种细胞表面表达的应用范围非常多样。例如，能够将特定蛋白质表达在细胞表面，从而简单执行肽或抗体、受体(receptor)等的筛选(Franc isco J.A.et al., Proc.Nat 1.Acad.Sc1.USA., 90:10444, 1993)，并能够使抗原表位(epitope)表达在细胞表面，从而生成能表示强有力的免疫反应的活疫苗(livevaccine)。并且，能够将精密化学、农药、医药等所需的特定酶表达在细胞表面，从而用作细胞生物催化剂，或者用于分解污染物质，或者表达能吸附金属离子的蛋白质，从而也用于生物修复(bioremediation) (Sousa C.et al., Nat.Biotechnol., 14:1017, 1996 ；Chen ff.andMulchandani A., Trends Biotechnol., 16:71，1998)。
[0003]要想通过细胞的复杂的内膜结构成功地表达在细胞表面，首先开发一种能够稳定且有效地将待表达在细胞表面的外源蛋白移动至细胞表面的表面锚定基序尤为重要。优选地，基序具有如下的理想的性质:(I)具有能通过细胞内膜的分泌信号序列(Signalsequence) ； (2)具有能稳定地附着于细胞外膜表面的祀序列(targeting sequence)或锚定基序(anchoring motif) ； (3)应在不阻碍细胞的生长的范围内大量表达在细胞表面,从而呈现高的蛋白质的活性；(4)应与蛋白质的大小无关地稳定表达，从而利用于各种领域。
[0004]细胞表面表达方法根据将插入于基序的外源蛋白的位置大致分为N-末端、C-末端或夹心(中央位置)形态。到目前为止使用于大肠杆菌的表面锚定基序有外膜蛋白(LamB> OmpA> OmpC> OmpS> Opr F、PhoE)、脂蛋白(lipoprotein ；Lpp)、自主转运蛋白(autotransporte r)、表面附属物(surface appendage)的亚基(subunit)、3层(S-laye r)蛋白质等。尤其，其中，外膜蛋白能够在三维结构中的向细胞外露出的结构部分展示外源蛋白，因而多用作表面锚定基序。
[0005]但是,大部分细胞表面表达系统具有表达在表面的蛋白质的大小相对受限的限制。据报告，大部分基序用于分子量相对小的肽、抗体、域(domain)、受体等的表达。这应使已插入的外源蛋白的C-末端和N-末端以立体方式位于接近的位置，因而在蛋白质大的情况下，蛋白质的稳定性变低。实际上，在LamB或PhoE的情况下，若插入由50至60种以上的氨基酸组成的外源蛋白，则在结构上受限，从而无法稳定地形成外膜蛋白，在使用大肠杆菌的孔蛋白(porin)的情况下,局限于表位或金属结合基序(metal bindingmotif)等而被使用，而不是局限于由最高150种的氨基酸组成的蛋白质(Stahl S.andUhlen Μ.，Tren ds Biοtechno1.15:185，1997 ；Kjaergaard K.et al.,App1.Environ.Microbiol.，66:10，2000)。
[0006]最近，正在开发一种能够将分子量相对大的外源蛋白表达在细胞表面的基序(Lee S.H., et al., Appl.Environ.Microbiol.70:5074, 2004 ；Lee S.H.et al., Biotechnol.Bioeng.90:223, 2005)。但存在表达在细胞表面的量少的缺点。因此，要想以稳定、高活性、高效的方式使分子量大的外源蛋白表达在细胞表面，开发一种新的细胞表面锚定基序是当务之急。
[0007]对此，本发明人为了使高分子量的外源蛋白以稳定且高效的方式表达在细胞表面而锐意研究，其结果，确认了使用如下设计的表面表达用载体的情况下，能够将高分子量的外源蛋白稳定且有效地表达在细胞表面，上述表面表达用载体将大肠杆菌的YiaT蛋白质的C-末端被去除的片段用作表面锚定基序，来使YiaT蛋白质的C-末端被去除的片段和靶蛋白相融合而表达，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于，提供找出能使高分子量的外源蛋白以稳定且高效的方式表达在细胞表面的表面锚定基序，并包含上述表面锚定基序的表面表达用载体。
