专利名称：一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，该方法操作简单、高效、精确度高，可以弥补经典的衍生化GC-MS的无法检测挥发、半挥发次生代谢物的不足。
背景技术：
烟草作为重要的模式作物及经济作物，人们对其化学组成有了很多了解。但是，大多数研究仅限于对调制后烟叶的了解，而人们对于新鲜烟叶，包括不同生长周期、不同部位烟叶的化学组成了解仍旧十分有限。次生代谢物主要是指分子量在1000以下的小分子代谢物，与植物基体抗性、信号传导、生长发育、植物的花色、香气等现象相关。因此，了解不同时期、处于不同生长周期的烟叶的代谢物组成及含量本身具有重大意义，而且是开展基因组学、蛋白质组学、转录组学研究的化学平台。尽管近几年国内外已经开始开展关于烟叶次生代谢物的研究工作，但是数量有限，且大都基于调制后烟叶。目前，对于烟叶及其它模式植物此生代谢物的检测方法仍以衍生化GC-MS方法为主，这是由于其检测范围可涵盖大多数次生代谢物，且GC-MS方法可进行谱库检索，便于对次生代谢物进行定性分析。然而，衍生化GC-MS需要对提取液进行完全干燥，因此会导致挥发、半挥发次生代谢物完全损失，影响测试结果。鉴于衍生化GC-MS检测范围未能涵盖挥发、半挥发次生代谢物，建立一种测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的GC-MS检测方法是十分有必要的。而且，据调研目前并无相关报道。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术状况而提供一种简单、高效的检测新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，离心后，吸取上清液浓缩，浓缩后的样品溶液直接采用GC-MS 进行分析。具体步骤如下
(1)烟叶的采集、处理、干燥、粉碎快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20°c冰箱保存；(2)提取次生代谢物称量50-250mg的烟粉，加入内标溶液、6-8ml甲醇-氯仿萃取溶剂进行超声提取，提取液经高速离心后，取4-6ml上清液进行浓缩，浓缩液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后直接用GC-MS分析；
(3)检测采用GC-MS进行检测分析，色谱条件如下
色谱柱DB-35ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 载气，He;流速 1. Oml/min ；进样口温度290 °C ；进样量1 μ L ；分流比为5:1 ；升温程序 60°C保持％iin，然后以5°C /min的升温速度升到280°C，保持10 min, MS参数采用全扫描模式；采集质量数范围40-350。本发明中，在步骤(1)的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80°c低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。所述萃取溶剂为3 2或4 1的甲醇-氯仿溶液，加入量为6_8ml，萃取时间为 20-40min。内标溶液为配在萃取溶剂中的氘代尼古丁溶液，浓度为200yg/ml，加入量为 100 μ 1。步骤(2)中的浓缩方式采用旋蒸或真空离心浓缩。采用GC-MS进行检测分析时，所用色谱柱前接1. Om长的0. 25mm内径的空管毛细
管作为预柱，预柱需每周定期更换。本发明的突出优点是发展了适用于新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的提取方法。并且方法简单、有效且重现性好，可以弥补经典的衍生化GC-MS的无法检测挥发、半挥发次生代谢物的不足。
图1为本发明的测定步骤流程图。图2为本发明所得GC-MS全扫描色谱图。
具体实施例方式本发明以下结合实施例作进一步描述，但并不限制本发明。实施例1
采集实验室6片旺长期的新鲜烟叶(品种为红花大金元)，快速去除主干并用锡箔纸包裹，用液氮速冻。从液氮取出锡箔纸包，轻轻拍碎，立即用冷冻干燥机冷冻24h取出水分，并磨碎至40-60目。称取200mg烟粉于IOml离心管，加入100 μ 1氘代尼古丁内标溶液，5. 9ml 的甲醇-氯仿(3 2)溶液，超声提取30min，10000r/min下离心lOmin。吸取4. Oml上清液于5ml离心管中，35°C下用真空离心浓缩仪浓缩到1. Oml体积左右。浓缩后的样品溶液经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤后直接用GC-MS分析。色谱条件如下
色谱柱DB-35ms (30mX0. 25讓X0. 25 μ m)；载气，He ；流速1. Oml/min ；进样口温度240°C;进样量lyL ；分流比为5:1 ；升温程序60°C保持％iin，然后以5°C /min的升温速度升到280°C，保持10 min。MS参数采用全扫描模式；采集质量数范围40_350。所得GC-MS全扫描色谱图见图2。 实施例2
采集贵州遵义地区品种为NC297的3片成熟期烟叶，快速去除主干并用锡箔纸包裹，用液氮速冻。将锡箔纸包从液氮中取出，包埋在干冰中，航空快递至实验室，放于-80°C冰箱。 从冰箱中取出锡箔纸包，轻轻拍碎，立即用冷冻干燥机冷冻24h去除水分，磨碎至40-60目。 分别称取50mg、lOOmg、150mg、200mg、250mg烟粉于IOml离心管，加入100 μ 1氘代尼古丁内标溶液，5.9 ml的甲醇-氯仿(3 :2)溶液，超声提取30min，10000r/min下离心IOmin,取 4. Oml上清液于另5ml离心管，35 0C下用真空离心浓缩仪浓缩到1. Oml体积左右。浓缩后的样品溶液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后直接用GC-MS分析。色谱条件如实施例1.
