专利名称：核酸分子在固态纳米孔中的减速方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸分子在固态纳米孔中的减速方法。
背景技术：
基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，除哈佛大学、波士顿大学、布朗大学、加州理工学院、荷兰代尔夫特工业大学等研究小组外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人类基因组测序-1000美元计划，以基于纳米孔器件的测序技术为实现方法，使纳米孔的研究由基础研究开始走向应用(D. Branton, et al. Nature Biotechnology26 (10), 1146(2008) ；M. Zwolak and M. Di Ventra, Reviews of Modern Physics 80(1), 141 (2008).)。纳米孔是指纳米薄膜上直径5-10纳米的介孔。在电解溶液中通过电泳驱动生物分子如DNA穿过纳米孔以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时， 高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA 测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基的差别识别。目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使 DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。美国 Boston College的Amit Meller等人通过改变Cis和Trans腔填充的溶液盐浓度,可以在 5nm的SiN纳米孔中，实现DNA分子毫秒量级的穿孔过程(M. ffanunu,ff. Morrison, Y. Rabin, A. Y. Grosberg and A. Meller, Nature Nanotechnology, 5,160, (2010))。但是他们对产生这种现象的机理解释不清楚，而且他们使用的纳米孔很小，DNA与纳米孔壁之间的相互作用可能会起作用，而这对实验的可控性大打折扣。而且直径很小的纳米孔在实验实现起来非常困难，成功率很低。美国哈佛大学的Mark等人通过快速改变电场方向的方法，可以使通过纳米孔的DNA分子再次被捕捉，重新返回并再次穿过纳米孔，实现部分的控制DNA在孔中和孔附近的运动(M. Gershow, J. A. Golovchenko, Nature Nanotechnology, 2, 775 (2007))。但是这种方法实验条件繁琐，成功率很低，可控性不好，很难实现真正意义上的实用价值。美国阿肯色大学的Jiali Li等通过在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔时间，但是实验条件要求非常苛刻，对实验技术要求很高Φ. Fologea, J. Uplinger,B. Thomas,D. S. McNabb, and J. L. Li, Nano Letters 5,1734(2005))。而且随着甘油的增加，导致溶液粘滞系数增加，DNA穿孔阻滞电流值幅度下降，这样测试的信噪比下降，导致测量误差增大。另外可以通过降低电压，使DNA穿孔速度减慢，但是电压降低导致电流信号降低，信噪比变差，导致测量非常困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。本发明所提供的降低核酸分子穿孔速度的方法，是基于现有的固态纳米孔测序法，包括下述步骤将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，所述待测的核酸分子置于所述电解池的负极腔室，测定时在正极和负极间施加电压； 其改进在于测定时同时引入一个压强外场作为电场的反向外场，从而实现核酸分子的穿孔减速。本发明中所述核酸分子包括双链或单链DNA、RNA以及肽核酸。所引入的压强外场产生的压强可为O. 5-2. 5个标准大气压。具体测定时，可根据所要达到的穿孔速度或穿孔时间以及电解液浓度和电压值， 在上述压强范围内经过有限次试验，确定所施加的最佳压强。测定时，所采用的电解液的浓度为O. 1-3. 2mol/L, pH值为8_10 ;所施加的电压为 100-250mV。所述电解液可为纳米孔测序法中所采用的电解液。通常采用氯化钾溶液作为 DNA测序时的电解液，其余比如NaCl，LiCl都是可以的。所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径可为10-20nm，孔深可为20_100nm。