[0009]本发明的再一目的在于，提供由上述表面表达用载体进行转化的细胞。
[0010]本发明的另一目的在于，提供将靶蛋白表达在细胞表面的方法，其特征在于，对上述细胞进行培养。 [0011]为了达到上述目的，本发明提供靶蛋白的表面表达载体，其包含DNA，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合。
[0012]本发明还提供由上述表面表达用载体进行转化的细胞。
[0013]本发明还提供将靶蛋白表达在细胞表面的方法，其特征在于，对上述转化的细胞进行培养。
[0014]本发明还提供将靶蛋白表达在细胞表面的方法，上述方法包括:步骤(a)，制备包含DNA的靶蛋白的表面表达载体，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合；步骤(b)，使上述表面表达载体转化在宿主细胞；以及步骤(C)，对转化的上述细胞进行培养，并将靶蛋白表达在细胞表面。
[0015]本发明还提供靶蛋白的改性方法，上述改性方法包括:步骤(a)，构建对靶蛋白进行编码的基因的突变体文库(mutant library);步骤(b),制备祀蛋白的基因突变体文库和包含对已去除C-末端的YiaT蛋白质进行编码的基因的基因重组体，使得上述靶蛋白的突变体以与已去除C-末端的YiaT蛋白质相融合的状态进行表达；步骤(C)，由上述基因重组体或包含上述基因重组体的载体来对宿主细胞进行转化；步骤(d)，对转化的上述宿主细胞进行培养，并将上述基因突变体文库表达在细胞表面；以及步骤(e)，对具有改性的形质的靶蛋白被表达的细胞进行筛选。
【专利附图】
【附图说明】[0016]图1表示确认YiaT蛋白质表达在细胞外膜的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacryIami de gelelectrophoresis)结果，T表不总蛋白(total protein), M表不外膜蛋白(outer membrane protein),箭头表不YiaT蛋白质。
[0017]图2为作为本发明的重组质粒重组载体的PTrcYR181、PTrcYR232、pTrcY、PTrcYR181PL,PTrcYR232PL,pTrcYPL,pTrcYR181PLFG,PTrcYR232PLFG 及 pTrcYPLFG 的遗传图谱。
[0018]图3为表示根据本发明表达在细胞表面的脂肪酶(lipase)是否具有活性的固体平板照片。
[0019]图4为表不根据本发明表达在细胞表面的脂肪酶的有无的蛋白质印迹(Westernblot)照片。
[0020]图5表示根据pH变化的表达在细胞表面的脂肪酶活性。
[0021]图6表示根据温度变化的表达在细胞表面的脂肪酶活性。
【具体实施方式】
[0022]只要不以其他方式定义，那么在本说明书中所使用的所有技术性术语及科学术语就具有与本发明所属【技术领域】的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，在本说明书中所使用的命名法为本领域中众所周知且通用的。
[0023]本发明涉及6?]?64(匪_201591、糖蛋白M6A、glycoprotein M6A)基因，以下对本发明进行详细说明。
[0024]在本发明中，“靶蛋白”作为本发明所属【技术领域】的普通技术人员想要生产的蛋白质，意味着向重组表达载体插入对上述蛋白质进行编码的多核苷酸(polynucleotide),并在转化体中可表达的所有蛋白质。
[0025]在本发明中，“融合蛋白”意味着原来的外源蛋白的序列的N-末端或C-末端与其他蛋白质相连接，或者追加其他氨基酸而由一个多肽(polypeptide)表达的蛋白质。
[0026]根据一观点，本发明涉及靶蛋白的表面表达载体，该表面表达载体包含DNA，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合。
[0027]到目前为止，没有大肠杆菌的YiaT蛋白质的细胞内的功能及细胞内位置相关的实验报告。在本发明中，在制作细胞表面表达系统之前，为了确认YiaT蛋白质在细胞内的准确的位置，从大肠杆菌W3110 (A TCC 39936)染色体克隆YiaT基因，在大肠杆菌XLl-Blue中进行超表达之后，分离细胞外膜蛋白质分馏，确认在上述细胞外膜蛋白质分馏中是否存在YiaT蛋白质，并确认了 YiaT蛋白质可用作表达在细胞表面的表面锚定基序。