选取代表性挥发、半挥发目标分析物，计算色谱峰面积，以“峰面积/内标面积”为y轴， 称取烟粉重量为χ轴进行线性拟合，拟合系数列于表1中。拟合系数均在0. 999之上，证明该方法对挥发、半挥发次生代谢物具有良好的定量特性。
权利要求
1.一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，离心后，吸取上清液低温下悬蒸或离心浓缩，浓缩后的样品溶液直接采用GC-MS进行分析。
2.根据权利要求1所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于具体步骤如下(1)烟叶的采集、处理、干燥、粉碎快速采摘烟株指定部位烟叶，用液氮迅速冷冻以终止生命过程，冷冻干燥24h以除去烟叶水分，干燥过的烟叶粉碎至40-60目，放于-20°C冰箱保存；(2)提取次生代谢物称量50-250mg的烟粉，加入内标溶液、6-8ml甲醇-氯仿萃取溶剂进行超声提取，提取液经高速离心后，取4-6ml上清液进行浓缩，浓缩液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后直接用GC-MS分析；(3)检测采用GC-MS进行检测分析，色谱条件如下色谱柱DB-35ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 载气，He ；流速 1. Oml/min ；进样口温度290 °C ；进样量1 μ L ；分流比为5 1 ；升温程序 60°C保持％iin，然后以5°C /min的升温速度升到280°C，保持10 min,MS参数采用全扫描模式；采集质量数范围40-350。
3.根据权利要求2所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于在步骤(1)的处理过程中要迅速去处烟叶主脉，用锡箔纸包裹叶片部分，标记后放入液氮中终止烟叶生命过程，并放于-80 0C低温冰箱冷冻保存，在烟叶从冰箱取出至冷冻干燥开始之前，必须用干冰包埋，进行转移。
4.根据权利要求2所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于萃取溶剂为3 2或4 1的甲醇-氯仿溶液，加入量为6-8ml，萃取时间为 20-40min。
5.根据权利要求2所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于内标溶液为配在萃取溶剂中的氘代尼古丁溶液，浓度为200 μ g/ml，加入量为 100 μ 1。
6.根据权利要求2所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于步骤(2)中的浓缩方式采用旋蒸或真空离心浓缩。
7.根据权利要求2所述的用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于采用GC-MS进行检测分析时，所用色谱柱前接1. Om长的0. 25mm内径的空管毛细管作为预柱。
全文摘要
一种用于测定新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的方法，其特征在于快速采集新鲜烟叶并用液氮现场进行速冻，采用冷冻干燥方法除去水分后对烟叶进行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶剂超声提取烟粉中次生代谢物，离心后，吸取上清液低温下悬蒸或离心浓缩，浓缩后的样品溶液直接采用GC-MS进行分析。本发明的突出优点是发展了适用于新鲜烟叶中挥发、半挥发次生代谢物的提取方法。并且方法简单、有效且重现性好，可以弥补经典的衍生化GC-MS的无法检测挥发、半挥发次生代谢物的不足。
文档编号G01N30/06GK102565233SQ20121001565
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者刘克建, 刘惠民, 夏巧玲, 张丽, 杨军, 王晓瑜, 秦亚琼, 谢复炜, 贾云祯 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院