本发明的方法简单易行，在不降低测量信号信噪比的前提下，使用IOnm左右的 SiN固态纳米孔，有效降低DNA分子穿过纳米孔器件的速度，提高现有工作的时间分辨率， 为使用固态纳米孔器件进行DNA测序打下坚实的基础。本发明的再一个目的是基于上述减速方法提供一种纳米孔测序装置。该装置包括设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，其还包括一供气系统，所述供气系统与电解池的正极腔室通过导管相连。所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径为10-20nm，孔深为20-100nm。本发明的方法在外加电场驱动下，通过反向施加压强外场作用，可以使DNA分子在通过固态纳米孔时的速度有效降低，实现约50 80%的减速，从而大大提高了 DNA单分子探测技术的时间分辨率。该方法既可以保持高的电流信号信噪比，又可以避免引入由于使用很小的纳米孔(直径小于5nm)带来的DNA分子与纳米孔壁不可控的相互作用问题，并且实验简单易行，重复性和可控性都比现有技术有显著提高。另外，通过调节合适的电解液浓度，电压大小和压强大小，可以探测到长度低于Ikb的DNA短链分子的穿孔过程，这一技术显著解放了固态纳米孔对DNA分子探测的长度限制，可以探测到之前相同孔径纳米孔基本无法探测到的DNA长度。而短链DNA分子正是下一代基因测序需要攻克的方向之一。本发明相比与现有对基于固态纳米孔对DNA分子探测的报道，集中的优势体现在1、在不影响信噪比的前提下，反向压强的引入有效的减慢了 DNA分子在纳米孔中的运动速度，大大提高了现有报道的时间分辨率。而时间分辨率低的问题正是困扰固态纳米孔 DNA测序最大的障碍之一，常规的很多办法无法实现这一目的。
2、方法简单，易于操作。相比其他使DNA减速的文献报道，我们使用的方法非常简单，只需要购买一个压强显示计和一个气瓶，还有通过简单连接，即可实现对压强的引入。 这种方法可重复性好，非常利于推广，不需要复杂的电路设计和程序设计。不需要引入复杂的体系和制作工艺，对技术要求不高，实验成功率很高，大大提高了实验效率。3、使用该技术可以探测到长度更短的DNA，而不引入压强时，同样孔径的纳米孔很难探测到3kb以下的DNA。利用该技术，我们可以成功探测到3kb，lkb,甚至是600bp的DNA 短链分子的穿孔过程。这大大提高了固态纳米孔对DNA长度的探测范围，扩展了其应用范围，对于早日实现利用固态纳米孔对DNA进行单分子测序打下了很好的基础。
图I为本发明所用固态纳米孔的光刻掩模板的图形；其中，(a)为4英寸硅片设计的光刻掩模板图形，(b)对图Ia的局部放大图，白色圆孔区对应的是每个芯片中的圆形透光区域。(c)对Ib的进一步放大图,可以清楚看到对应于每个芯片中对应的圆形透光区域。(d)为方便从4英寸大硅片上解理单个小芯片，而特殊设计的划片线， 用白色虚线表示。图2为纳米孔器件芯片)制作流程示意图；(a)甩胶，曝光，显影，去胶， 出图形(b)反应离子束刻蚀刻透一面的氧化娃和氮化娃(C)去掉光刻胶(d)KOH溶液各向异性腐蚀掉硅，露出氧化硅和氮化硅悬空膜(e)用聚焦离子束在氧化硅刻出一个深度为 I. 5μπι的小窗格(f)RCA反应将剩余O. 5μπι氧化硅层去掉，只暴露出2μπιΧ2μπι小窗格大小，厚度为70nm的氮化硅悬空膜。图3(a)离子电流测量与反向压强加载示意图；(b)泳池和电极加载装置图；(C) 压强加载装置图；(d)压强显示计。图4为长度为IOkb的DNA的穿孔电流-穿孔时间分布图，其中，(a)不加压强，(b) 加载一个大气压反向压强。图5为长度为IOkb的DNA不加载压强时对应的DNA穿孔时间T0，与加载压强之后穿孔时间T比值与加载反向压强大小的关系图(蓝圈为实验数据点，蓝线，红线对应为I. 6M 盐浓度下模拟曲线)。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例、I)制备芯片器件本步骤的目的是制备可以放入透射电子显微镜中进行操作的固态纳米孔器件，从而实现利用透射电子显微镜中高能会聚电子束对器件悬空薄膜进行打孔操作，从而实现纳米孔器件。这其中包括了一系列传统半导体加工工艺中涉及的微纳加工工艺，并且还涉及了一系列现代前沿的纳米尺度加工技术。具体方法如下首先，将(100)面4英寸硅片，两面分别先后生长2微米的氧化硅，用低压化学气相沉积方法沉积150到200纳米左右的低应力氮化硅。然后制作光刻掩模版， 目的是要在4英寸的硅片上做成很多3mmX3mm的小基片周期分布(图Ia),每个3mmX3mm小基片图形中心有一个直径为584 μ m的圆形透光区域 (图lb，c)。