[0028]在本发明的一实施例中，制备包含至YiaT蛋白质的整个氨基酸序列(序列号9)中的第232位氨基酸的YiaT蛋白质片段或包含至第181位氨基酸的表面锚定基序，并制备载体，使得上述表面锚定基序和作为祀蛋白的来源于突光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的脂肪酶能够分别表达成融合蛋白形态，并转化在大肠杆菌之后，确认了脂肪酶成功地实现表面表达。
[0029]术语“载体(vector) ”意味着包含以可操作的方式与能在适合的宿主内使DNA表达的适合的调控序列相连接的DNA序列的DNA制备物。载体可以为质粒、噬菌体粒子或简单的潜在基因组插入物。若转化成适当的宿主，则载体能够与宿主基因组无关地复制并起到作用，或者在一些情况下，能够与基因组其本身合并。质粒为当前载体的最通常所使用的形态，因而在本发明的说明书中，“质粒(plasmid)”及“载体(vector)”有时相互交换地被使用。但是，本发明包含本领域中已公知的或具有与已公知的等同的功能的载体的其他形态。
[0030]“表达调控序列(expression control sequence) ”意味着在特定的宿主生物中以可操作的方式连接的编码序列的表达所需的DNA序列。这种调控序列包含用于实施转录的启动子、用于调节这种转录的任意操纵子序列、对适合的mRNA核糖体结合位点进行编码的序列以及调节转录及解读的结束的序列。例如，适合于原核生物的调控序列包含启动子、任意的操纵子序列及核糖体结合位点。真核细胞包含启动子、多聚腺苷酸化信号(polyadenylation signal)及增强子。在质粒中，对基因的表达量最有影响的因素为启动子。作为高表达用的启动子，优选地使用SRa启动子和来源于巨细胞病毒(cytomegalovirus)的启动子等。
[0031]为了使本发明的DNA序列表达，能够将在非常多样的表达调控序列中的任意一个使用于载体。作为有用的表达调控序列的例，例如包含SV40或腺病毒的初期或后期启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3及T7启动子、λ噬菌体的主要操纵子及启动子区域、fd代码蛋白的调节区域、3-磷酸甘油酸激酶(3-Phosphoglycerate kinase)或其他甘醇分解酶相关启动子、上述磷酸酶的启动子、例如Pho5、酵母α -交配系统的启动子及原核细胞或真核细胞或用于调节它们的病毒的基因表达的结构和诱导的其他不同序列及它们的多个组合。T7RNA聚合酶启动子Φ10能够在Ε.coli中有用地用于使蛋白质NSP表达。
[0032]当核酸和其他核酸序列以功能性关系配置时，核酸“以可操作的方式连接(operably linked)”。这可以为当适当的分子(例如，转录活性化蛋白质)与(多个)调控序列相结合时，以能表达基因的方式连接的基因及(多个)调控序列。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前导(leader)序列相关DNA在作为参与多肽的分泌的前蛋白质(pro protein)被表达的情况下，以可操作的方式与多肽相关DNA相连接；启动子或增强子在对序列的转录产生影响的情况下，以可操作的方式与编码序列相连接；或者核糖体结合位点在对序列的转录产生影响的情况下，以可操作的方式与编码序列相连接；或者核糖体结合位点在以容易翻译的方式配置的情况下，以可操作的方式与编码序列相连接。通常，“以可操作的方式连接的”意味着连接的DNA序列相接触，并且，在分泌前导序列的情况下，相接触且存在于前导框内。但是，增强子(enhancer)无需相接触。在方便的限制性酶位点，借助连接(li gation)来执行这些序列的连接。在不存在这种位点的情况下，使用基于通常的方法的合成寡核苷酸衔接物(oligonucleotide adaptor)或接头(linker)。
