专利名称：一种供hplc分析用林可霉素发酵液的前处理方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵液进行高效液相色谱法检测的前处理方法，尤其涉及一种供 HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法。
背景技术：
林可霉素属于林可霉素类抗生素，对大多数革兰氏阳性菌及某些厌氧的革兰氏阴性菌有效，对阳性菌的作用类似红霉素。主要用于厌氧菌引起的腹腔和妇科感染，也常用于敏感阳性菌所致的各种严重感染，因它浓集于骨组织，故为金葡骨髓炎的首选药，其在临床上应用较为广泛。林可霉素的组分包括林可霉素及其B组分，其中B组分为杂质组分，目前林可霉素发酵液单位的检测最常用的为生物检测或旋光法检测，均无法对林可霉素B组分进行检测。相对于生物检测或旋光法检测，高效液相色谱法(HPLC)具有快速、准确、林可霉素B组分的量能直观比较的优点，特别是在林可霉素菌种选育时摇瓶发酵液的检测上表现更为突出，有利于优选出林可霉素B组分低的菌种，其应用也日益广泛。在应用HPLC法检测发酵液单位中，发酵液前处理方法的优劣对检测结果的准确性、色谱柱的损伤程度以及检测效率影响较大，因而对发酵液前处理方法的改进与提高很有意义。现有技术中，林可霉素发酵液前处理技术(张朝正等，多元萃取体系分离发酵液中林可霉素的过程研究，中国科学院上海冶金研究所；材料物理与化学(专业)博士论文 2000年度)是发酵液经复合萃取剂、pH为10. 5、温度为常温、相比r (0/A)=0. 5条件下多元萃取，一级萃取收率可达到92%以上。此林可霉素发酵液前处理方法缺点在于过程复杂， 需进行多元萃取，萃取不完全，只能测定萃取相中林可霉素含量，从而影响测定的准确性， 效率比较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，旨在提高HPLC分析林可霉素发酵液单位及林可霉素B组分的准确性，提高液相色谱柱的分离效果和使用寿命。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的
一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，所述方法包括如下步骤
1)将林可霉素发酵液进行离心分离去除菌丝体与固体杂质得上清液；
2)将步骤I)所得上清液与乙醇按1:2 4体积比混合均匀，通过离心分离析出水溶性蛋白质后得到的清液即可作为样品用于高效液相色谱法(HPLC)分析林可霉素及B组分含量。为进一步除去微小的颗粒杂质，所述步骤2)中离心分离后得到的清液用孔径为 O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜(F膜)过滤。优选的，所述步骤2)中将步骤I)所得上清液与乙醇以1:4的体积比混合均匀，可以除去很大一部分不溶于乙醇水溶液的杂质,使离心液中含有的水溶性蛋白质变性析出，从而被离心除去，有利于提高色谱柱的使用寿命。所述步骤I)中离心分离的条件为4000 10000r/min下离心10 15分钟,步骤
2)中离心分离的条件为6000 12000r/min下离心10 20分钟。优选的，步骤2)中离心分离后得到的清液用孔径为O. 22 μ m偏氟膜(F膜)过滤。优选的，所述步骤I)中的离心时间为10分钟。优选的，所述步骤2)中的离心时间为15分钟。本发明中，所述的林可霉素发酵液是指任何产林可霉素的菌株在适当的条件下发酵产生出来的林可霉素发酵液。本发明的有益效果是通过本方法对林可霉素发酵液处理后，供HPLC分析的样品中的杂质大大降低，林可霉素与林可霉素B组分及相邻峰均能有效分离，连续进行数百个样品分析，未见柱压明显升高，色谱柱的理论塔板数符合检测要求，分析效果良好。
具体实施例方式实施例I :
取林可霉素生产发酵液，于4000r/min离心10分钟，去除菌丝体与固体杂质，吸取上清液，按体积比1:2加入乙醇，混合均匀，在6000r/min条件下离心20分钟；然后用O. 22 μ m偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同盐酸林可霉素，《中华人民共和国药典》(2010)二部第727页)，该HPLC色谱柱连续分析50个样品后，柱压为1298 1334psi， 林可霉素峰的理论塔板数为6800 7500 ;林可霉素与林可霉素B组分分离度大于14，与相邻的色谱峰分离度大于9，分析前后，柱压略有升高，HPLC的分析效果良好，主峰的理论塔板数没有明显变化。实施例2:
取林可霉素生产发酵液，于4000r/min离心15分钟，去除菌丝体与固体杂质，吸取上清液，按体积比1:3加入乙醇，混合均匀，在6000r/min条件下离心20分钟；然后用O. 22 μ m偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同盐酸林可霉素，《中华人民共和国药典》(2010)二部第727页)，该HPLC色谱柱连续分析50个样品后，柱压为1316 1343psi， 林可霉素峰的理论塔板数为6800 7500 ;林可霉素与林可霉素B组分分离度大于14，与相邻的色谱峰分离度大于9，分析前后，柱压没有明显变化，HPLC的分析效果良好，主峰的理论塔板数未下降。实施例3:
取林可霉素生产发酵液，于6000r/min离心15分钟，去除菌丝体与固体杂质，吸取上清液，按体积比1:4加入乙醇，混合均匀，在10000r/min条件下离心15分钟；然后用O. 22 μ m 偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同盐酸林可霉素，《中华人民共和国药典》(2010)二部第727页)，该HPLC色谱柱连续分析50个样品后，柱压为1320 1337psi， 林可霉素峰的理论塔板数为6800 7500 ;林可霉素与林可霉素B组分分离度大于15，与相邻的色谱峰分离度大于9，分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，主峰的理论塔板数未下降。实施例4:
取林可霉素菌种选育摇瓶发酵液，于8000r/min离心10分钟，去除菌丝体与固体杂质，吸取上清液，按体积比1:3加入乙醇，混合均匀，在80000r/min条件下离心17分钟；然后用O. 22 μ m偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同盐酸林可霉素《中华人民共和国药典》(2010) 二部第727页)，该HPLC色谱柱连续分析80个样品后，柱压为 1330 1361psi，林可霉素峰的理论塔板数为6800 7500 ;林可霉素与林可霉素B组分分离度大于14，与相邻的色谱峰分离度大于9，分析前后，柱压没有明显变化，HPLC的分析效果良好，主峰的理论塔板数未下降。实施例5:
取林可霉素菌种选育摇瓶发酵液，于lOOOOr/min离心10分钟，去除菌丝体与固体杂质，吸取一定量的上清液，按体积比1:4加入乙醇，混合均匀，在12000r/min条件下离心10 分钟；然后用O. 22 μ m偏氟膜过滤；过滤后的清液供HPLC检测(HPLC检测条件同盐酸林可霉素《中华人民共和国药典》(2010) 二部第727页)，该HPLC色谱柱连续分析120个样品后，柱压为1328 1357psi，林可霉素峰的理论塔板数为6800 7500 ;林可霉素与林可霉素B组分分离度大于15，与相邻的色谱峰分离度大于9，分析前后，柱压没有变化，HPLC的分析效果良好，主峰的理论塔板数未下降。上述实施例仅是本发明的较佳实施方式，详细说明了本发明的技术构思和实施要点，并非是对本发明的保护范围进行限制，凡根据本发明精神实质所作的任何简单修改及等效结构变换或修饰，均应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤.1)将林可霉素发酵液进行离心分离去除菌丝体与固体杂质得上清液；.2)将步骤I)所得上清液与乙醇按1:2 4体积比混合均匀，通过离心分离析出水溶性蛋白质后得到的清液即可供HPLC分析使用。
2.根据权利要求I所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中离心分离后得到的清液用孔径为O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜过滤。
3.根据权利要求I所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中将步骤I)所得上清液与乙醇按1:4的体积比混合均匀。
4.根据权利要求I或2所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述步骤I)中离心分离的条件为4000 10000r/min下离心10 15分钟,步骤2)中离心分离的条件为6000 12000r/min下离心10 20分钟。
5.根据权利要求2所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，步骤2)中离心分离后得到的清液用孔径为O. 22 μ m偏氟膜过滤。
6.根据权利要求4所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述步骤I)中的离心时间为10分钟。
7.根据权利要求4所述的一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，其特征在于，所述步骤2)中的离心时间为15分钟。
全文摘要
本发明公开一种供HPLC分析用林可霉素发酵液的前处理方法，该方法包括如下步骤1)将林可霉素发酵液离心分离得上清液；2)将上清液与乙醇以1:2～4体积比混合均匀，离心分离析出水溶性蛋白质后得到的清液即可用于HPLC分析。使用该方法预处理发酵液后，供HPLC分析的样品中的杂质大大降低，用于林可霉素发酵液检测，林可霉素组分及其B组分均与相邻杂质峰有效分离，分析效果好，林可霉素B组分能直观的用数据表现出来，分析准确率高，连续进行数百个样品分析，未见柱压明显升高，色谱柱理论塔板数能满足检测要求。
文档编号G01N30/06GK102590395SQ20121001053
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月14日 优先权日2012年1月14日
发明者刘瑞华, 姚健, 李为全, 营丽, 陈倩倩 申请人:安徽省皖北药业股份有限公司