为保证后期在4英寸硅片上分离每个3mmX3mm的小基片，保证分离划片时走刀的准确，又使得硅片不会破损成随机小片，在每个小基片图案边界加了一些透光的短划线透光条的宽度为5 μ m，长度为20μπι(图Id)。光刻掩模版的具体制作参数为制版尺寸5英寸；图形分布范围Φ100ι πι圆形分布；晶向条距离中心49mm,长50mm,宽O. 8mm。 然后利用光刻(图2a)和反应离子束刻蚀(图2b)将Si片一面的二氧化硅和氮化硅按照光刻掩模版的图形刻透，露出Si表面。随后去掉光刻胶(图2c)，使用KOH各向异性腐蚀， (40%K0H，80°C，6小时)腐蚀硅，腐蚀沿着(111)面进行。腐蚀穿的标准是小窗格透光后再过腐蚀一段时间。光学显微镜下氧化硅面很平整，没有岛状结构。这样就实现了一面只有二氧化娃和氮化娃的小窗格(20 80μηι)悬空膜,下面有娃衬底作支撑(图2d)。接下来，为了从4英寸的大硅片上分离3_X3mm小基片，需要进行划片操作。划片时需要在硅片背面贴上一层强力蓝胶做保护，因为在划片过后，撕开蓝胶时容易把悬空膜撕破，所以必须做好防护。办法是用高温热融蜡把待划硅片和另一保护硅片用高温热融蜡粘在一起。然后把蓝胶粘在保护硅片的背面，放进划片机进行划片，划片深度为200到250微米左右。划片过后，把蓝胶撕下。把热融蜡粘在一起的硅片放在热板上加热，蜡融化，把硅片分开。上面的蜡用丙酮冲洗干净即可。这一步可以保证顺利解理得到大量3mmX 3mm小基片。一般来讲，一张4英寸的娃片，可以解理得到800片3mmX3mm小基片。之后将3mmX3mm小基片放入热磷酸160°C加热减薄氮化娃膜厚度,减薄速率为I 5nm每分钟,减薄到70纳米或其它需要的厚度，厚度可以通过椭偏仪监控。之后为了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面积以减小电容噪声，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我们使用聚焦离子束(FIB，DB 235，FEI)刻蚀2微米氧化硅，离子束流300pA，大约刻蚀I分钟，可以在氮化硅下面形成一个I 2μηιΧ1 2μηιΧ1.5μηι的小窗格,I. 5 μ m是深度。目前我们得到了还剩余500nm 厚氧化硅，I 2μπιΧ1 2μπι的小窗格(图2e)。然后使用RCA反应，将剩余的500nm厚氧化娃腐蚀掉，只剩下I 2 μ mX I 2 μ m小窗格大小,厚度为70nm的氮化娃悬空膜(图 2f)。其中RCA反应为NH3 ·Η20 H2O2 = I I 5 (v/v)，70°C加热10分钟，去除硅片上的有机污染，也为了下一步BOE腐蚀时更好的浸润；BOE (HF NH4F : H2O = I : 2 : 3)腐蚀6分钟(腐蚀速率为100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干净得到悬空的氮化硅膜；HCl H2O2 H2O = I I 5(V/V/V)，，70°C，清洗 10 分钟，去除无机杂质。2)透射电子显微镜进行纳米孔制作芯片器件加工好之后,放入透射电子显微镜(FEI Tecnai F30)进行打孔操作，放大倍数调整到520k-890k，束斑大小为1，电子束聚到最小或稍大，5分钟左右，即可得到直径IOnm左右、深度为60nm的纳米孔。打孔前后，样品杆要放在等离子体清洗仪中 (O2 Ar = I 3, v/v)里清洗一分钟，去除有机污染。纳米孔器件制作好后，储存在真空干燥箱里备用。3)离子电流信号测量然后我们通过一系列浸润过程用PDMS垫片将芯片封装入由PEEK (聚醚醚酮树脂) 制成的电泳池中，泳池由Cis腔和Trans腔构成，两个腔之间只通过纳米孔进行连接，无其他连接通道。然后向两个腔中注入浓度为I. 6摩尔每升的氯化钾溶液。溶液中含有ImM的 EDTA和IOmM的Tris (pH = 8)。我们使用两个Ag/AgCl电极分别插入Cis腔和Trans腔中， 在纳米孔两端施加IOOmV电压，Cis腔接负极，Trans腔接正极(图3a)。首先在没有注入 DNA分子之前，我们使用的膜片钳放大器系统给出的是离子电流基准电流信号，大约几nA。 离子电流基准值与纳米孔的孔径大小，孔道深度和离子溶液浓度有关。在得到稳定的基准离子电流后，我们向Cis腔注入长度为IOkb的DNA分子溶液。由于DNA在溶液中带负电， 所以DNA在电场驱动下，由Cis腔向Trans腔运动。此时可以观测到单个DNA分子的穿孔事件，对应的是在基准电流基础上的电流突然下降和回复。这其中，有两个重要参数用来表征DNA分子的单次穿孔事件,穿孔电流和穿孔时间。对应IOkbDNA分子的穿孔电流为50 IOOpA,穿孔时间平均值为300us左右。4)反向压强加载与DNA在纳米孔中的减速在得到了正常的DNA分子穿孔信号后，在与电场方向相反的方向引入反向压强。 