[0033] 在本说明书中所使用的术语“表达载体”通常为插入有异种的D NA的片段的重组运载体(recombinant carrier),通常意味着双链的D NA的片段。其中，异种DNA意味着在宿主细胞中未被天然地发现的DNA即异源DNA。表达载体一旦位于宿主细胞内，就能够与宿主染色体DNA无关地进行复制，能够复制数个载体，并生成插入的(异种)DNA。
[0034]在本领域中，众所周知，要想在宿主细胞中提高转染基因的表达水平，就需要以可操作的方式将相关基因与在所选择的表达宿主内起到作用的转录及解读表达调控序列相连接。优选地，表达调控序列及相关基因包含在将细菌选择标记及复制起点(replicationorigin) 一同包含的一个表达载体内。在表达宿主为真核细胞的情况下，表达载体还需要包括在真核表达宿主内有用的表达标记。
[0035]在本发明中，上述已去除C-末端的YiaT蛋白质优选为第232位氨基酸以后的已去除C-末端的蛋白质或第181位氨基酸以后的已去除C-末端的蛋白质。
[0036]尤其，在本发明的一实施例中，在将YiaT蛋白质的整个序列用作表面锚定基序的情况下，如表1所示，因作为靶蛋白的脂肪酶而发生细胞分裂，或者与将已去除C-末端的YiaT蛋白质片段用作表面锚定基序时相比，表面表达的脂肪酶效率明显下降。
[0037]在本发明中，靶蛋白可以为本发明所属【技术领域】的普通技术人员所需的所有蛋白质，尤其为医疗、研究用及产业用蛋白质，例如，能够使选自包含激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白质或其一部分、抗体、抗原或其一部分、单链抗体、细胞受体、结合蛋白质、结合域、肽、附着蛋白质、结构蛋白质、调节蛋白质、毒素蛋白质、细胞因子、转录调节因子、凝血因子及植物生物防御衍生蛋白质的组中的具有生物学活性的各种外源蛋白表达成靶蛋白。
[0038]根据再一观点，本发明涉及由上述表面表达载体进行转化的细胞和将靶蛋白表达在细胞表面的方法，上述方法的特征在于，对转化的上述细胞进行培养。
[0039]根据另一观点，本发明涉及将靶蛋白表达在细胞表面的方法，上述方法包括:步骤(a)，制备包含DNA的靶蛋白的表面表达载体，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合；步骤(b)，使上述表面表达载体转化在宿主细胞；以及步骤(C)，对转化的上述细胞进行培养，并将靶蛋白表达在细胞表面。
[0040]在本发明中，开发了一种使大量的靶蛋白稳定地表达在细胞表面的系统，这能够利用于蛋白质阵列、抗体制备、生物转化过程及外源蛋白改性等各种生命工程领域。
[0041]根据还一观点，本发明涉及靶蛋白的改性方法，上述改性方法包括:步骤(a)，构建对靶蛋白进行编码的基因的突变体文库；步骤(b)，制备靶蛋白的基因突变体文库和包含对已去除C-末端的YiaT蛋白质进行编码的基因的基因重组体，使得上述靶蛋白的突变体以与已去除C-末端的YiaT蛋白质相融合的状态进行表达；步骤(C)，由上述基因重组体或包含上述基因重组体的载体来对宿主细胞进行转化；步骤(d)，对转化的上述宿主细胞进行培养，并将上述基因突变体文库表达在细胞表面；以及步骤(e)，对具有改性的形质的靶蛋白被表达的细胞进行筛选。
[0042]本发明的特征在于，上述宿主细胞可选自包含革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、放线菌、酵母菌的组，在上述筛选步骤中，能够利用靶蛋白的活性、识别标记在靶蛋白的物质的蛋白质、与靶蛋白相结合的被标记的配体或与靶蛋白特异性结合的抗体。
[0043]在本发明的靶蛋白的改性方法中，构建基因库的步骤能够利用D NA改组法(Stemmer, Nature, 370:389-91，1994)、StEP 法(Zhao, H., et al., Nat.Biotechnol., 16:258-61，1998)、RPR 法(Shao, Z., et al., Nucleic Acids Res.，26:681-3，1998)、分子育种法(Ness, J.E., et a l., Nat.Biotechnol.17:893-6，1999)、ITCHY 法(Lutz S., et al., Cur.0p1.Biotechnol., 11: 319-24, 2000) > 易错(error-prone) PCR(Cad well, R.C.，etal., PCR Methods App1., 2:28-33，1992)、点突变法(S ambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spri ng Harbor, N.Y., 1989)来使野生型革巴蛋白的基因发生变异而得到，但并不局限于此。