具体引入方法是在与Trans腔相连的导管上连接于气瓶相连的导管，使得气瓶产生的压强可以被引入到Trans腔中(图3b，c)。引入压强的示数通过气压计显示(图3d)。通过调节气瓶上的压强真空计，就可以调节被引入到Trans腔中的压强大小。当压强大小为I 个大气压时，DNA分子对应的穿孔时间被有效拉长为400us，速度被减慢了 33. 3% (图4a， b)。进一步加大压强至I. 5个大气压，穿孔时间为500us,穿孔时间延长66. 7% (图5)。该技术的一大优势在于压强的引入不改变电压值，那么离子电流信号没有减弱，保持了正常的测量信噪比，这是之前的报道所无法达到的。而之前的很多报道需要通过调节电压或者粘滞系数的方法，离子电流信号将被减弱，从而造成信噪比的降低。通过调节反向压强的大小，我们做到有效的将DNA分子的穿孔速度降低，在两个大气压的反向压强作用下，降速可以达到I倍以上。这种方法操作非常简单，原理清晰，不影响正常测量信噪比，有效延长DNA 穿孔时间，大大提升了利用固态纳米孔对DNA探测的时间分辨率。我们对DNA在压强作用下的穿孔过程进行了模拟计算，得到的曲线值与我们的实验数据点吻合的很好(图5)。因为在纳米孔中，反向压强的作用可以抵消掉一部分电场力驱动作用，使得原来在单一电场力驱动下的DNA分子运动速度减慢。5)不同长度的DNA分子减速我们不仅尝试了不同压强下，DNA分子的减速。我们还对不同长度的DNA分子进行了测试。对3kbDNA，在两个大气压情况下(溶液浓度I. 6M，电压IOOmV)，成功的将DNA穿孔时间由50us增加到lOOus，延长了一倍。对于lkbDNA，由于其长度较短，利用现有仪器时间分辨率，如果不加压强，将很难探测到DNA的穿孔信号，因为其穿孔时间已经短于仪器的最小分辨率。在施加两个大气压的情况下，IkbDNA的穿孔过程被成功探测，平均穿孔时间为 50us。这是我们技术的另一大优势所在，可以成功探测到长度更短的DNA分子，而这是现有报道对相同大小孔径的固态纳米孔很难做到的。
权利要求
1.一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括下述步骤将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，所述待测的核酸分子置于所述电解池的负极腔室，测定时在正极和负极间施加电压；其特征在于测定时，引入一个压强外场作为电场的反向外场。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述核酸分子为DNA、RNA或肽核酸。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所引入的压强外场产生的压强为0.5-2. 5个标准大气压。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述电解液的浓度为0.1-3. 2mol/L, pH 值为 8-10 ;所述电压为 100_250mv。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径为10-20nm，孔深为20_100nm。
6.一种纳米孔测序装置，包括设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，其特征在于所述纳米孔测序装置还包括一供气系统，所述供气系统与电解池的正极腔室通过导管相连。
7.根据权利要求6所述的纳米孔测序装置，其特征在于所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径为10-20nm，孔深为20_100nm。
全文摘要
本发明公开了一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法。该方法包括下述步骤将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括设有正极和负极的电解池、以及分隔所述电解池正极和负极的固态纳米孔薄膜，所述待测的核酸分子置于所述电解池的负极腔室，测定时在正极和负极间施加电压，同时引入一个压强外场作为电场的反向外场。该方法在外加电场驱动下，通过反向施加压强外场作用，可以使DNA分子在通过固态纳米孔时的速度有效降低，实现约50～80％的减速，从而大大提高了DNA单分子探测技术的时间分辨率。在固态纳米孔DNA分子测序器件方向有着非常光明的应用前景。
文档编号G01N27/403GK102590314SQ20121003985
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月20日 优先权日2012年2月20日
发明者俞大鹏, 赵清, 鲁铂 申请人:北京大学