[0044]在本发明的靶蛋白的改性方法中，本发明的特征在于，在上述筛选步骤中，能够利用靶蛋白的活性、识别标记在靶蛋白的物质的蛋白质、与靶蛋白相结合的被标记的配体或与靶蛋白特异性结合的抗体。并且，在上述筛选步骤中，还可以利用流式细胞仪(Georgiou, G., Ad v Protein Chem.，55:293-315，2000)来实施，在利用蛋白质的活性的情况下，能够测定蛋白质被表达的宿主的生长，或者测定借助蛋白质来催化的显色反应并进行筛选。
[0045]在利用具有如上所述的特征的本发明的蛋白质的改性方法的情况下，能够从野生型酶迅速获得通过现有的方法无法容易获得的将没有在生物学上发生的化学反应进行催化的酶(如:狄尔斯-阿尔德(Die ls-Alder)缩合反应)、具有非自然的立体选择性或区域选择性(regios electivity)的酶、能够在有机溶剂或有机溶剂-水溶液以上的溶液中将反应进行催化的酶及在高温高压等极端条件下将反应进行催化的酶等。
[0046]实施例
[0047]以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不能被解释为受这些实施例的限制，这对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。即，以下步骤作为一个例示而被说明，本发明的范围并不局限于此。
[0048]实施例1:确认YiaT蛋白质在细胞内的位置
[0049]到目前为止，没有 YiaT蛋白质在细胞内的功能和细胞内位置的实验报告。因此，在制作细胞表面表达系统之前，为了确认YiaT蛋白质在细胞内的准确的位置，使YiaT蛋白质超表达，并分离总蛋白和外膜蛋白，从而用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳进行了分析。为了获得来源于大肠杆菌的yiaT基因，将大肠杆菌W3110(ATCC39936)染色体(chromosomal DNA)作为模板,并使用序列号I和序列号2的引物，执行了聚合酶链式反应(PCR, polymerase chain reaction)(第一次变性在95°C温度下进行5分钟,第二次变性在95°C温度下进行30秒钟，杂交在55°C温度下进行I分钟，延伸在72°C温度下进行I分30秒钟，如此反复30次)。
[0050]序列号1:5-ggaattcATGTTAATTAATCGCAATATTGTG[0051 ]序列号 2: 5-cccaagcttTTAAAAACGCCAGCTCACCCCG
[0052]在利用琼脂糖凝胶电泳法(agarose gel electrophoresis)来对上述聚合酶链式反应的产物进行电泳之后，从琼脂糖凝胶中分离大小约为741bp的DNA切片，并切割成限制性酶EcoRI和Hindlll。将如此获得的最终产物与以如下方式获得的DNA切片相连接，来获得重组质粒，上述DNA切片是将具有trc启动子的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.，Uppsala, Sweden)切割成与上述相同的作为限制性酶的EcoRI和H indIII来获得的，并且，在利用热休克(heat shock)方法来导入大肠杆菌XLl-Blue并进行转化之后，从添加有氨苄青霉素(50 μ g/L)的L B平板培养基中筛选，由此成功地获得了重组质粒pTrcYE。
[0053]将转化菌株XLl-Blue (pTrcYE)和作为对照组的XLl-Blue (pTr c99a)接种于添加有氨苄青霉素(50 μ g/L)的IOOmL的LB液体培养基并在37°C温度下进行培养，当培养液的吸光度在600nm波长下测定为0.4时，以浓度为ImM的方式添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG, Is opropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside)并诱导了 YiaT 蛋白质的表达。在表达诱导经过4小时之后，在4°C温度且6000rpm转速条件下将培养液离心分离5分钟，来获得了细胞，在用IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液清洗之后，用0.2mL的IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液重新悬浮。利用超声波法来破坏被悬浮的细胞之后，在室温条件下以1000Orpm的转速离心分离2分钟，从而去除未被破坏的细胞，并重新在18°C温度且1000Orpm的转速条件下将上清液离心分离30分钟，从而将颗粒(pell et)悬浮于0.5mL的0.5%十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)溶液。在4°C温度且12000rpm转速条件下,将该悬浮液离心分离30分钟,来获得颗粒之后，用0.5mL的IOmM Na2HPO4 (pH7.2)溶液来重新悬浮，并以相同的条件进行了离心分离。将颗粒悬浮于蒸馏水，来最终获得细胞的外膜蛋白，并在_20°C条件下保管。利用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳来将这些外膜蛋白和总蛋白按不同分子量大小进行分离，其结果，可知YiaT蛋白质(约27kDa)位于细胞外膜(图1)。
[0054]实施例2:重组载体pTrcYR232、pTrcYR181及pTrcY的制备
[0055]为了使细胞外膜蛋白表达，制备了三种形态的基序。去除大肠杆菌yiaT基因的C-末端，将大肠杆 菌W3110(ATCC39936)染色体(c hromosomal DNA)用作模板，使用序列号I和序列号3及序列号I和序列号4的引物，来执行聚合酶链式反应(第一次变性在95°C温度下进行5分钟，第二次变性在95°C温度下进行30秒钟，杂交在55°C温度下进行I分钟，延伸在72°C温度下进行I分30秒钟，如此反复30次)。并且，利用序列号I和序列号5的引物，来对仅去除终止信号序列(终止密码子(stop codon))的正常的整个yiaT基因执行了聚合酶链式反应。
[0056]序列号3: 5-gctctagaACGATCAATCATCGGGCTGTCGGT [Arg_232]
[0057]序列号4:5-gctctagaACGACGGGACTCACTCTCTGAAAT[Arg_181]
[0058]序列号5: 5-gctctagaAAAACGCCAGCTCACCCCG [f ul I gene]
[0059]用上述聚合酶链式反应的产物来执行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖切片中分别分离大小为约696bp、543bp、741bp的DNA切片，并切割成限制酶EcoRI和Xbal。将如此获得的最终产物与以如下方式获得的DNA切片相连接，来获得重组质粒，上述DNA切片是将具有trc启动子的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)切割成与上述相同的限制酶EcoRI和XbaI来获得的，并且,在利用热休克(he at shock)方法来导入大肠杆菌XLl-Blue并进行转化之后，从添加有氨苄青霉素(SOyg/L)的LB平板培养基中筛选，来去除C末端，插入有对YiaT蛋白质序列中的第232位Arg为止的片段进行编码的基因片段的重组质粒PTrcYR232及C末端被去除，从而成功地获得了插入有对YiaT蛋白质序列中的第181位Arg为止的片段进行编码的基因片段的重组质粒PTrcYR181及插入有对YiaT蛋白质整体进行编码的基因的重组质粒pTrcY(图2)。
[0060]实施例3:表达脂肪酶的重组载体 pTrcYR232PL、pTrCYR181PL、pTrcYPL、PTrcYR232PLFG、pTrCYR181PLFG 及 pTrcYPLFG 的制备
[0061]将来源于突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶表达在细胞表面的重组质粒的制备方法如下:将荧光假单胞菌(Ahn J.H.et al.，J.Bacteriol., 181:1847，1999)的染色体(chromosomal DNA)用作模板，并使用序列号6和序列号7及序列号6和序列号8的引物，来执行了聚合酶链式反应(第一次变性在95°C温度下进行5分钟，第二次变性在95°C温度下进行30秒钟，杂交在55°C温度下进行30秒钟，延伸在72°C温度下进行I分30秒钟，如此反复30次)。
[0062]序列号6:5-gctctagaATGCTTCATGCCTTCGAACGC
[0063]序列号7:5_cccaagctttcaactgatcagcacacc
[0064]序列号8:5_cccaagcttttacttgtcgtcatcgtccttgtagtcACTGATCAGCACACC
[0065]用上述聚合酶链式反应的产物来执行琼脂糖凝胶电泳，并从琼脂糖凝胶分别获得了大小为约1.4kb和1.5kb的DNA切片即脂肪酶基因和脂肪酶与FLAG尾相融合的形态的基因。这些基因切割成XbaI和H indlll，使在实施例2中制成的质粒插入于pTrcYR232、PTrcYR181 及 pT rcY，来分别制备了重组表达载体 pTrcYR232PL、pTrcYR181PL、pTrcYP L、PTrcYR232PLFG、pTrcYR181PLFG及pTrcYPLFG，并利用热休克方法来导入大肠杆菌XLl-Blue，从而进行了转化(图2)。转化的菌株是从添加有氨苄青霉素(50 μ g/L)的LB平板培养基中筛选的，将被筛选的菌株培养在LB液体培养基，并保管在_80°C温度的冰柜。并且，向其他宿主细胞 XLlO-Gold (Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)和 W3110 导入制成的重组表达载体 pTrcYR232PL、pTrcYR181PL、pTrc YPL、pTrCYR232PLFG、pTrCYR181PLFG 及 pTrcYPLFG并进行转化，从而最终筛选转化细胞来获得。
[0066]实施例4:测定表达在细胞表面的脂肪酶的活性
[0067]将在实施例3 中制成的转化菌株 XLl-Blue (pTrcYR232PL) ,XLl-Blue (pTrcYR181PL)、XLl-Blue (pTrcYPL)、XL I O-Go I d (pTr c YR232P L)、XL I O-Go I d (pTrc YR181PL)、XLlO-Gold (pTrcYPL)、W3110 (pT rcYR232PL)、W3110 (pTrcYR181PL) R W3110 (pTrcYPL)接种于添加有氨苄青霉素(50 μ g/L)的IOOmL的LB液体培养基，并在37 °C温度下进行了培养。当培养液的吸光度在600nm波长下测定为0.4时，以最终浓度为ImM的方式添加异丙基硫代半乳糖苷，并诱导了脂肪酶基因表达。在表达诱导经过4小时之后，回收培养液，并在4°C温度且6000rpm转速条件下离心分离5分钟，来获得细胞，在用磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate buffer saline)清洗细胞之后，对于脂肪酶的活性而言，将对硝基苯基癸酸酯(p-nitrophenyl decanoate)用作底物(substr ate),并用分光光度计来测定了生成物的显色程度(Lee SH, et al., B iotechnol.Bioeng.，90:223，2005)。以 1:4:95 的容积比率分别混合将IOmM对硝基苯基癸酸酯溶解于乙腈(acetonitrile)的溶液、乙醇、50mM三羟甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-HCl, Tris (hydroxymethyl) aminome thane-HCl (pH8.0),来制备了底物溶液。向脂肪酶被表达的细胞添加3mL的底物溶液，并在37°C温度下反应10分钟之后，添加 2 μ I 的 0.5m M 乙二胺四乙酸(EDAT, Ethylene Diamine Tetraacetic Acid),从而结束了反应。最终，对于脂肪酶活性而言，在405nm波长条件下测定吸光度并进行分析。其结果，XLlO-Gold(pTrcYPL)和W3110(pTrc YPL)在诱导脂肪酶表达之后，细胞生长受到阻碍，且因细胞裂解(c ell lysis)而无法再执行实验。并且可知，就XLl-Blue (pTrcYPL)而言，虽然在细胞生长方面没有问题，但表达在细胞表面的脂肪酶非常弱(表1)。
[0068]相反，将yiaT基因片段用作转化基序的转化菌株XLl-Blue (pTr c YR232PL)、XLl-Blue (pTrcYR181PL)、XLlO-Gold (pTrcYR232PL)、X LlO-Gold (pTrcYR181PL)、W3110 (pTrcYR232PL)及 W3110 (pTrcYR 181PL)与将整个 yiaT 基因用作基序(pTrcY)的情况相t匕，呈现非常高的脂肪酶活性。可知，在细胞表面表达菌株中，XLlO-Gold呈现为最好，在制成的基序中，YiaTR232最有效且稳定地使脂肪酶展示在细胞表面。
[0069] 并且，可知，在本发明中制成的系统与现有技术中报告的细胞表面表达系统所使用的由OprF及FadL的基序进行转化的菌株XLl-Blue (pTrcOprFPL)、XLl-Blue(pTrcFadLPL)、XLlO-Gold(pTrcOprFPL)、XLlO-Gold(pTrcFadLPL)、W3110 (pTrcOprFPL)及W3110 (pTrcFa dLPL)相比，非常有效地使脂肪酶表达。
[0070]表1
[0071]脂肪酶表达在表面的重组菌株的脂肪酶活性
[0072]
【权利要求】
1.一种祀蛋白的表面表达载体,其特征在于,包含DNA,上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合。
2.根据权利要求1所述的靶蛋白的表面表达载体，其特征在于，已去除C-末端的YiaT蛋白质为第232位氨基酸以后的C-末端被去除的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的靶蛋白的表面表达载体，其特征在于，已去除C-末端的YiaT蛋白质为第181位氨基酸以后的C-末端被去除的蛋白质。
4.一种细胞，其特征在于，由权利要求1至3中任一项所述的载体进行转化。
5.一种将靶蛋白表达在细胞表面的方法，其特征在于，对权利要求4所述的转化的细胞进行培养。
6.—种将革巴蛋白表达在细胞表面的方法,其特征在于,包括: 步骤(a)，制备包含DNA的靶蛋白的表面表达载体，上述DNA中的对已去除C-末端的作为表面锚定基序的YiaT蛋白质进行编码的基因和对靶蛋白进行编码的基因以表达成融合蛋白形态的方式相结合； 步骤(b)，使上述表面表达载体转化在宿主细胞；以及 步骤(c)，对转化的上述细胞进行培养，并将靶蛋白表达在细胞表面。
7.根据权利要求6所述的将靶蛋白表达在细胞表面的方法，其特征在于，已去除C-末端的YiaT蛋白质为第232位氨基酸以后的C-末端被去除的蛋白质。
8.根据权利要求6所述的将靶蛋白表达在细胞表面的方法，其特征在于，已去除C-末端的YiaT蛋白质为第181位氨基酸以后的C-末端被去除的蛋白质。
9.一种靶蛋白的改性方法，其特征在于，包括: 步骤(a)，构建对靶蛋白进行编码的基因的突变体文库； 步骤(b)，制备靶蛋白的基因突变体文库和包含对已去除C-末端的YiaT蛋白质进行编码的基因的基因重组体，使得上述靶蛋白的突变体以与已去除C-末端的YiaT蛋白质相融合的状态进行表达； 步骤(C)，由上述基因重组体或包含上述基因重组体的载体来对宿主细胞进行转化； 步骤(d)，对转化的上述宿主细胞进行培养，并将上述基因突变体文库表达在细胞表面；以及 步骤(e)，对具有改性的形质的靶蛋白被表达的细胞进行筛选。
10.根据权利要求9所述的靶蛋白的改性方法，其特征在于，在上述筛选步骤中，利用靶蛋白的活性、识别标记在靶蛋白的物质的蛋白质、与靶蛋白相结合的被标记的配体或与靶蛋白特异性结合的抗体。
【文档编号】G01N33/53GK104011212SQ201180075951
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2011年12月28日 优先权日:2011年12月27日
【发明者】韩美正 申请人:东洋大学产学协力团